Винтовая Организация свертывания крови фактора VIII на липидный нанотрубок

Резюме

Мы представляем сочетание крио-электронной микроскопии, липидов нанотехнологии и структурного анализа применяется для решения мембраносвязанное структуру двух весьма гомологичных FVIII формах: человека и свиньи. Методология, разработанная в нашей лаборатории, чтобы спирально организовать две функциональные рекомбинантные формы FVIII на отрицательно заряженных липидных нанотрубок (LNT) описывается.

Аннотация

Крио-электронной микроскопии (Крио-EM) ¹ является мощным подход исследовать функциональную структуру белков и комплексов в гидратной государственной и мембранной среды ^2.

Фактор свертывания крови VIII (фактора VIII) ³ многодоменный плазмы крови гликопротеин. Дефект или недостаток фактора VIII является причиной гемофилии типа А - тяжелое расстройство кровотечения. По протеолитической активации фактора VIII связывается с серинпротеазы Фактор IXa на отрицательно заряженной мембраны тромбоцитов, которая имеет решающее значение для нормального свертывания крови ^4. Несмотря на ключевую роль фактора VIII играет в коагуляции, структурная информация для его мембраносвязанного государства является неполной ^5. Рекомбинантный FVIII концентрат является наиболее эффективным средством против типа гемофилии А и коммерчески доступны FVIII может быть выражена как человека или свиньи, как при формировании функциональных комплексов с человеческим фактором IXa ^6,7. "> В этом исследовании мы представляем сочетание крио-электронной микроскопии (Крио-EM), липидов нанотехнологии и структурный анализ применяется для решения мембраносвязанное структуру двух весьма гомологичных форм фактора VIII:. Человеческий и свиной Методология, разработанная в нашей лаборатории на спирально организовать две функциональные рекомбинантные формы FVIII на отрицательно заряженных липидных нанотрубок (LNT) описывается. Представительные результаты показывают, что наш подход является достаточно чувствительным, чтобы определить различия в спиральной организации между ними высоко гомологичны в последовательности (идентичность последовательности 86% ) белки. Подробные протоколы для спиральной организации, Cryo-EM и электронной томографии (ET) сбора данных приведены. двумерной (2D) и трехмерной (3D) структурный анализ применяется для получения 3D-реконструкций человека и свиньи фактора VIII-LNT обсуждается. Представленные человека и свиньи структуры фактора VIII-LNT показать потенциал предлагаемой методологии для вычисэ функционал, связанный с мембраной организация свертывания крови фактора VIII с высоким разрешением.

Введение

Фактор свертывания крови VIII (FVIII) является большой гликопротеин 2332 аминокислот, организованных в шесть областей: A1-A2-B-A3-C1-C2 ^3. После активации тромбин FVIII действует как кофактор к фактору IXa в связанной с мембраной Тэнасе комплекса. Связывание активированного фактора VIII (FVIIIa) в FIXa в мембранный-зависимости образом повышает FIXa эффективность указанных протеолитических более 10 ⁵ раз, что имеет решающее значение для эффективного свертывания крови ^4. Несмотря на важную роль фактора VIII играет в коагуляции и образования комплекса Тэнасе, функциональная мембраносвязанный структура фактора VIII до сих пор не решен.

Для решения этой проблемы, одиночные липидного бислоя нанотрубки (LNT), богатые фосфатидилсерином (PS), способные связываться FVIII с высоким сродством ^{8, 9} и напоминающие поверхности активированных тромбоцитов были разработаны ^10. Последовательный винтовая организация фактора VIII обязаны LNT было доказано быть эффективнойве для структуры определения фактора VIII мембраносвязанного государства по Cryo-EM ^5. Функционализированный LNT являются идеальной системой для изучения белок-белковых и белок-мембрана взаимодействия спирально организованных мембранных белков, ассоциированных с Cryo-EM ^{11, 12.} Криогенная EM имеет преимущество по сравнению с традиционными структурных методов, таких как рентгеновской кристаллографии и ЯМР, как образец сохраняется в ближайший к физиологической среде (буфер, мембраны, Ph), без добавок и изотопов. В случае фактора VIII, изучая мембраносвязанное структуру с этой техникой еще более физиологически значимым, так как LNT сильно напоминают по размеру, форме и составу псевдоподий из активированных тромбоцитов, где Тэнасе комплексы собирают в естественных условиях.

