Helicoidal Organização dos Fatores de Coagulação Sanguínea VIII em Lipid Nanotubos

Resumo

Nós apresentamos uma combinação de microscopia de Cryo-electron, nanotecnologia lipídica, e a análise da estrutura aplicada para resolver a estrutura ligada a membrana de duas formas de FVIII altamente homólogas: humana e porcina. A metodologia desenvolvida em nosso laboratório para organizar de forma helicoidal as duas formas FVIII recombinante funcionais em nanotubos de lipídios negativamente carregados (LNT) é descrito.

Resumo

A microscopia crio-electrão (Cryo-EM) é ^uma abordagem poderosa para investigar a estrutura funcional de proteínas e complexos em um ambiente de estado e da membrana hidratada ^2.

Factor de coagulação VIII (FVIII) ³ é um sistema multi-domínio de glicoproteína do plasma sanguíneo. Defeito ou deficiência de FVIII é a causa para o tipo de hemofilia A - um distúrbio de sangramento grave. Após a activação proteolítica, FVIII liga à serina-protease do Factor IX na membrana das plaquetas carregadas negativamente, que é crítica para a coagulação do sangue normal de ^4. Apesar de o papel central de FVIII desempenha na coagulação, a informação estrutural para o seu estado ligado à membrana é incompleta ^5. Concentrado de FVIII recombinante é o medicamento mais eficaz contra o tipo A hemofilia A e comercialmente disponível de FVIII pode ser expressa como o ser humano, ou de porcino, ambos os complexos funcionais que formam com o Factor IXa humano ^6,7. "> Neste estudo apresentamos uma combinação de microscopia Cryo-elétron (Cryo-EM), a nanotecnologia ea estrutura lipídica análise aplicada para resolver a estrutura ligada à membrana das duas formas de FVIII altamente homólogas:. Humana e suína A metodologia desenvolvida em nosso laboratório para organizar de forma helicoidal das duas formas de FVIII recombinante funcional em nanotubos de lípidos carregados negativamente (LNT) é descrita. Os resultados representativos demonstram que a nossa abordagem é suficientemente sensível para determinar as diferenças na organização helicoidal entre os dois altamente homóloga em sequência (86% de identidade de sequência ) proteínas. protocolos detalhados para a organização helicoidal, Cryo-EM e tomografia eletrônica (ET) de aquisição de dados são dadas. The bidimensional (2D) e tridimensionais (3D) análise da estrutura aplicada para obter as reconstruções 3D de humanos e suínos FVIII-LNT é discutido. As estruturas de FVIII-LNT humana e porcina apresentados demonstram o potencial da metodologia proposta para Calculate a organização funcional, ligada à membrana de coagulação sanguínea do Factor VIII em alta resolução.

Introdução

A coagulação sanguínea do Factor VIII (FVIII) é um grande glicoproteína de 2332 aminoácidos organizados em seis domínios: A1-A2-B-A3-C1-C2 ^3. Após a activação da trombina de FVIII actua como co-factor para o Factor IXa no complexo de tenase ligada à membrana. A ligação de FVIII activado (FVIIIa) em FIXa de um modo conforme a membrana melhora a eficiência proteolítica FIXa mais do que 10 ⁵ vezes, o que é crítico para a eficiência da coagulação sanguínea ^4. Apesar do papel importante do FVIII desempenha na coagulação e a formação do complexo tenase, a estrutura de FVIII ligado à membrana funcional ainda não foi resolvido.

