Organización helicoidal de sangre Coagulación Factor VIII en lípidos nanotubos

Resumen

Se presenta una combinación de crio-microscopía electrónica, la nanotecnología de lípidos, y análisis de la estructura aplicada para resolver la estructura unida a la membrana de dos formas de FVIII altamente homólogas: humanos y porcinos. La metodología desarrollada en nuestro laboratorio para organizar helicoidalmente las dos formas de FVIII recombinantes funcionales en nanotubos de lípidos cargados negativamente (LNT) se describe.

Resumen

Crio-microscopía electrónica (Cryo-EM) ¹ es un enfoque poderoso para investigar la estructura funcional de las proteínas y complejos en un entorno de estado y de la membrana hidratada ^2.

Factor de coagulación VIII (FVIII) ³ es un multi-dominio de la glicoproteína del plasma sanguíneo. Defecto o deficiencia de FVIII es la causa para el tipo de hemofilia A - un trastorno hemorrágico grave. Tras la activación proteolítica, de FVIII se une a la serina proteasa Factor IXa en la membrana plaquetaria cargados negativamente, lo cual es crítico para la coagulación normal de la sangre ^4. A pesar del papel fundamental FVIII juega en la coagulación, la información estructural de su estado unida a la membrana es incompleta ^5. Concentrado de FVIII recombinante es el medicamento más eficaz contra la hemofilia tipo A y disponible comercialmente FVIII se puede expresar como ambos forman complejos funcionales con Factor humano IXa ^6,7 humana o porcina,. "> En este estudio se presenta una combinación de crio-microscopía electrónica (crio-ME), el análisis de lípidos y la nanotecnología estructura aplicarse para resolver la estructura unida a la membrana de dos formas de FVIII altamente homólogas:. Humano y porcino La metodología desarrollada en nuestro laboratorio para organizar helicoidalmente las dos formas de FVIII recombinantes funcionales en nanotubos de lípidos cargados negativamente (LNT) se describe. Los resultados representativos demuestran que nuestro método es suficientemente sensible para definir las diferencias en la organización helicoidal entre los dos altamente homóloga en secuencia (86% de identidad de secuencia ) proteínas. protocolos detallados para la organización helicoidal, Cryo-EM y tomografía electrónica ET adquisición de datos () se dan. Los dos dimensiones (2D) y tridimensional (3D) análisis de la estructura aplican para obtener las reconstrucciones en 3D de humano y porcino Se discute FVIII-LNT. Las estructuras humanas y porcinas presentados FVIII-LNT muestran el potencial de la metodología propuesta para Calculate la organización funcional, unido a la membrana del Factor VIII de coagulación sanguínea en alta resolución.

Introducción

Factor de coagulación sanguínea VIII (FVIII) es una glicoproteína grande de 2332 aminoácidos organizados en seis dominios: A1-A2-B-A3-C1-C2 ^3. Tras la activación de trombina de FVIII actúa como cofactor para el factor IXa en el complejo activador unido a la membrana. La unión de FVIII activado (FVIIIa) de FIXa de una manera membrana dependiendo mejora FIXa eficiencia proteolítica más de 10 ⁵ veces, que es crítico para la coagulación de la sangre eficiente ^4. A pesar de la importante función de FVIII juega en la coagulación y la formación del complejo tenasa, la estructura de FVIII unido a la membrana funcional todavía no se ha resuelto.

Para hacer frente a esto, los nanotubos única bicapa lipídica (LNT) ricos en fosfatidilserina (PS), capaces de unirse con alta afinidad de FVIII ^{8, 9} y se asemeja a la superficie de las plaquetas activadas se han desarrollado ^10. Organización helicoidal consecutiva de FVIII unido a LNT ha demostrado ser efective para la determinación estructural de estado unida a la membrana FVIII por Cryo-EM ^5. Funcionalizado LNT son un sistema ideal para estudiar la proteína-proteína y las interacciones proteína-membrana de proteínas asociadas a la membrana helicoidal organizados por Cryo-EM ^{11, 12.} Cryo-EM tiene la ventaja sobre los métodos estructurales tradicionales tales como la cristalografía de rayos X y RMN, como la muestra se conserva en más cercana a la ambiente fisiológico (tampón, membrana, pH), sin aditivos e isótopos. En el caso del FVIII, el estudio de la estructura unida a la membrana con esta técnica es aún más fisiológicamente relevantes, como la LNT se asemejan estrechamente por tamaño, forma y composición de los pseudópodos de las plaquetas activadas en donde los complejos de tenasa ensamblan in vivo.

