Elicoidale Organization of Blood fattore VIII della coagulazione su Lipid nanotubi

Riepilogo

Vi presentiamo una combinazione di crio-microscopia elettronica, lipidi nanotecnologie, e analisi della struttura applicata per risolvere la struttura di membrana delle due forme di FVIII altamente omologhi: umane e suine. La metodologia sviluppata nel nostro laboratorio per organizzare elicoidale le due forme contenenti Fattore VIII ricombinante funzionali su nanotubi di lipidi carichi negativamente (LNT) è descritto.

Abstract

Crio-microscopia elettronica (Cryo-EM) ¹ è un approccio efficace per indagare la struttura funzionale di proteine ​​e complessi in uno stato e membrana idratata ambiente ^2.

Coagulazione Fattore VIII (FVIII) ³ è un multi-dominio plasma sanguigno glicoproteina. Difetto o carenza di FVIII è la causa di emofilia di tipo A - un disturbo grave emorragia. Dopo l'attivazione proteolitica, FVIII lega alla serina proteasi Factor IXa sulla membrana piastrinica carica negativa, che è fondamentale per la coagulazione ^4. Nonostante il ruolo fondamentale FVIII svolge nella coagulazione, informazioni strutturali per il suo stato di membrana è incompleta ^5. Ricombinante concentrato di FVIII è il farmaco più efficace contro il tipo emofilia A e commercialmente disponibile FVIII può essere espresso come umano o porcino, entrambi i complessi funzionali che formano con fattore IXa umano ^6,7. "> In questo studio presentiamo una combinazione di crio-microscopia elettronica (Cryo-EM), lipidi nanotecnologia e la struttura di analisi applicato per risolvere la struttura di membrana delle due forme di FVIII altamente omologhi:. Umana e suina La metodologia sviluppata nel nostro laboratorio organizzare elicoidalmente le due forme Fattore VIII ricombinante funzionali su nanotubi lipidi carichi negativamente (LNT) è descritto. I risultati rappresentativi dimostrano che il nostro approccio è sufficientemente sensibile per definire le differenze nell'organizzazione elicoidale tra i due altamente omologa in sequenza (86% di identità di sequenza proteine). protocolli dettagliati per l'organizzazione elicoidale, Cryo-EM e tomografia elettronica (ET) di acquisizione dati sono dati. L'bidimensionale (2D) e tridimensionali (3D) analisi della struttura applicate per ottenere le ricostruzioni 3D di umana e suina FVIII-LNT è discusso. Le strutture FVIII-LNT umane e suine presentati mostrano le potenzialità della metodologia proposta per Calculate il funzionale, organizzazione legata alla membrana della coagulazione del sangue Fattore VIII ad alta risoluzione.

Introduzione

Coagulazione del sangue Fattore VIII (FVIII) è un grande glicoproteina di 2332 aminoacidi organizzati in sei settori: A1-A2-B-A3-C1-C2 ^3. Su trombina attivazione FVIII agisce come cofattore di Fattore IXa all'interno del complesso tenasi legato alla membrana. Il legame di FVIII attivato (FVIIIa) per FIXa in maniera membrana seconda migliora FIXa efficienza proteolitica più di 10 ⁵ volte, che è fondamentale per un efficiente coagulazione del sangue ^4. Nonostante il ruolo importante FVIII svolge nella coagulazione e la formazione del complesso tenasi, la struttura FVIII legato alla membrana funzionale è ancora da risolvere.

Per risolvere questo problema, nanotubi doppio strato lipidico (LNT) ricche in fosfatidilserina (PS), in grado di legarsi con alta affinità FVIII ^{8, 9} e assomiglia alla superficie delle piastrine attivate sono state sviluppate ^10. Organizzazione elicoidale consecutivo di FVIII legato a LNT ha dimostrato di essere efficave per la determinazione della struttura di FVIII stato legato alla membrana da Cryo-EM ^5. Funzionalizzati LNT sono un sistema ideale per studiare proteina-proteina e proteina-membrana di proteine ​​di membrana associate ad elica organizzato da Cryo-EM ^{11, 12.} Cryo-EM ha il vantaggio rispetto ai metodi tradizionali strutturali come la cristallografia a raggi X e NMR, come il campione viene conservato in più vicino al ambiente fisiologico (buffer, membrana, pH), senza additivi e isotopi. Nel caso di FVIII, lo studio della struttura di membrana con questa tecnica è ancora più fisiologicamente rilevanti, come la LNT assomigliare per dimensione, forma e composizione pseudopodi delle piastrine attivate in cui i complessi tenasi assemblano in vivo.