Para resolver esta questão, nanotubos de bicamada lipídica (LNT) ricos em fosfatidilserina (PS), capazes de FVIII de ligação com elevada afinidade ^{8, 9,} e assemelhando-se a superfície de plaquetas activadas têm sido desenvolvidos ^10. Organização helicoidal consecutiva de FVIII obrigado a LNT foi provado ser efetividadeve para a determinação da estrutura do FVIII estado ligado à membrana por Cryo-EM ^5. Funcionalizado LNT são um sistema ideal para o estudo de proteínas de proteínas e interacções proteína-membrana de proteínas associadas à membrana de forma helicoidal organizadas por Cryo-EM ^{11, 12.} Cryo-EM tem a vantagem em relação aos métodos tradicionais estruturais, tais como cristalografia de raios-X e RMN, que o espécime é preservado em mais próximo do ambiente fisiológico (tampão, membrana, pH), sem aditivos e isótopos. No caso de FVIII, estudar a estrutura ligada a membrana com esta técnica é ainda mais relevante fisiologicamente, como o LNT assemelham pelo tamanho, forma e composição da pseudopodia das plaquetas activadas, onde os complexos TENase montar in vivo.

Defeitos e deficiência de FVIII causa hemofilia A, uma doença hemorrágica grave que afeta 1 em cada 5.000 homens da população humana ^{4, 6.} O mais eterapia ffective para hemofilia A é a administração do FVIII humano recombinante (hFVIII) ao longo da vida. Uma complicação importante da terapia de FVIII recombinante A hemofilia A é o desenvolvimento de anticorpos inibitórios para a forma humana que afecta aproximadamente 30% dos doentes com hemofilia A ^13. Neste caso, o FVIII porcino (pFVIII) concentrado é usado, como FVIII exibe suína baixa reactividade cruzada com os anticorpos inibidores contra FVIII humano e formas de complexos funcionais com FIXa humano ^7. Estabelecer a organização ligada à membrana de ambos suína e formas de FVIII humanos é importante para compreender a base estrutural da função co-fator FVIII e implicações para a hemostasia sangue.

Neste estudo, descrevemos uma combinação de nanotecnologia lipídico, Cryo-EM, e a análise da estrutura concebida para resolver a organização ligada à membrana de duas formas de FVIII altamente homólogas. Os dados Cryo-EM apresentados e estruturas 3D para porci helicoidal organizadone FVIII humano e em carregado negativamente LNT mostram o potencial da nanotecnologia proposto como base para a determinação da estrutura do FVIII e factores e complexos em um ambiente de membrana fisiológica coagulação ligadas à membrana.

Protocolo

1. Exemplo de Preparação

1. Humana troca de tampão de ^FVIII-14 e do BDD-FVIII porcino BDD ¹⁵ contra tampão HBS-Ca (20 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 5 mM de _CaCl2, pH = 7,4) e concentrado para 1,2 mg / ml. Manter a solução proteica à temperatura de -80 ° C.
2. Preparar os nanotubos de lípidos (LNT), misturando galactosilceramida (GC) e fosfatidilserina (PS) a 1:04 w / w proporção em clorofórmio. Evapora-se o clorofórmio sob atmosfera de árgon e solubilizar os lípidos em tampão HBS de 1 mg / ml. Manter a solução LNT a 4 ° C.

