Un paso más allá de BRET: Fluorescencia por consolidar la excitación de luminiscencia (COMBUSTIBLE)

Resumen

La ampliación de la base y la aplicabilidad de la fluorescencia por consolidar la excitación de luminiscencia (COMBUSTIBLE) mediante encuestas a los principios pertinentes y demostrar su compatibilidad con una gran variedad de fluoróforos y condiciones de anticuerpos dirigidos.

Resumen

Fluorescencia por consolidar excitación de luminiscencia (COMBUSTIBLE) es un proceso de excitación-emisión de radiación que produce aumento de la señal y la mejora del contraste in vitro e in vivo. Porcentajes de combustible de muchos de los mismos principios subyacentes como la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET), sin embargo, difiere en gran medida en las distancias de trabajo aceptables entre la fuente luminiscente y la entidad fluorescente. Mientras BRET se limita efectivamente a un máximo de 2 veces el radio de Förster, habitualmente menos de 14 nm, el combustible puede ocurrir a distancias de hasta micras o incluso cm en ausencia de un absorbente óptico. Aquí ampliamos sobre el fundamento y la aplicabilidad de FUEL mediante la revisión de los principios pertinentes que justifican el fenómeno y demostrar su compatibilidad con una amplia variedad de fluoróforos y nanopartículas fluorescentes. Además, la utilidad de COMBUSTIBLE de anticuerpos dirigidos se explora. Los ejemplos mostrados aquí demuestran que el combustible puede ser utilizado para la aplicaciones donde BRET no es posible, llenando el vacío espacial que existe entre BRET y de imagen animal completamente tradicional.

Introducción

La modificación genética de organismos, tales como virus ^{1, 2, 3,} bacterias o pequeños mamíferos ⁴ a cualquiera de inducir o bioluminiscencia expresan constitutivamente, ha sido muy exitoso y ampliamente demostrado ^5-7. La bioluminiscencia, una reacción quimioluminiscente en vivo que implica los reactivos de origen natural, tiene la ventaja de la producción de luz sin la necesidad de una fuente de luz externa. Como tal, bioluminiscente de imágenes no sufre de los inconvenientes comunes de la señal de auto-y no específicos encontrados a partir de imágenes de fluorescencia ^8. En consecuencia, la bioluminiscencia tiene una relación significativa de señal a ruido, ya que cualquier señal detectada se origina únicamente a partir de la fuente deseada. Mientras que muchos modelos han explotado el operón lux de Photorhabdus luminescens (máximo de emisión centrado entre 480 y 490 nm) para in vitro y en aplicaciones in vivo ^9, su uso en pequeña mammALS ha sido problemática debido a la propia naturaleza de las condiciones de formación de imágenes; la existencia omnipresente de absorbentes ópticos, tales como la hemoglobina, y agentes de dispersión, tales como el tejido y el hueso, afectan en gran medida a longitudes de onda azul amarillas ^3. La expresión de una luciferasa de luciérnaga ingeniería (máximo de emisión a 617 nm) se ha desarrollado e incorporado recientemente, proporcionando una herramienta que supera en gran medida la absorción óptica ^10, pero todavía está sujeta a los efectos de dispersión.

En respuesta, se han producido varios intentos de desplazamiento al rojo de la señal emitida en la ventana óptica deseada de 650 a 900 nm, una región de absorción minimizado y dispersión, utilizando la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET) ^11-13. Como una herramienta para mejorar la detección de señal, BRET, que utiliza una fuente bioluminiscente como el donante y un fluoróforo añadido como aceptor, se ha encontrado un éxito limitado. Como ejemplo seminal de este fenómeno, "puntos cuánticos con iluminación propia4; (SIQDs) ¹⁴ consisten de modificación de Renilla reniformis luciferasas unidos a la capa de polímero de lisina externa puntos cuánticos de disponible en el mercado (puntos cuánticos). Después de la adición de sustrato, la reacción bioluminiscente resultante induce la emisión de fluorescencia de los puntos cuánticos, la generación de una producción significativa de fotones rojos. Sin embargo, estos SIQDs han aplicabilidad limitada para la visualización en vivo de eventos fisiológicamente relevantes. Esta aplicabilidad limitada es probablemente debido a la dificultad de unir la sonda dual para el órgano, célula o gen de interés, ya que los SIQDs no pueden ser codificados genéticamente y por lo tanto, requerirían una modificación secundaria de la cubierta de polímero. Para mejorar su aplicabilidad, SIQDs alternativas, cuando las luciferasas están vinculados directamente al núcleo luminiscente, recientemente se han empleado ^15. La construcción de fuera del concepto SIQD, un sistema de BRET más aplicable se consiguió uniendo Cypridina luciferasa a una endocyanine tinte ^16, que era capaz de dirigirse específicamente tumores en ratones, mientras que la producción de un cambio sustancial de color rojo de 460 nm a 675 nm. Para someterse a la transferencia de energía no radiante, BRET sigue las mismas restricciones primarias como su contraparte fluorescente: tiene que haber un fuerte solapamiento espectral entre la emisión de los donantes y los espectros de excitación del aceptor y la distancia de trabajo entre las dos mitades deben estar en el orden del radio de Förster (5-14 nm en función de la pareja donante-aceptante, con una distancia máxima efectiva de dos veces el radio Förster ^17). Esta dependencia de la distancia limita en gran medida los tipos de eventos que se pueden observar utilizando BRET como un medio para mejorar la detección.