Difetti e carenza di FVIII causa Emofilia A, un grave disturbo della coagulazione che colpisce 1 su 5.000 maschi della popolazione umana ^{4, 6.} La maggior parte delle eLa terapia stati efficaci per l'emofilia A è la somministrazione per tutta la vita di FVIII ricombinante umano (hFVIII). Una complicazione significativa della terapia ricombinante FVIII emofilia A è lo sviluppo di anticorpi inibitori per la forma umana che colpisce circa il 30% dei pazienti emofilia A ^13. In questo caso, viene utilizzato FVIII porcino (pFVIII) concentrato, come display FVIII suina bassa cross-reattività con anticorpi inibitori contro FVIII umano e forme complessi funzionali con FIXa umana ^7. Stabilire l'organizzazione di membrana sia suina e forme di FVIII umani è importante per capire le basi strutturali della funzione cofattore FVIII e implicazioni per emostasi del sangue.

In questo studio, descriviamo una combinazione di nanotecnologie lipidi, Cryo-EM, e analisi della struttura progettata per risolvere l'organizzazione di membrana delle due forme FVIII altamente omologhi. I dati presentati Cryo-EM e strutture 3D per Porci elicoidale organizzataFVIII ne ed umano carica negativa LNT mostra il potenziale del nanotecnologie proposto come base per la determinazione della struttura di FVIII e fattori e complessi in un ambiente membrana fisiologica coagulazione legata alla membrana.

Protocollo

1. Preparazione del campione

1. Scambio Buffer FVIII umano-BDD ¹⁴ e FVIII porcino-BDD ¹⁵ contro tampone HBS-Ca (HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, 5 mM CaCl _2, pH = 7,4) e si concentrano a 1,2 mg / ml. Mantenere la soluzione proteica a -80 ° C.
2. Preparare nanotubi di lipidi (LNT) mescolando galactosylceramide (GC) e la fosfatidilserina (PS) a 1:4 w / w rapporto in cloroformio. Si evapora il cloroformio sotto argon e solubilizzare i lipidi in tampone HBS a 1 mg / ml. Mantenere la soluzione LNT a 4 ° C.