2. Cryo-Microscopia eletrônica de FVIII-LNT

1. Cryo-EM Preparação de Amostras
   1. Brilho de descarga a 300 mesh Quantifoil R2 / 2 grades de cobre (lado carbono up) em uma mistura de O ₂ e H ₂ gás por 10 seg a 50 W.
   2. Misturar as soluções de FVIII e LNT em tampão HBS-Ca em 1:1 w / w proporção e incubar durante 15 min à temperatura ambiente.
   3. Aplique uma gota de 2,5 mLde amostra de FVIII-LNT à grade microscopia electrónica hidrofílico na câmara humidificada Vitrobot Mark IV (100% de humidade).
   4. Blot e flash congelar a grade (uma mancha de 3,5 seg, força apagar 1) em líquido C ₂ H _6, arrefecido por N2 _líquido para obter gelo amorfo.
   5. Redes de lojas em caixas de armazenamento sob _N2 líquido (LN2).
2. Coleta de Dados Cryo-EM
   NOTA: O JEM2100-LaB6 (ano 2010) está equipado com um sistema operacional TEMCON consistindo de um computador conectado à microscópio eletrônico, uma tela com janelas de leitura do sistema de vácuo, sistema de iluminação, HT, as correntes de lente e assim por diante, e dois painéis: esquerda e direita, colocado em ambos os lados da coluna. A mudança feixe de X, Y botões (SHIFT Y, SIFT Y) eo multifuncionais (DEF / STIG) botões são em ambos os painéis. No painel da esquerda é o botão de iluminação (Brigthness). No painel direito são: a ampliação (MAG / CAM COMPRIMENTO) e foco (Foco) maçanetas e os três imaging (MAG1, MAG2, LOWMAG) e um de difração (DIFF) modos de botões. Nós adquirimos os nossos dados em MAG1 em alpha 2. As condições mínimas doses de iluminação (MDS) necessários para a aquisição de dados Cryo-EM são definidas com F1 através de botões F6, top de linha no painel da direita. Neste protocolo as definições genéricas são usados: F1 - levantar / tela inferior, F2 - modo de pesquisa, F3 - Modo FOCUS, F4 - Modo PHOTO, F5 - MDS OFF / ON e F6 - BEAM BRANCO, usado para proteger o espécime de radiação danificar, desviando o feixe.
   1. Coloque-titular crio o na estação crio e encher o Dewar do titular ea estação crio com LN2. Quando a temperatura atinge -192 ° C, obturador aberto na ponta titular, local previamente congelado grade Cryo-EM, para o lugar designado e prenda com um grampo de anel.
   2. Insira titular crio o no microscópio eletrônico. Encher o Dewar do titular crio o ea câmara anti-contaminador com LN2. Aguarde até que o titular se estabilize por 30-60 min. Pressione F6 e emtransformar o filamento em. Quando o filamento está saturado, pressione F6 e abra obturador no suporte para ver o grid.
   3. Imprensa Baixo Mag / alfa 1 (fixado em 200X mag) e localizar áreas com gelo fino na grade.
   4. Mudar para MAG 1/alpha 2 para definir o modo de dose mínima (MDS) e adquirir dados Cryo-EM em doses baixas de elétrons, sem danificar a amostra.
      1. Pressione F2 para definir o modo de pesquisa. Definir ampliação a 40.000 x. Aumentar feixe com botão brigtness a dose mínima de elétrons ~ 0,04 e ^- / a ² · s. Imprensa DIFF para alternar para o modo de difração. Defina o comprimento da câmara a 120 cm, com botão de MAG / CAM comprimento. Localizar áreas da grade dentro das áreas pré-seleccionadas em LOWMAG que têm nanotubos de lípidos nos orifícios do filme de carbono.
      2. Pressione F4 para definir o modo de foto em 40.000 ampliação X e definir iluminação com botão BRILHO em doses de 16-25 e ^- / a ² · s. Pressione o botão padrão Focus para definir as condições de foco ajustando o Z-alturada amostra com os Z Botões Cima / Baixo (painel de controle à direita). Definir desfocagem entre -1,5 e -2,5 m.
      3. Alinhe SEARCH e modo FOTO, desenhando um quadrado na janela VISTA AO VIVO no monitor da câmera digital no modo de pesquisa correspondente à área a ser trabalhada no modo de foto.
      4. Pressione F3 para definir o modo de foco em 100.000 ampliação X. Foco de iluminação para cobrir o chip CCD (~ 4-5 cm de raio) e fora do eixo para não irradiar a área a ser trabalhada no modo de foto. Ajuste de desfocagem para ~ -1,5 e -2,5 mM com o botão de foco e corrigir o astigmatismo da imagem com botões DEF / STIG.
   5. Selecione o FVIII-LNT a ser trabalhada no modo de Pesquisa por meio da aquisição de imagens ao vivo na janela de exibição ao vivo na tela da câmera digital. Centralize o FVIII-LNT no quadrado desenhado na janela de visualização em directo.
   6. Gravar uma imagem digital da câmera CCD de 52.000 X ampliação eficaz e 0,5 seg exposição mudando para o modo foto e clicando no AcquirBotão E na micrografia monitor da câmera digital. As condições de aquisição de imagem são definidas como o branco do feixe (SHUTTERS) aberto apenas quando a imagem é adquirida no modo de foto.
   7. Verifique a qualidade e desfocagem da imagem adquirida, pressionando CTRL-F para obter Transformada Rápida de Fourier (FFT).