Дефекты и дефицит фактора VIII причины гемофилии А, тяжелым расстройством кровотечения, влияющих 1 в 5000 самцов человеческой популяции ^{4, 6.} Наиболее еffective терапия для гемофилии А является пожизненное администрация рекомбинантного человеческого фактора VIII (hFVIII). Значительное осложнение рекомбинантного фактора VIII Гемофилия А терапии является развитие ингибирующих антител к человеческой форме, влияющих около 30% больных гемофилией А ^13. В этом случае свиной FVIII (pFVIII) концентрат используется, как свиньи FVIII отображает низкой перекрестной реактивностью с ингибирующих антител против человеческого фактора VIII и форм функциональные комплексы с человеческим FIXa ^7. Установление мембраносвязанное организацию как свиньи и форм человеческих FVIII важно понимать структурную основу функции кофактора фактора VIII и последствия для гемостаза крови.

В этом исследовании мы описываем сочетание липидов нанотехнологии, Cryo-EM и структурного анализа разработан, чтобы решить мембраносвязанное организацию двух весьма гомологичных форм фактора VIII. Представленные данные Крио-EM и 3D структуры для спирально организованной Porciпе и человеческого фактора VIII на отрицательно заряженной LNT показать потенциал предлагаемой нанотехнологии как основы для структуры определения фактора VIII и связанных с мембраной факторов и комплексов в физиологической среде мембраны коагуляции.

протокол

1. Подготовка образца

1. Буфер обмена человеческого фактора VIII-BDD ¹⁴ и свиной FVIII-BDD ¹⁵ против HBS-Ca буфера (20 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl _2, рН = 7,4) и концентрируют до 1,2 мг / мл. Держите белкового раствора при температуре -80 ° С.
2. Подготовка липидов нанотрубок (LNT) путем смешивания GalactosylCeramide (GC) и фосфатидилсерин (PS) в 1:04 в / в соотношении в хлороформом. Упаривают хлороформ в атмосфере аргона и солюбилизации липидов в HBS буфере до 1 мг / мл. Держите LNT решение при 4 ° С.