2. Cryo-microscopia elettronica di FVIII-LNT

1. Cryo-EM Preparazione del campione
   1. Glow Discharge il 300 mesh Quantifoil R2 / 2 griglie di rame (lato carbonio up) in una miscela di O ₂ e H ₂ gas per 10 sec a 50 W.
   2. Mescolare le soluzioni FVIII e LNT in tampone HBS-Ca 1:1 w / w rapporto e incubare per 15 min a temperatura ambiente.
   3. Applicare una goccia di 2,5 pldi FVIII-LNT campione alla griglia microscopia elettronica idrofilo nel Vitrobot Mark IV camera umidificata (100% di umidità).
   4. Blot e flash congelare la griglia (una macchia per 3,5 sec, forza tamponare 1) in un liquido C ₂ H _6, raffreddato dal liquido N ₂ per ottenere il ghiaccio amorfo.
   5. Conservare griglie in scatole di stoccaggio sotto liquido N ₂ (LN2).
2. Raccolta dati Cryo-EM
   NOTA: Il JEM2100-LaB6 (2010) è dotato di un sistema operativo TEMCON costituito da un computer collegato al microscopio elettronico, uno schermo con finestre di lettura del sistema di aspirazione, sistema di illuminazione, HT, correnti lente e così via, e due pannelli: sinistra e destra, posizionato su entrambi i lati della colonna. Lo spostamento del fascio X, Y manopole (SHIFT Y, Y SIFT) e il multifunzione (DEF / STIG) manopole sono su entrambi i pannelli. Sul pannello di sinistra è la manopola di illuminazione (brigthness). Sul pannello di destra sono: l'ingrandimento (MAG / CAM LUNGHEZZA) e messa a fuoco (FOCUS) manopole e tre imaging (MAG1, MAG2, LOWMAG) ed una di diffrazione (DIFF) modalità pulsanti. Noi acquistiamo i nostri dati in MAG1 in alpha 2. Le condizioni minime dosi di illuminazione (MDS) necessari per l'acquisizione dati Cryo-EM sono impostati con i tasti da F1 a F6, riga in alto sul pannello di destra. In questo protocollo vengono utilizzate le impostazioni generiche: F1 - alzare / abbassare lo schermo, F2 - modalità SEARCH, F3 - Modalità FOCUS, F4 - modalità FOTO, F5 - MDS OFF / ON e F6 - BEAM BLANK, utilizzato per proteggere il campione dalla radiazione danneggiare deviando il fascio.
   1. Posizionare la crio-supporto nel crio-station e riempire il Dewar del titolare e la crio-stazione con LN2. Quando la temperatura raggiunge i -192 ° C, otturatore aperto sulla punta titolare, posto precedentemente congelato griglia di Cryo-EM nel luogo designato e fissarlo con una fascetta anello.
   2. Inserire il crio-supporto nel microscopio elettronico. Riempire il Dewar del crio-porta e la camera anti-contaminante con LN2. Attendere che il titolare si stabilizzi per 30-60 min. Premere F6 su eaccendere il filamento su. Quando il filamento è saturo, premere F6 spento e aperto di scatto sul supporto per visualizzare la griglia.
   3. Premere Basso Mag / alpha 1 (fissato a 200X MAG) e individuare le aree con ghiaccio sottile sulla griglia.
   4. Passare a MAG 1/alpha 2 per impostare dose minima modalità (MDS) e acquisire i dati Cryo-EM a basse dosi di elettroni, senza danneggiare il campione.
      1. Premere F2 per impostare la modalità di ricerca. Ingrandimento fissato a 40.000 x. Ingrandisci fascio con la manopola brigtness di minima dose di elettroni ~ 0,04 e ^- / Å ² · s. Premere DIFF per passare alla modalità di diffrazione. Impostare la lunghezza telecamera a 120 cm con manopola MAG / CAM LUNGHEZZA. Individuare aree sulla griglia nelle zone prescelte in LOWMAG che hanno nanotubi lipidi nei fori della pellicola di carbonio.
      2. Premere F4 per impostare la modalità Foto a 40.000 X di ingrandimento e set di illuminazione con la manopola luminosità a dosi di 16-25 e ^- / A ² · s. Premere il pulsante Standard Focus per impostare le condizioni di messa a fuoco regolando la Z-heightdel campione con i tasti Z UP / DOWN (pannello di controllo a destra). Impostare defocus tra -1,5 e -2,5 micron.
      3. Allineare ricerca e la modalità PHOTO disegnando un quadrato nella finestra di visualizzazione in diretta sul monitor della fotocamera digitale in modalità SEARCH corrispondente all'area da acquisire in modalità foto.
      4. Premere F3 per impostare la modalità di messa a fuoco a 100.000 X di ingrandimento. Concentrarsi illuminazione a coprire il chip CCD (~ 4-5 cm di raggio) e fuori asse per non irradiare la zona per essere ripreso in modalità foto. Regolare defocus a ~ -1.5 e -2.5 micron con la manopola FOCUS e corretto per l'astigmatismo dell'immagine con manopole DEF / STIG.
   5. Selezionare il FVIII-LNT per essere ripreso in modo di ricerca con l'acquisizione di immagini in diretta nella finestra di visualizzazione in diretta sul monitor della fotocamera digitale. Centrare il FVIII-LNT in piazza disegnata sulla finestra Live View.
   6. Registrare una immagine digitale sulla fotocamera CCD a 52.000 X efficace ingrandimento e 0,5 sec di esposizione passando alla modalità Foto e facendo clic sul nell'acquisireE Pulsante sul monitor della fotocamera digitale al microscopio. Le condizioni di acquisizione dell'immagine sono impostate come il bianco fascio (SERRANDE) aperto solo quando l'immagine viene acquisita in modalità foto.
   7. Controllare la qualità e la sfocatura dell'immagine acquisita premendo CTRL-F per ottenere un Fast Fourier Transform (FFT).