3. Reconstrução 3D

NOTA: O software de análise de imagem utilizado para a análise 2D e 3D: EMAN2 e IHRSR estão disponíveis gratuitamente. EMAN2 pode ser baixado do http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Install. O software IHRSR pode ser obtido a partir de Prof Egelman: egelman@virginia.edu. Os refinamentos finais IHRSR são executados no Texas Advanced Computing agrupamento de centro: http://www.tacc.utexas.edu/ na Universidade do Texas, Austin. O algoritmo de reconstrução 3D mostrado na Figura 1 consiste em duas etapas principais: em primeiro lugar a seleção de um conjunto homogêneo de segmentos helicoidais (partículas) com a referência livre alignme 2Dnt (RFA) algoritmos implementados em EMAN 2, segunda alcançar uma reconstrução 3D com base nos parâmetros helicoidais e algoritmos de projeção de volta incorporadas IHRSR. O primeiro passo utiliza os programas desenvolvidos para a seleção de conjuntos de partículas homogêneas para a reconstrução 3D com partículas SPA Individual (algoritmos) para os quais EMAN2 foi especificamente desenvolvido e distribuído: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2. Este passo foi adaptada aos dados Cryo-EM. O segundo passo é conseguido com o algoritmo IHRSR, que é concebido especificamente para o tipo de conjuntos helicoidais obtidos com as formas de Factor VIII recombinante. Este algoritmo foi extensivamente documentada através da literatura científica ^12.