2. Крио-электронной микроскопии фактора VIII-LNT

1. Крио-ЭМ Подготовка образцов
   1. Тлеющий разряд 300 сетка Quantifoil R2 / 2 медных сетей (побочные углерода до) в смеси O ₂ и H ₂ газа в течение 10 сек при 50 W.
   2. Смешайте растворы FVIII и LNT в HBS-буфере Ca в 1:01 вес / вес отношение и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре.
   3. Нанесите каплю 2,5 мклиз фактора VIII-LNT образца с гидрофильным электронной микроскопии сетки в Vitrobot Mark IV влажной камере (100% влажности).
   4. Клякса и флэш заморозить сетку (один пятно в течение 3,5 сек, промокните силу 1) в жидком C ₂ H _6, охлаждается жидким N _2, чтобы получить аморфный лед.
   5. Храните сетки в ящики для хранения в жидком N ₂ (LN2).
2. Крио-ЭМ сбора данных
   ПРИМЕЧАНИЕ: JEM2100-LaB6 (2010 год) оснащен операционной системой TEMCON, состоящей из компьютера, подключенного к электронным микроскопом, экраном с окнами чтения вакуумную систему, систему освещения, HT, объектив токи и так на и два панели: с обеих сторон, размещены по обе стороны колонны. Сдвиг луч X, Y ручки (SHIFT Y, SIFT Y) и многофункциональные (DEF / STIG) ручки находятся на обеих панелях. На левой панели находится регулятор освещения (BRIGTHNESS). На правой панели расположены: увеличение (МАГ / CAM длина) и фокусировки (Фокус) ручки и три Imaginг (MAG1, MAG2, LOWMAG) и дифракционной (DIFF) кнопки режимов. Мы приобретаем наши данные в MAG1 на альфа-2. Минимальная доза условия освещения (MDS), необходимые для сбора данных Крио-EM устанавливаются с F1 до F6 кнопок, верхнем ряду на правой панели. В этом протоколе используются общие настройки: F1 - поднять / опустить экран, F2 - режим поиска, F3 - режим фокусировки, F4 - Режим ФОТО, F5 - MDS OFF / ON и F6 - ЛУЧ ПУСТО, используются для защиты образца от радиации повредить, отклоняя луч.
   1. Поместите Крио-держатель в крио-станции и наполнять сосуд Дьюара держателя и крио-станции с LN2. Когда температура достигает -192 ° C, открытый затвор на кончике держателя, место ранее заморожены Крио-EM сетки в отведенном для этого месте и закрепите с кольцевой зажим.
   2. Вставьте крио-держатель в электронном микроскопе. Заполните Дьюара в крио-держателем и анти-загрязнитель камеры с LN2. Подождите, пока держатель для стабилизации в течение 30-60 мин. Нажмите F6, иповерните нить на. Когда нить насыщенный, нажмите F6 и откройте затвор на держатель, чтобы посмотреть в сетку.
   3. Пресс Низкий Mag / альфа-1 (установлен на уровне 200X MAG) и размещает места тонким льдом на сетке.
   4. Перейти к MAG 1/alpha 2 установить минимальную дозу режим (MDS) и получать данные Крио-EM при низких электронных дозах, не повреждая образца.
      1. Нажмите F2, чтобы установить режим поиска. Установите увеличение в 40000 х. Увеличить пучок с BRIGTNESS ручки к минимальной дозе электронного ~ 0,04 э ^- / A ² · с. Пресс DIFF для переключения в режим дифракции. Установите длину камеры до 120 см с ручкой МАГ / CAM длина. Найдите области на сетке в пределах предварительно выбранных районов в LOWMAG которые имеют липидные нанотрубки в отверстия углеродной пленки.
      2. Нажмите F4, чтобы установить режим фото при 40000-кратном увеличении и установить освещение с яркостью ручки в дозах 16-25 е ^- / A ² · с. Нажмите кнопку Стандартный фокус установить фокус условия регулировки Z-высотаобразца с Z вверх / вниз (панель П контроль). Установите расфокусировки от -1,5 до -2,5 мкм.
      3. Совместите ПОИСК и режим ФОТО рисуя квадрат в окне Live View на цифровом мониторе фотокамеры в режим поиска соответствующей области для включения в образ в режиме фотосъемки.
      4. Нажмите F3, чтобы установить режим фокусировки при 100000-кратном увеличении. Фокус освещение для покрытия чип CCD (~ 4 - 5 Радиус см) и от оси не облучать область, которая будет отображается в режиме PHOTO. Отрегулируйте расфокусировки до ~ -1.5 и -2.5 мкм с FOCUS ручкой и правильным для астигматизма изображения с DEF / Стиг ручек.
   5. Выберите фактора VIII-LNT для включения в образ в режим поиска путем приобретения изображения в реальном времени в окне Live View на цифровом мониторе фотокамеры. Сосредоточьте фактора VIII-LNT на площади нарисованного на окне Live View.
   6. Запись цифрового изображения на ПЗС-камеры на 52000 X эффективного увеличения и 0,5 воздействия сек за счет перехода в режим Фото и нажав обретенияE кнопку на цифровой микрофотографии мониторе фотокамеры. Условия получения изображения устанавливаются такие как луч заготовки (жалюзи) открытой только тогда, когда образ приобрел в режиме фотосъемки.
   7. Проверьте качество и расфокусировки полученного изображения, нажав CTRL-F для получения быстрого преобразования Фурье (БПФ).

3. 3D Реконструкция

ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение для анализа изображений используются для 2D и 3D анализа: EMAN2 и IHRSR находятся в свободном доступе. EMAN2 можно загрузить с http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Install. Программное обеспечение IHRSR можно получить от профессора Egelman: egelman@virginia.edu. Окончательные уточнения IHRSR запускаются на Техас расширенный Computing Center кластер: http://www.tacc.utexas.edu/ в Университете Техаса, Остин. Алгоритм восстановления 3D показано на рисунке 1 состоит из двух основных этапов: Первый выбора гомогенной набор спиральных сегментов (частиц) с эталонным бесплатно alignme 2Dнт (RFA) алгоритмы реализованы в EMAN 2, второй достижения 3D-реконструкция на основе винтовых параметров и обратно алгоритмов проекционных включены в IHRSR. Первый шаг использует программы, разработанные для выбора однородных наборов частиц для 3D реконструкции с одиночной SPA частиц (алгоритмов), на которые EMAN2 был специально разрабатываются и распространяются: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2. Этот шаг был адаптирован к данным Крио-ЭМ. Второй шаг достигается с помощью алгоритма IHRSR, который специально предназначен для данного типа винтовых агрегатов, полученных с рекомбинантных форм фактора VIII. Этот алгоритм был документально по разным странам через научной литературе ^12.