3. Ricostruzione 3D

NOTA: Il software di analisi dell'immagine utilizzata per l'analisi 2D e 3D: EMAN2 e IHRSR sono liberamente disponibili. EMAN2 può essere scaricato dal http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Install. Il software IHRSR può essere ottenuto dal Professor Egelman: egelman@virginia.edu. I filtri IHRSR finali vengono eseguiti sul Texas Advanced Computing centro cluster: http://www.tacc.utexas.edu/ presso l'Università del Texas, Austin. L'algoritmo di ricostruzione 3D mostrato in Figura 1 consiste di due fasi principali: in primo luogo la selezione di un insieme omogeneo di segmenti elicoidali (particelle) con il riferimento gratuito alignme 2Dnt (RFA) algoritmi implementati in EMAN 2, secondo conseguire una ricostruzione 3D basato sui parametri elicoidali e algoritmi retroproiezione incorporati in IHRSR. Il primo passo utilizza i programmi sviluppati per la selezione di insiemi di particelle omogenee per la ricostruzione 3D con SPA singola particella (algoritmi) per cui EMAN2 è stato specificamente sviluppato e distribuito: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2. Questo passo è stato adattato ai dati Cryo-EM. Il secondo passo si ottiene con l'algoritmo IHRSR, che è specificamente progettato per il tipo di assemblee elicoidale ottenuti con le forme del fattore VIII ricombinante. Questo algoritmo è stato ampiamente documentato nella letteratura scientifica ^12.