1. Realizar análise de imagem em 2D com a suíte de processamento de imagem EMAN2 científico: http://blake.bcm.edu/eman2/doxygen_html ¹⁶ para selecionar partícula homogênea (segmento helicoidal) conjuntos para a reconstrução helicoidal.
   1. Selecione micrografias Cryo-EM com straight e bem organizada tubos helicoidais com o software da câmera digital e ferramentas de visualização.
   2. Inverter, normalizar e filtrar por raios-X pixels na GUI e2workflow.py, reconstrução partícula única opção (SPR): http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2projectmanager
   3. Importe as imagens invertidas, normalizados e de pixel de raios-X filtrados na GUI e2helixboxer.py. Selecione tubos helicoidais FVIII-LNT e segmento em 256 x 256 pixels (2.9 Å / PIX), com 90% de sobreposição usando: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2helixboxer
   4. Avaliar a desfocagem das micrografias originais e aplicar a função de transferência de contraste (CTF) correção (apenas correção de fase) para os segmentos helicoidais dos mesmos micrografias com a opção e2ctf.py incorporado no e2workflow.py: http://blake.bcm. edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2ctf.
   5. Gerar partículas iniciais (segmentos helicoidais) define na GUI e2workflow.py opção - SPR: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2workflow.
   6. Calcular médias classe 2D com o algoritmo e2refine2d.py aplicação referência livre de classificação k-média para selecionar os conjuntos de dados homogêneos com o mesmo LNT diâmetro e grau de ordem helicoidal (Figura 2), seguindo o roteiro: "e2refine2d.py - iter = 8 - naliref = 5 - nbasisfp = 8 - path = r2d_001 - input = INPUT.hdf - LCN = 51 - simcmp = dot - simalign = rotate_translate_flip - classaligncmp = dot - classraligncmp = fase - classiter = 2 - classkeep = 0,8 - classnormproc = normalize.edgemean - classaverager = média - normproj-classkeepsig ', alterando o valor NCLs conformidade.
      1. Classifique as definidas no 'LCN = 151' 150 classes de mais de 8 iterações com 'classkeep = 0,8' dados iniciais, o que significa que as partículas com menos de 80% de similaridade com a média classe são excluídos da classe dada. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2refine2d
      2. Mesclar partículas a partir das médias de classecom difração helicoidal pronunciado em e2display.py para criar conjunto de dados intermediário.
      3. Classificar os dados intermediários estabelecidos em 50 classes 'LCN = 51' para diferenciar classes com mesmo diâmetro e grau de ordem.
      4. Mesclar partículas de classes com mesmo diâmetro e grau de ordem em e2display.py para criar o conjunto de dados final para a reconstrução tridimensional: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/emselector.
2. Executar a reconstrução helicoidal com o algoritmo iterativo helicoidal real espaço Reconstrução (IHRSR), como descrito no Egelman ^{17, 18.}
   1. Estime o aumento, Δz (A) da hélice FVIII-LNT do Fourier combinado transformar as partículas no conjunto de dados final.
   2. Defina o ângulo azimutal ΔΦ (º), executando refinamentos IHRSR paralelas com um Δz constante, aumentando ΔΦ de 576; a 60 ° em incrementos de 5 °.
   3. Executar 100 ciclos IHRSR consecutivos para cada conjunto com um cilindro inexpressivo como um volume inicial e os parâmetros iniciais Δz helicoidais e ΔΦ conforme definido no 3.2.1 dados finais. e 3.2.2.
   4. Inspecione os volumes finais para a convergência dos parâmetros helicoidais e correspondência entre as médias de classe da classificação 2D do conjunto final de dados e as projeções da reconstrução IHRSR final.
   5. Impor simetria para as reconstruções 3D finais, correspondente à unidade de distribuição assimétrica observada nos volumes 3D assimétricos finais: de 4 vezes para o FVIII humano-LNT e 5 vezes para a porcino FVIII-LNT. Correr mais 100 ciclos de refinamento para gerar uma reconstrução 3D simetrizada final.
   6. Calcule a curva de correlação Shell Fourier para ambos os volumes, primeiro separando os estabelecidos em pares e ímpares dados correspondentes: 'e2proc2d.py - split = 2 '. Em seguida, execute 100 IHRSR refinamentos consecutivos, tal como descrito no ponto 3.2.3. Calcule o FSC dos volumes 3D criadas a partir dos conjuntos de dados pares e ímpares: 'e2proc3d.py evenvolume.mrc fsc.txt - calcfsc = oddmap.mrc'.
3. Visualize e Segmento os volumes FVIII-LNT em UCSF quimera.
4. 1. Abra os volumes finais da etapa 3.2.5. em UCSF Chimera e definir o nível de contorno para 0.005 no TOOLS> VOLUME DE DADOS> opção VIEWER VOLUME.
   2. Em Ferramentas> VOLUME DE DADOS> mapa de segmento, selecione o volume no guia mapa de segmento e clique em cada segmento de mercado o volume.
   3. Segmentos do Grupo corresponde a uma célula unidade, selecionando com CTRL + SHIFT e clique grupo.
   4. Cor dos segmentos por célula unitária e hélice com Ações> opção de cor para enfatizar as características estruturais.