Defectos y deficiencia de FVIII causa de la hemofilia A, un trastorno hemorrágico grave que afecta a 1 de cada 5.000 varones de la población humana ^{4, 6.} La mayoría de los eterapia ffective para la Hemofilia A es la administración de toda la vida de FVIII recombinante humano (hFVIII). Una complicación importante de la terapia de FVIII recombinante La hemofilia A es el desarrollo de anticuerpos inhibidores para la forma humana que afecta aproximadamente al 30% de los pacientes de la hemofilia A ^13. En este caso, se utiliza FVIII porcino (pFVIII) concentrado, como pantallas de FVIII porcino baja reactividad cruzada con anticuerpos inhibidores contra FVIII y forma complejos funcionales con FIXa humano ⁷ humana. El establecimiento de la organización unida a la membrana de ambos porcina y formas de FVIII humanos es importante entender las bases estructurales de la función y las repercusiones para la hemostasia sanguínea cofactor FVIII.

En este estudio, se describe una combinación de nanotecnología de lípidos, Cryo-EM, y análisis de la estructura diseñada para resolver la organización unido a la membrana de dos formas de FVIII altamente homólogas. Los datos de Cryo-EM presentados y estructuras 3D para porci helicoidal organizadoFVIII NE y humano cargado negativamente en LNT muestran el potencial de la nanotecnología propuesto como base para la determinación de la estructura de FVIII y factores y complejos en un entorno fisiológico de la coagulación de la membrana unidos a la membrana.

Protocolo

1. Preparación de la muestra

1. El cambio de tampón de FVIII humano de ^BDD-14 y porcino de FVIII ^BDD-15 contra el tampón HBS-Ca (HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, _CaCl2 5 mM, pH = 7,4) y se concentran a 1,2 mg / ml. Mantenga la solución de proteína a -80 ° C.
2. Preparar nanotubos de lípidos (LNT) mezclando galactosilceramida (GC) y fosfatidilserina (PS) en 01:04 w / w proporción en cloroformo. Evaporar el cloroformo en atmósfera de argón y solubilizar los lípidos en tampón HBS a 1 mg / ml. Mantenga la solución LNT a 4 ° C.