Recientemente se identificó un nuevo enfoque y demostrarse en tanto in vitro como en condiciones in vivo. Construido a partir de la fundación de BRET, Fluorescencia por consolidar la excitación de luminiscencia (COMBUSTIBLE) ^{18, 19} también requiere un fuerte solapamiento espectral entre la luminiscencia y componentes fluorescentes. Sin embargo, a diferencia de BRET, el combustible es un proceso completamente radiativo mediante el cual el fotón emitido desde la fuente luminiscente es absorbida por un fluoróforo ópticamente accesible, que posteriormente emite un fotón desplazada al rojo de acuerdo con el rendimiento cuántico fluoróforo. Similar a BRET, este enfoque también se puede utilizar para superar las limitaciones de formación de imágenes en presencia de absorbentes ópticos. El desplazamiento hacia el rojo resultante proporciona un aumento global y la especificidad en la señal detectada debido a una disminución en la atenuación y una reducción de los efectos de dispersión óptica. De combustible se ha informado de que se produzca entre Escherichia coli bioluminiscentes que expresan el operón lux y puntos cuánticos ^{18, 19.} Si bien experimentalmente similar a los SIQDs, existe una diferencia fundamental: en el combustible, no es necesario para la fuente luminiscente de estar físicamente unido al fluoróforo, que permite FOr codificación genética de la sonda luminiscente. Debido a la detección exitosa de combustible entre bacterias luminiscentes y puntos cuánticos, es posible que esta técnica se podría aplicar a ambos superficial (piel) y el tejido profundo (pulmón, hígado) infecciones tales como Staphylococcus aureus y Klebsiellia pneumoniae.

Desde el informe de su significado experimental, combustible ha evolucionado para incluir un modelo matemático robusto ²⁰ que se puede utilizar para predecir luminiscente aceptable y pares fluorescentes, y sus aplicaciones se han expandido para incluir su uso en la identificación de características fotofísicas tales como rendimiento cuántico. A continuación se describen algunas de las técnicas básicas de FUEL. En primer lugar, se muestra evidencia de este fenómeno sobre tanto a corto (m) y largo (cm) distancias de trabajo, que distingue fundamentalmente COMBUSTIBLE de BRET. En segundo lugar, expansión a partir de los posibles pares de combustible en el examen de una amplia variedad de fluoróforos y nanopartículas fluorescentes. Third, aplicaciones de combustible se investigan mediante la comparación de pares COMBUSTIBLE dirigidos y no dirigidos.

Protocolo

1. Reactivos

1. Compra o desarrollar bacterias luminiscentes y medios de cultivo adecuados, tales como Escherichia coli modificada que expresa el ABCDE lux ^21, Vibrio fischeri, Photobacterium sp. Klebsiella pneumoniae ^22.
2. Prepare una solución salina fisiológica (0,9% NaCl) y soluciones de medios de cultivo de acuerdo a las recetas estándar. E. coli y K. pneumoniae se cultivaron en medio Luria Bertani (LB) a 37 ° C, y V. fischeri y Photobacterium SP en LB suplementado con NaCl 0,5 M a 22 ° C.
3. Compra o adquisición de sondas fluorescentes tales como Q-Tracker 705 (40 nm de diámetro, referido como QD705), Q-Tracker 800 (40 nm de diámetro, referido como QD800), fluorescente (40 nm de diámetro) y las microesferas de poliestireno no fluorescentes ( 48 nm de diámetro), y colorantes fluorescentes convencionales.
4. Preparar los reactivos necesarios para el etiquetado bacteriana.
5. Asegurar el acceso atodo un reproductor de imágenes de bioluminiscencia animal, tal como un espectro IVIS, que es capaz de detectar la señal en un amplio rango de longitudes de onda de emisión y los tiempos de exposición. Un lector de placas capaz de mediciones de bioluminiscencia será suficiente para la mayoría de los experimentos descritos aquí.