1. Выполнить анализ 2D изображения с EMAN2 научной обработки изображений пакет: http://blake.bcm.edu/eman2/doxygen_html ^16, чтобы выбрать однородную частицу (винтовая сегмент) Наборы для спиральной реконструкции.
   1. Выберите Крио-EM микрофотографии с straigHT и хорошо организованной спиральные трубки с цифровым программным обеспечением камеры и средств визуализации.
   2. Обратить, нормализуют и фильтр для рентгеновских пикселей в e2workflow.py GUI, реконструкции одной частицы опции (SPR): http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2projectmanager
   3. Импорт перевернутые, нормированные и рентгеновской пикселей отфильтрованные изображения в e2helixboxer.py GUI. Выберите фактора VIII-LNT спиральные трубки и сегмент в 256 х 256 пикселей (2.9 A / PIX) с 90% перекрытием с помощью: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2helixboxer
   4. Оцените расфокусировки от оригинальных снимках и применять контрастный передаточную функцию (CTF) коррекции (только фаза коррекции) в спиральных сегментов из тех же снимках с e2ctf.py опции включены в e2workflow.py: http://blake.bcm. edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2ctf.
   5. Создать начальные частицы (спиральные сегменты) устанавливает в e2workflow.py GUI - SPR вариант: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2workflow.
   6. Рассчитать средние 2D класса с алгоритм e2refine2d.py применения опорного бесплатно K-среднее классификацию, чтобы выбрать однородных наборов данных с тем же LNT диаметра и степени винтовой порядке (рис. 2), после сценария: 'e2refine2d.py - ИТЭР = 8 - naliref = 5 - nbasisfp = 8 - путь = r2d_001 - вход = INPUT.hdf - NCLs = 51 - simcmp = точка - simalign = rotate_translate_flip - classaligncmp = точка - classraligncmp = фаза - classiter = 2 - classkeep = 0,8 - classnormproc = normalize.edgemean - classaverager = средняя - normproj-classkeepsig ', изменение NCLs значение соответственно.
      1. Оцените начальные установленные в 150 классов »NCLs = 151" более 8 итераций с "classkeep = 0,8 'данные, а это означает, что частицы с менее 80% сходства с в среднем классе, исключаются из данного класса. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2refine2d
      2. Слияние частиц из средних классовс ярко выраженным спиральным дифракции в e2display.py создать промежуточный набор данных.
      3. Классифицировать промежуточные данные, установленные в 50 классов »NCLs = 51", чтобы дифференцировать классы с таким же диаметром и степени упорядоченности.
      4. Слияние частиц из классов с таким же диаметром и степени упорядоченности e2display.py создать окончательный набор данных для трехмерной реконструкции: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/emselector.
2. Выполните спиральную реконструкции с Итерационное Винтовая реальном пространстве Реконструкция (IHRSR) алгоритма, как описано в Egelman ^{17, 18.}
   1. Оцените рост, DZ (а) спирали фактора VIII-LNT из объединенного преобразования Фурье из частиц в конечном наборе данных.
   2. Определите азимутальный угол ΔΦ (º), запустив параллельные уточнения IHRSR с постоянным Δz, увеличивая ΔΦ от 576; до 60 ° с шагом 5 °.
   3. Запустите 100 последовательных IHRSR циклов для каждого конечного набора данных с безликой цилиндра в качестве начального объема и начальных винтовых параметров Δz и ΔΦ, как определено в 3.2.1. и 3.2.2.
   4. Осмотрите окончательные объемы сходимости винтовых параметров и переписки между класса средних с 2D классификации окончательного набора данных и проекций от окончательного реконструкции IHRSR.
   5. Накладывают симметрию в конечные 3D реконструкции, соответствующие асимметричным распределением единичной наблюдаемого в конечных объемах асимметричных 3D: 4-кратный для человеческого фактора VIII-LNT и 5-кратное для свиного фактора VIII-LNT. Запустите еще 100 циклов уточнения для формирования окончательного симметризованное 3D-реконструкция.
   6. Рассчитайте корреляционная кривая Фурье Shell для обоих томов, сначала отделяя соответствующие установленные в четные и нечетные данные: 'e2proc2d.py - сплит = 2 '. Затем запустите 100 IHRSR уточнения последовательных, как описано в пункте 3.2.3. Рассчитайте FSC из 3D томах, созданных из четных и нечетных наборов данных: 'e2proc3d.py evenvolume.mrc fsc.txt - calcfsc = oddmap.mrc'.
3. Визуализация и сегмент объемы фактора VIII-LNT в UCSF химеры.
4. 1. Откройте окончательные объемы, начиная с шага 3.2.5. в UCSF Химеры и установить уровень контура до 0,005 в Инструменты> объем данных> параметр программы просмотра VOLUME.
   2. В Сервис> объем данных> СЕГМЕНТ MAP, выберите объем в закладке отображения сегмента и нажмите сегмента к сегменту громкости.
   3. Сегменты Группа, соответствующая одной элементарной ячейки, выбрав с CTRL + SHIFT и нажав группы.
   4. Цвет сегменты по элементарной ячейки и спирали с Действия> цветной вариант, чтобы подчеркнуть особенности строения.