2. Cryo-Microscopía Electrónica de FVIII-LNT

1. Cryo-EM Preparación de la muestra
   1. Resplandor de descarga de la malla 300 Quantifoil R2 / 2 rejillas de cobre (laterales de carbono a) en una mezcla de O ₂ y H ₂ gas durante 10 segundos a 50 W.
   2. Mezclar las soluciones de FVIII y LNT en tampón HBS-Ca al 01:01 w / w proporción y se incuba durante 15 min a temperatura ambiente.
   3. Aplique una gota de 2,5 lde la muestra de FVIII-LNT a la red de microscopía electrónica hidrófilo en la cámara humidificada Vitrobot Mark IV (100% de humedad).
   4. Blot y flash congelar la red (una mancha de 3,5 seg, fuerza borraré 1) en el líquido C ₂ H _6, enfriados por N2 _líquido para obtener hielo amorfo.
   5. Rejillas tienda en cajas de almacenamiento bajo _N2 líquido (LN2).
2. Cryo-EM Data Collection
   NOTA: El JEM2100-LaB6 (año 2010) está equipada con un sistema operativo Temcon que consiste en un ordenador conectado a la microscopio electrónico, una pantalla con ventanas de lectura del sistema de vacío, sistema de iluminación, HT, corrientes de lentes y de modo-en, y dos paneles: izquierda y derecha, colocada en ambos lados de la columna. El cambio de barras en cruz, perillas Y (SHIFT Y, SIFT Y) y la multifunción (DEF / STIG) perillas están en ambos paneles. En el panel izquierdo es el botón de iluminación (brigthness). En el panel de la derecha se encuentran: la ampliación (MAG / CAM LONGITUD) y enfoque (FOCUS) perillas y los tres imaging (MAG1, MAG2, LOWMAG) y una difracción modos botones (DIF). Adquirimos nuestros datos en MAG1 en alfa 2. Las condiciones mínimas dosis de iluminación (MDS) necesarios para la adquisición de datos Cryo-EM se establecen con botones F1 a F6, fila superior del panel DERECHA. En este protocolo se utiliza la configuración genéricos: F1 - levantar / pantalla inferior, F2 - modo de búsqueda, F3 - modo de enfoque, F4 - Modo PHOTO, F5 - MDS OFF / ON y F6 - RAYO BLANCO, que sirve para proteger la muestra de la radiación dañar al desviar el haz.
   1. Coloque la crio-soporte en la crio-estación y llenar el Dewar del titular y la crio-estación con LN2. Cuando la temperatura llega a -192 ° C, obturador abierto en la punta titular, el lugar previamente congelado rejilla Cryo-EM en el lugar designado y seguro con una abrazadera de anillo.
   2. Inserte la crio-soporte en el microscopio electrónico. Vuelva a llenar el Dewar de la crio-soporte y la cámara contra el contaminador con LN2. Espere a que el titular se estabilice durante 30 a 60 min. Presione F6 yconvertir el filamento en. Cuando el filamento está saturado, pulse F6 obturador y abra el soporte para ver la cuadrícula.
   3. Pulse Bajo Mag / alfa 1 (puesta a 200X mag) y localizar zonas con hielo delgado en la parrilla.
   4. Cambiar al MAG 1/alfa 2 para establecer dosis mínima modo (MDS) y adquirir datos de Cryo-EM a dosis bajas de electrones, sin dañar la muestra.
      1. Presione F2 para configurar el modo de búsqueda. Set de ampliación a 40.000 x. Agrandar viga con perilla brigtness a dosis mínima de electrones ~ 0.04 e ^- / Å ² · s. Presione DIF para cambiar al modo de difracción. Ajuste la longitud de la cámara de 120 cm con mando MAG / CAM LONGITUD. Localiza las zonas de la cuadrícula dentro de las zonas de pre-seleccionados en LOWMAG que tienen nanotubos de lípidos en los agujeros de la película de carbono.
      2. Presione F4 para establecer el modo de fotos a 40.000 X de aumento y set de iluminación con botón BRILLO en dosis de 16 a 25 e ^- / A ² · s. Pulse el botón Estándar Focus para establecer las condiciones de enfoque ajustando la altura Zde la muestra con los botones ARRIBA / ABAJO (Z del panel de control a la derecha). Establecer desenfoque entre -1,5 y -2,5 m.
      3. Alinear búsqueda y el modo FOTO dibujando un cuadrado en la ventana de Vista en vivo en la pantalla de la cámara digital en modo de búsqueda correspondiente al área a explorar en el modo Foto.
      4. Presione F3 para configurar el modo de enfoque a 100.000 aumentos. Enfoque de iluminación para cubrir el chip CCD (~ 4 - 5 cm de radio) y fuera del eje para no irradiar el área a explorar en el modo de FOTO. Ajuste de desenfoque a ~ -1,5 y -2,5 m con el botón de enfoque y correcta para el astigmatismo de la imagen con perillas DEF / STIG.
   5. Seleccione el FVIII-LNT en ser fotografiado en modo BUSCAR mediante la adquisición de imágenes en directo en la ventana de Vista en vivo en la pantalla de la cámara digital. Centre el FVIII-LNT en el cuadrado dibujado en la ventana de vista en directo.
   6. Grabar una imagen digital de la cámara del CCD en 52.000 magnificación X eficaz y 0,5 segundos de exposición al cambiar a modo Foto y hacer clic en el AcquirBotón E en la micrografía pantalla de la cámara digital. Las condiciones de adquisición de imágenes se establecen como el blanco del haz (PERSIANAS) abierto sólo cuando la imagen se adquiere en el modo Foto.
   7. Compruebe la calidad y el desenfoque de la imagen adquirida pulsando CTRL-C para obtener una transformada rápida de Fourier (FFT).