1. Eseguire l'analisi di immagini 2D con l'EMAN2 scientifico suite di elaborazione delle immagini: http://blake.bcm.edu/eman2/doxygen_html ¹⁶ per selezionare particella omogenea (segmento elicoidale) set per la ricostruzione elicoidale.
   1. Selezionare microscopio Cryo-EM con straight e ben organizzato tubi elicoidali con il software della fotocamera digitale e strumenti di visualizzazione.
   2. Inverti, normalizzare e filtrare per raggi X pixel nella GUI e2workflow.py, ricostruzione particella singola opzione (spr): http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2projectmanager
   3. Importare le immagini invertite, normalizzati e X-ray pixel filtrata nella GUI e2helixboxer.py. Selezionare tubi elicoidali FVIII-LNT e segmento a 256 x 256 pixel (2.9 Å / pix) con il 90% di sovrapposizione con: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2helixboxer
   4. Valutare il defocus dalle micrografie originali e applicare la funzione di trasferimento di contrasto (CTF) di correzione (solo correzione di fase) per i segmenti elicoidali dagli stessi micrografie con l'opzione e2ctf.py incorporata nel e2workflow.py: http://blake.bcm. edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2ctf.
   5. Genera particelle iniziali (segmenti elicoidali) imposta nella GUI e2workflow.py opzione - SPR: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2workflow.
   6. Calcolare le medie di classe 2D con l'algoritmo e2refine2d.py applicando riferimento franco classificazione k-medio per selezionare insiemi di dati omogenei con lo stesso diametro e LNT grado di ordine elicoidale (Figura 2), seguendo lo script: 'e2refine2d.py - iter = 8 - naliref = 5 - nbasisfp = 8 - path = r2d_001 - Ingresso = INPUT.hdf - NCL = 51 - simcmp = dot - simalign = rotate_translate_flip - classaligncmp = dot - classraligncmp = fase - classiter = 2 - classkeep = 0.8 - classnormproc = normalize.edgemean - classaverager = medio - normproj-classkeepsig ', cambiando il valore NCL conseguenza.
      1. Classificare i dati iniziali impostati in 'NCL = 151' 150 classi con oltre 8 iterazioni con 'classkeep = 0.8', il che significa che particelle con meno del 80% di somiglianza alla media della classe sono esclusi dalla classe data. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2refine2d
      2. Unisci particelle medie di classecon la diffrazione elicoidale pronunciata in e2display.py per creare set di dati intermedio.
      3. Classificare i dati intermedi fissati in 50 classi "NCL = 51 'per differenziare le classi con lo stesso diametro e grado di ordine.
      4. Unisci le particelle dalle classi con lo stesso diametro e grado di ordine in e2display.py per creare il set di dati definitivi per la ricostruzione tridimensionale: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/emselector.
2. Eseguire ricostruzione elicoidale con l'algoritmo iterativo elicoidale reale spazio ricostruzione (IHRSR), come descritto in Egelman ^{17, 18.}
   1. Stimare l'aumento, Az (Å) dell'elica FVIII-LNT dal combinato Fourier trasformata di particelle nel set di dati definitivi.
   2. Definire l'angolo azimutale ΔΦ (º) eseguendo i parametri IHRSR parallelo con una costante Az, aumentando ΔΦ da 576; a 60 ° in incrementi di 5 °.
   3. Eseguire 100 cicli IHRSR consecutivi per ogni finale set di dati con un cilindro informe come un volume iniziale ed i parametri elicoidali iniziali Az e ΔΦ come definito in 3.2.1. e 3.2.2.
   4. Controllare i volumi finali di convergenza dei parametri elicoidali e la corrispondenza tra le medie di classe dalla classificazione 2D del set di dati definitivi e le proiezioni della ricostruzione finale IHRSR.
   5. Imporre simmetria le ricostruzioni 3D finali, corrispondente alla distribuzione unità asimmetrica osservata nei volumi 3D asimmetrici finali: 4 volte per il FVIII umano-LNT e 5 volte per il FVIII porcino-LNT. Eseguire altri 100 cicli di perfezionamento per generare una ricostruzione 3D finale simmetrizzata.
   6. Calcolare la curva di correlazione Fourier Shell sia per volumi in primo luogo separando i corrispondenti dati impostati in pari e dispari: 'e2proc2d.py - split = 2 '. Quindi eseguire 100 IHRSR filtri consecutivi come descritto in 3.2.3. Calcolare il FSC dei volumi 3D creati dai set di dati pari e dispari: 'e2proc3d.py evenvolume.mrc fsc.txt - calcfsc = oddmap.mrc'.
3. Visualizza e segmento i volumi FVIII-LNT in UCSF chimera.
4. 1. Aprire i volumi finali dal punto 3.2.5. in UCSF Chimera e impostare il livello di contorno 0.005 nel TOOLS> DATI VOLUME> opzione Volume Viewer.
   2. In Strumenti> DATI VOLUME> SEGMENTO MAP, selezionare volume in SEGMENTO scheda MAP e fare clic sul segmento segmento del volume.
   3. I settori del Gruppo corrispondente ad una cella unitaria selezionando con CTRL + MAIUSC e facendo clic gruppo.
   4. Colora i segmenti da cellule dell'unità e helix con AZIONI> opzione COLOR a sottolineare le caratteristiche strutturali.