4. Электронной томографии

1. Отрицательно Витражи фактора VIII-LNT Подготовка образцов
   <литий> Подготовка образцов фактора VIII-LNT как для экспериментов Крио-ЭМ.
   1. Тлеющего разряда углерода покрытием 300-сетки медную сетку (со стороны углерода вверх) в смеси O ₂ и H ₂ газа в течение 10 сек при 50 Вт, как для Крио-ЭМ экспериментов.
   2. Нанесите каплю 2,5 мкл фактора VIII-LNT подвески с 6-нм коллоидных наночастиц золота в сетке, промокните излишки жидкости и отрицательно пятно с применением 5 мкл 1% уранилацетатом решение в течение 2 мин. Промокните лишнюю жидкость и воздух сухой сетку.
2. Электронной томографии Сбор данных
   1. Трансфер сетку в одиночный держатель наклона.
   2. Передача держатель в электронном микроскопе.
   3. Сбор наклона серии автоматически с программным обеспечением SerialEM ¹⁹ на 2 ° с шагом в угловом диапазоне от -60 ° до 60 ° и записи изображений с ПЗС-камеры на 52000 X эффективного увеличения, -6 до -10 мкм расфокусировки и электронной дозе 150 - 170 элементctrons / A ² · с на томограмме.
3. Электронной томографии Реконструкция фактора VIII-LNT
   Примечание: Реконструировать наклонена серию pFVIII-LNT и hFVIII-LNT приобретенные в 4.2. с возможностью ETomo программного обеспечения УПМ следующем уроке: http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html
   1. Использование окно терминала, открыть томограмму в 3DMOD. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html.
   2. Bin томограмма на 4 с УПМ BINVOL команду, чтобы уменьшить размер томограммы.
   3. Выберите правильный угол, чтобы повернуть липидов нанотрубки вдоль оси Y. в Binned томограммы, используя команду УПМ ROTATEVOL.
   4. Поверните полный томограмму с помощью команды УПМ ROTATEVOL.
   5. Обрезка выбранного липидный нанотрубки ориентированы вдоль оси ординат с помощью команды CLIP ИЗМЕНИТЬ РАЗМЕР УПМ.
   6. Откройте обрезанной суб-томограмму с 3DMOD.
   7. Нажмите на томограмме визуализировать расположение молекул фактора VIII вместеломтики в Z-оси и вдоль оси ординат в объеме суб-томограммы.

Результаты

Рекомбинантный человеческий и свиной фактора VIII были успешно организованы по спирали на отрицательно заряженные одного двухслойную LNT, напоминающие поверхности активированных тромбоцитов. Спиральная организация человеческого и свиного фактора VIII-LNT был последователен чер?...

Обсуждение

В этой работе методика представлена ​​различать два мембраносвязанных организаций высоко гомологичных белков: человеческий и свиной FVIII самоорганизующихся на липидных нанотрубок в условиях, встречающихся в организме человека.

В описанной процедуры, ч...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
JEM2100 with LaB6	JEOL Ltd.	JEM-2100	operated at 200 kV
with TEMCON software	JEOL Ltd.
Gatan626 Cryo-holder	Gatan, Inc.	626.DH	cooled to -175 °C
with temperature controler unit	Gatan, Inc.
Gatan 4K x 4K CCD camera	Gatan, Inc.	US4000	4096 x 4096 pixel at 15 microns/pixel physical resolution
Solarus Model 950 plasma cleaner	Gatan, Inc.
Vitrobot Mark IV	FEI
Materials
Carbon coated 300 mesh 3mm copper grid	Ted Pella	01821	plasma cleaned for 10 s on high power
Quantifoil R2/2 300 mesh	Electron Microscopy Sciences	Q225-CR2	Carbon coated 300 mesh Cu grids with 2 mm in diameters holes
Uranyl acetate dihydrate	Ted Pella	19481	1% solution, filtered
Galactosyl ceramide	Avanti Polar Lipids Inc.	860546
Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine	Avanti Polar Lipids Inc.	840035
Software
EM software Digital Micrograph	Gatan, Inc.		http://www.gatan.com/DM/
EM software EMAN	free download		http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/
EM software Spider	free download		http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
EM software IHRSR	free download		Programs available from Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/
EM software (IMOD)	free download		http://bio3d.colorado.edu/imod/
EM software (SerialEM)	free download		ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/
UCSF-Chimera	free download		http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html