3. Reconstrucción 3D

NOTA: El software de análisis de imagen que se utiliza para el análisis 2D y 3D: EMAN2 y IHRSR son de libre acceso. EMAN2 se puede descargar desde http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Install. El software IHRSR se puede obtener de Profesor Egelman: egelman@virginia.edu. Los refinamientos IHRSR finales se ejecutan en el de Texas Advanced Computing cluster central: http://www.tacc.utexas.edu/ en la Universidad de Texas, Austin. El algoritmo de reconstrucción 3D se muestra en la figura 1 consta de dos pasos principales: En primer lugar la selección de un conjunto homogéneo de segmentos helicoidales (partículas) con la referencia gratuita alignme 2DNT (RFA) algoritmos implementados en EMAN 2, segunda lograr una reconstrucción en 3D basado en los parámetros helicoidales y algoritmos de retroproyección incorporados en IHRSR. El primer paso utiliza los programas desarrollados para la selección de conjuntos de partículas homogéneas para la reconstrucción 3D con sola partícula SPA (algoritmos) para los que EMAN2 ha sido desarrollado y distribuido en concreto: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2. Este paso se ha adaptado a los datos de Cryo-EM. El segundo paso se consigue con el algoritmo IHRSR, que está diseñado específicamente para el tipo de los conjuntos helicoidales obtenidos con las formas de factor VIII recombinantes. Este algoritmo se ha documentado ampliamente a través de la literatura científica ^12.