4. Electron Tomografia

1. Coradas negativamente FVIII-LNT Preparação de Amostras
   1. Preparar amostras de FVIII-LNT como para as experiências Cryo-EM.
   2. Fulgor descarrega grelha de cobre de malha 300-revestidas de carbono (do lado de carbono acima) numa mistura de O ₂ e gás _H2 durante 10 segundos a 50 W como para experiências Cryo-EM.
   3. Aplique uma gota de 2,5 mL de suspensão FVIII-LNT com 6 nm nanopartículas de ouro coloidal para a grade, seque o excesso de líquido e manchar negativamente pela aplicação de 5 mL solução 1% acetato de uranila por 2 min. Seque o excesso de líquido e secar a grade.
2. Coleta de Dados Electron Tomografia
   1. Transfira a grade no suporte de inclinação única.
   2. Transfira o titular no microscópio eletrônico.
   3. Colete série de inclinação automaticamente com o software SerialEM ¹⁹ ° em incrementos de 2 num intervalo angular de -60 ° a 60 ° e gravar imagens com uma câmera CCD de 52.000 X ampliação efetiva, -6 a -10 mM desfocagem e da dose de elétrons de 150 - 170 elementosctrons / a ² · s por tomografia.
3. Electron Tomografia Reconstrução do FVIII-LNT
   Nota: Reconstruir a série inclinado pFVIII-LNT e hFVIII-LNT adquirida em 4.2. com a opção ETomo do software IMOD seguindo o tutorial: http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html
   1. Usando uma janela de terminal, abra a tomografia em 3dmod. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html.
   2. Bin o tomograma por 4 com o IMOD BINVOL comando para diminuir o tamanho da tomografia.
   3. Selecione o ângulo adequado para rodar o nanotubo lipídico ao longo do eixo Y no tomografia finalmente resolvido usando o comando IMOD ROTATEVOL.
   4. Gire a tomografia completa com o comando IMOD ROTATEVOL.
   5. Cortar o nanotubo lipídico selecionado orientada ao longo do eixo Y com o comando IMOD CLIP redimensionar.
   6. Abra o sub-tomografia cropped com 3dmod.
   7. Clique sobre o tomograma para visualizar o arranjo de moléculas de factor VIII ao longoas fatias no eixo Z e ao longo do eixo Y no volume sub-tomografia.

Resultados

FVIII suína recombinante humana e foram organizadas com sucesso de modo helicoidal em carregada negativamente simples LNT bicamada, assemelhando-se à superfície das plaquetas activadas. Helicoidal A organização do humano e de porcino FVIII-LNT foi consistente ao longo das micrografias digitais recolhidas (Figura 2). A LNT controle eo humano e FVIII-LNT tubos helicoidais suínos foram selecionados e segmentado, com o GUI e2helixboxer.py e conjuntos de dados iniciais criados com a GU...

Discussão

Neste trabalho é apresentada uma metodologia para diferenciar entre duas entidades ligadas à membrana das proteínas altamente homólogas: FVIII humano e porcino auto-montada em nanotubos lipídicas nas condições encontradas no corpo humano.

No processo descrito, o FVIII humano e porcino são organizados com sucesso de modo helicoidal em nanotubos de lípidos, que é a etapa mais crítica. O próximo passo crítico é o de preservar a amostra em gelo amorfo fi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
JEM2100 with LaB6	JEOL Ltd.	JEM-2100	operated at 200 kV
with TEMCON software	JEOL Ltd.
Gatan626 Cryo-holder	Gatan, Inc.	626.DH	cooled to -175 °C
with temperature controler unit	Gatan, Inc.
Gatan 4K x 4K CCD camera	Gatan, Inc.	US4000	4096 x 4096 pixel at 15 microns/pixel physical resolution
Solarus Model 950 plasma cleaner	Gatan, Inc.
Vitrobot Mark IV	FEI
Materials
Carbon coated 300 mesh 3mm copper grid	Ted Pella	01821	plasma cleaned for 10 s on high power
Quantifoil R2/2 300 mesh	Electron Microscopy Sciences	Q225-CR2	Carbon coated 300 mesh Cu grids with 2 mm in diameters holes
Uranyl acetate dihydrate	Ted Pella	19481	1% solution, filtered
Galactosyl ceramide	Avanti Polar Lipids Inc.	860546
Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine	Avanti Polar Lipids Inc.	840035
Software
EM software Digital Micrograph	Gatan, Inc.		http://www.gatan.com/DM/
EM software EMAN	free download		http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/
EM software Spider	free download		http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
EM software IHRSR	free download		Programs available from Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/
EM software (IMOD)	free download		http://bio3d.colorado.edu/imod/
EM software (SerialEM)	free download		ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/
UCSF-Chimera	free download		http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html