4. Electron Positron

1. Negativamente Stained Preparazione del campione FVIII-LNT
   1. Preparare i campioni FVIII-LNT come per gli esperimenti di Cryo-EM.
   2. Glow scarichi griglia di rame ricoperto con carbone 300 mesh (lato carbonio alto) in una miscela di O ₂ e H ₂ gas per 10 sec a 50 W da per esperimenti Cryo-EM.
   3. Applicare una goccia di 2,5 microlitri di sospensione FVIII-LNT con 6 nm nanoparticelle di oro colloidale alla griglia, asciugare il liquido in eccesso e macchiare negativamente applicando 5 ul di soluzione 1% acetato di uranile per 2 min. Asciugare il liquido in eccesso e asciugare la griglia.
2. Raccolta dati Electron Positron
   1. Trasferire la griglia nel supporto tilt singolo.
   2. Trasferire il supporto al microscopio elettronico.
   3. Raccogliere serie tilt automaticamente con il software SerialEM ¹⁹ a 2 ° incrementi su un range angolare di -60 ° a +60 ° e registrare le immagini con una telecamera CCD a 52.000 X di ingrandimento efficace, -6 a -10 micron sfocatura e la dose di elettroni di 150 - 170 electrons / A ² · s per tomogram.
3. Electron Positron Ricostruzione di FVIII-LNT
   Nota: Ricostruire la serie inclinata pFVIII-LNT e hFVIII-LNT acquisita in 4.2. con l'opzione ETomo del software MDI seguendo il tutorial: http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html
   1. Utilizzando una finestra di terminale, aprire il tomogramma in 3DMOD. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html.
   2. Bin tomogramma dal 4 con il IMOD BINVOL comando per ridurre le dimensioni del tomogramma.
   3. Selezionare la corretta angolazione per ruotare il nanotubo lipidico lungo l'asse Y nel tomogramma categorizzata utilizzando il comando IMOD ROTATEVOL.
   4. Ruotare la piena tomogramma con il comando IMOD ROTATEVOL.
   5. Ritagliare il nanotubo lipidico selezionato orientato lungo l'asse Y con il comando IMOD CLIP RIDIMENSIONAMENTO.
   6. Aprire il ritagliata sub-tomogram con 3DMOD.
   7. Clicca sul tomogramma per visualizzare la disposizione delle molecole di Fattore VIII lungole fette in Z e lungo l'asse Y nel volume sub-tomogram.

Risultati

FVIII suina umana ricombinante e sono stati organizzati con successo ad elica sul carico negativamente singolo LNT doppio strato, che assomiglia alla superficie delle piastrine attivate. L'organizzazione elicoidale del FVIII umano e suino-LNT era coerente attraverso le micrografie digitali raccolti (Figura 2). La LNT controllo e l'umano e tubi elicoidali FVIII-LNT suina sono stati selezionati e segmentati con la GUI e2helixboxer.py e insiemi di dati iniziali creati con la GUI e2...

Discussione

In questo lavoro viene presentato un metodo per distinguere tra due organizzazioni membrana di proteine ​​altamente omologhe: FVIII umano e suino auto-assemblati su nanotubi lipidi nelle condizioni che si verificano nel corpo umano.

Nella procedura descritta, FVIII umano e suino sono organizzati con successo elicoidalmente su nanotubi lipidi, che è la fase più critica. Il prossimo passo fondamentale è quello di preservare il campione in ghiaccio sottile amo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
JEM2100 with LaB6	JEOL Ltd.	JEM-2100	operated at 200 kV
with TEMCON software	JEOL Ltd.
Gatan626 Cryo-holder	Gatan, Inc.	626.DH	cooled to -175 °C
with temperature controler unit	Gatan, Inc.
Gatan 4K x 4K CCD camera	Gatan, Inc.	US4000	4096 x 4096 pixel at 15 microns/pixel physical resolution
Solarus Model 950 plasma cleaner	Gatan, Inc.
Vitrobot Mark IV	FEI
Materials
Carbon coated 300 mesh 3mm copper grid	Ted Pella	01821	plasma cleaned for 10 s on high power
Quantifoil R2/2 300 mesh	Electron Microscopy Sciences	Q225-CR2	Carbon coated 300 mesh Cu grids with 2 mm in diameters holes
Uranyl acetate dihydrate	Ted Pella	19481	1% solution, filtered
Galactosyl ceramide	Avanti Polar Lipids Inc.	860546
Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine	Avanti Polar Lipids Inc.	840035
Software
EM software Digital Micrograph	Gatan, Inc.		http://www.gatan.com/DM/
EM software EMAN	free download		http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/
EM software Spider	free download		http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
EM software IHRSR	free download		Programs available from Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/
EM software (IMOD)	free download		http://bio3d.colorado.edu/imod/
EM software (SerialEM)	free download		ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/
UCSF-Chimera	free download		http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html