1. Realizar el análisis de imágenes en 2D con la científica suite de procesamiento de imágenes EMAN2: http://blake.bcm.edu/eman2/doxygen_html ¹⁶ para seleccionar partículas homogénea (segmento helicoidal) juegos para la reconstrucción helicoidal.
   1. Seleccione micrografías Cryo-EM con straight y bien organizada tubos helicoidales con el software de la cámara digital y herramientas de visualización.
   2. Invertir, Normalizar y filtrar para los píxeles de rayos X en la GUI e2workflow.py, la reconstrucción de una sola partícula opción (spr): http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2projectmanager
   3. Importe las imágenes invertidas, normalizados y pixel de rayos X filtrada en la GUI e2helixboxer.py. Seleccione tubos helicoidales FVIII-LNT y segmento de 256 x 256 píxeles (2,9 Å / pix) con 90% de superposición usando: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2helixboxer
   4. Evaluar el desenfoque de las micrografías originales y aplicar la función de transferencia de contraste (CTF) corrección (sólo corrección de fase) a los segmentos helicoidales de los mismos micrografías con la opción e2ctf.py incorporado en el e2workflow.py: http://blake.bcm. edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2ctf.
   5. Generar partículas iniciales (segmentos helicoidales) establece en el GUI e2workflow.py opción - SPR: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2workflow.
   6. Calcular los promedios de clase en 2D con el algoritmo e2refine2d.py aplicar referencia libre de clasificación k-mean para seleccionar conjuntos de datos homogéneos con el mismo LNT diámetro y grado de orden helicoidal (Figura 2), siguiendo el guión: 'e2refine2d.py - iter = 8 - naliref = 5 - nbasisfp = 8 - path = r2d_001 - entrada = INPUT.hdf - NCLS = 51 - simcmp = dot - simalign = rotate_translate_flip - classaligncmp = dot - classraligncmp = fase - classiter = 2 - classkeep = 0,8 - classnormproc = normalize.edgemean - classaverager = media - normproj-classkeepsig ', cambiando el valor de este trastorno en consecuencia.
      1. Clasificar los datos iniciales establecidos en 'NCLS = 151' 150 clases de más de 8 repeticiones con 'classkeep = 0.8', lo que significa que las partículas con menos de 80% de similitud con el promedio de la clase están excluidas de la clase dada. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2refine2d
      2. Combinar las partículas de los promedios de la clasecon difracción helicoidal pronunciado en e2display.py para crear conjunto de datos intermedio.
      3. Clasificar las establecidas en 50 clases de 'NCLS = 51' para diferenciar las clases con el mismo diámetro y el grado de orden de los datos intermedios.
      4. Combinar las partículas de las clases con el mismo diámetro y grado de orden en e2display.py para crear el conjunto de datos finales para la reconstrucción en tres dimensiones: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/emselector.
2. Realizar la reconstrucción helicoidal con el algoritmo iterativo helicoidal real espacio Reconstrucción (IHRSR), como se describe en Egelman ^{17, 18.}
   1. Estimar la subida, Delta Z (A) de la hélice FVIII-LNT Del Fourier transformar combinado de las partículas en el conjunto de datos final.
   2. Definir el ángulo azimutal ΔΦ (º) mediante la ejecución de mejoras IHRSR paralelas con un Delta Z constante, aumentando ΔΦ de 576; a 60 ° en incrementos de 5 °.
   3. Correr 100 ciclos IHRSR consecutivos para el grupo con un cilindro sin rasgos como un volumen inicial y los parámetros helicoidales iniciales Delta Z y ΔΦ definidos en 3.2.1 cada dato de finales. y 3.2.2.
   4. Inspeccione los volúmenes finales de la convergencia de los parámetros helicoidales y la correspondencia entre los promedios de la clase de la clasificación 2D del conjunto final de datos y las proyecciones de la reconstrucción IHRSR final.
   5. Imponer la simetría de las reconstrucciones en 3D finales, correspondiente a la distribución unidad asimétrica observado en los últimos volúmenes 3D asimétricos: 4 veces para el FVIII humano-LNT y 5 veces para el FVIII porcino-LNT. Ejecute otros 100 ciclos de perfeccionamiento para generar una reconstrucción 3D symmetrized final.
   6. Calcula la curva de correlación Fourier Shell para ambos volúmenes separando primero los datos correspondientes establecidos en pares e impares: 'e2proc2d.py - split = 2 '. A continuación, ejecute 100 IHRSR refinamientos consecutivos como se describe en 3.2.3. Calcular la FSC de los volúmenes 3D creados a partir de los conjuntos de datos de pares e impares: 'e2proc3d.py evenvolume.mrc fsc.txt - calcfsc = oddmap.mrc'.
3. Visualizar y Segmento los volúmenes FVIII-LNT en UCSF quimera.
4. 1. Abra los volúmenes finales de la etapa 3.2.5. en UCSF Chimera y establecer el nivel de contorno a 0.005 en el Herramientas> DATOS VOLUMEN> opción Volume Viewer.
   2. En Herramientas> DATOS VOLUMEN> mapa de segmentos, seleccione el volumen en la pestaña de mapa de segmentos y hacer clic en un segmento a otro volumen.
   3. Segmentos del Grupo correspondiente a una celda unidad mediante la selección con CTRL + SHIFT y el grupo de clic.
   4. Colorea los segmentos por celda unidad y la hélice con ACCIONES> opción COLOR destacar las características estructurales.

4. Tomografía electrónica

1. Tinción negativa FVIII-LNT Preparación de la muestra
   1. Prepare muestras FVIII-LNT como para los experimentos de Cryo-EM.
   2. Las descargas luminiscentes rejilla de cobre recubierta de carbono de malla 300 (lado de carbono hacia arriba) en una mezcla de O ₂ y H ₂ de gas de 10 segundos a 50 W como para los experimentos de Cryo-EM.
   3. Aplicar una gota de 2,5 l de suspensión de FVIII-LNT con 6-nm nanopartículas de oro coloidal a la red, secar el exceso de líquido y manchar negativamente por la aplicación de 5 l solución de 1% de acetato de uranilo durante 2 min. Seque el exceso de líquido y secar la rejilla.
2. Tomografía electrónica de recopilación de datos
   1. Transfiera la red en el soporte de inclinación individual.
   2. Transferir el titular en el microscopio electrónico.
   3. Recoger serie de inclinación automáticamente con el software SerialEM ¹⁹ a los 2 ° incrementos sobre un rango angular de -60 ° a 60 ° y grabar las imágenes con una cámara CCD a 52.000 X magnificación efectiva, -6--10 desenfoque micras y la dosis de electrones de 150 - 170 elementosctrons / A ² · s por tomografía.
3. Tomografía electrónica Reconstrucción de FVIII-LNT
   Nota: Reconstruir la serie inclinada pFVIII-LNT y hFVIII-LNT adquirida en 4.2. con la opción Etomo del software IMOD siguiendo el tutorial: http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html
   1. El uso de una ventana de terminal, abra la tomografía en 3dmod. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html.
   2. Papelera de la tomografía por 4 con el IMOD BINVOL comando para disminuir el tamaño de la tomografía.
   3. Seleccionar el ángulo correcto para girar el nanotubo de lípidos a lo largo del eje Y en la tomografía binned usando el comando IMOD ROTATEVOL.
   4. Gire la tomografía completa con el comando IMOD ROTATEVOL.
   5. Recortar el nanotubo de lípidos seleccionada orientada a lo largo del eje Y con el comando RESIZE CLIP IMOD.
   6. Abra la sub-tomografía recortada con 3dmod.
   7. Haga clic en la tomografía de visualizar la disposición de las moléculas del factor VIII a lo largo delos cortes en el eje Z ya lo largo del eje Y en el volumen sub-tomografía.

Resultados

FVIII porcino recombinante humana y se organizaron con éxito helicoidalmente en carga negativa única LNT bicapa, parecida a la superficie de las plaquetas activadas. La organización helicoidal de la humano y porcino de FVIII-LNT fue consistente a través de las micrografías digitales recogidas (Figura 2). Fueron seleccionados La LNT control y lo humano y tubos helicoidales FVIII-LNT porcinos y segmentados con la GUI e2helixboxer.py y conjuntos de datos iniciales creados con la inter...

Discusión

En este trabajo se presenta una metodología para diferenciar entre dos organizaciones unidas a la membrana de proteínas altamente homólogas: FVIII humano y porcino auto-ensamblado en nanotubos de lípidos en las condiciones encontradas en el cuerpo humano.

En el procedimiento descrito, humana y FVIII porcino se organizan con éxito helicoidalmente en nanotubos de lípidos, que es el paso más crítico. El siguiente paso fundamental es preservar la muestra en hi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
JEM2100 with LaB6	JEOL Ltd.	JEM-2100	operated at 200 kV
with TEMCON software	JEOL Ltd.
Gatan626 Cryo-holder	Gatan, Inc.	626.DH	cooled to -175 °C
with temperature controler unit	Gatan, Inc.
Gatan 4K x 4K CCD camera	Gatan, Inc.	US4000	4096 x 4096 pixel at 15 microns/pixel physical resolution
Solarus Model 950 plasma cleaner	Gatan, Inc.
Vitrobot Mark IV	FEI
Materials
Carbon coated 300 mesh 3mm copper grid	Ted Pella	01821	plasma cleaned for 10 s on high power
Quantifoil R2/2 300 mesh	Electron Microscopy Sciences	Q225-CR2	Carbon coated 300 mesh Cu grids with 2 mm in diameters holes
Uranyl acetate dihydrate	Ted Pella	19481	1% solution, filtered
Galactosyl ceramide	Avanti Polar Lipids Inc.	860546
Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine	Avanti Polar Lipids Inc.	840035
Software
EM software Digital Micrograph	Gatan, Inc.		http://www.gatan.com/DM/
EM software EMAN	free download		http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/
EM software Spider	free download		http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
EM software IHRSR	free download		Programs available from Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/
EM software (IMOD)	free download		http://bio3d.colorado.edu/imod/
EM software (SerialEM)	free download		ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/
UCSF-Chimera	free download		http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html