2. Recapitulación básico de FUEL

1. A partir de colonias individuales en placas de cultivo estándar, iniciar cultivos de una noche de bacterias luminiscentes. Aquí, V. Se han usado fischeri.
2. El día del experimento, iniciado subculturas frescos y les permite progresar hasta que se logre una DO ₆₀₀ de 1 a 1,5. Con el fin de obtener resultados comparables, es mejor usar las bacterias en los estados de crecimiento similares en donde se produzca señales intensas. Esto puede ser asegurada por mantener el OD ₆₀₀ constante.
3. Combine alícuotas de 100 l de cada uno, ya sea con 5 l de QD705 o solución salina fisiológica (PS), y luego añadir 895 l de PS en standacubetas ª espectroscópicas. Coloque las cubetas llenas en el espectro IVIS y tomar las medidas en virtud de los conjuntos de filtros apropiados. Aquí, se utilizó el filtro de emisión de 710-730 nm.

3. FUEL a distintas distancias

1. Llenar dos volumen reducido (1 ml) cubetas fotométricas de plástico, ya sea con 50 l de QD705 o 97,2 l de no fluorescentes microesferas de poliestireno 48 nM en un volumen total de 1 ml de PS. Esto asegura superficie sólida similar al volumen total entre las dos entidades.
2. Preparar una cubeta de fuente de luz encerrando una tercera cubeta con cinta negro estándar o de algún otro material opaco capaz de bloquear la luz. Prepare cuidadosamente dos ventanas ópticas idénticos en lados opuestos de la cubeta.
3. Coloque las cubetas previamente llenados directamente sobre cada lado de la cubeta de la fuente de luz. Añadir una alícuota de 1 ml de V. cultura fischeri u otro (es decir, luminiscente E. coli o Photobacterium sp) de una subcultura fresca en la cubeta de la fuente de luz y se cubre con un material opaco, como papel negro para reducir la contaminación de luz.
4. Visualice los tres cubetas bajo los filtros de emisión apropiadas tales como la luz total y filtros de emisión 710-730 nm, con tiempos de exposición de 10, 30 y 30 segundos, respectivamente.
5. Vuelva a colocar las dos cubetas externos a otras distancias equivalentes de la cubeta central, y luego visualizar de nuevo. Repita hasta que se logre una distancia final cara a cara (central a la reducción del volumen de la cubeta) de 3 cm. En cada paso, adquirir una imagen de fluorescencia (450-480 nm de excitación, 710-730 nm de emisión) para validar la ubicación QD705.

4. Investigar pares potencial combustible

1. Llene dos cubetas de volumen reducido con 1 ml de soluciones que contenían o bien un fluoróforo o una nanopartícula fluorescente de interés en uno, y PS o PS con nanopartículas no fluorescentes como el control negativo en el otro. En the trabajo demostró aquí, una variedad de potenciales fluoróforos combustible disponible comercialmente y nanopartículas fluorescentes fueron investigados como se indica en la Tabla 1.
2. Añadir una alícuota de 1 ml de V. fresca fischeri u otras bacterias luminiscentes a una tercera cubeta oscuras-que contiene dos ventanas ópticas físicamente iguales situados en lados opuestos. Tapar la cubeta con una sustancia opaca, como una hoja de papel negro.
3. En un lugar de corta distancia, pero igual las dos cubetas de volumen reducido en ambos lados de la cubeta a oscuras-y visualizar bajo los filtros adecuados. Aquí, se utilizó una distancia de 0,7 cm. Repita con el resto de los fluoróforos.

5. FUEL Targeted

1. Preparar anticuerpos biotinilados específicos para las bacterias luminiscentes. Por ejemplo, los anticuerpos primarios específicos aquí en K. pneumoniae (α-PK) se biotinilaron utilizando una solución que contiene EZ-Link sulfo-NHS-LC-biotina.
2. Eliminar el exceso de reactivo de los anticuerpos utilizando columnas de desalación bajo centrifugación (1.500 xg) durante 2 min.
3. Utilice un ensayo estándar de Bradford para determinar la concentración de proteína y determinar el grado de biotinilación de anticuerpos mediante un ensayo de HABA.
4. Obtener el anticuerpo biotinilado α-PK-Biot (Ab) lotes mediante la mezcla de 100 l (10 mM, disuelto en 1x PBS) con 40 l de anticuerpo α-PK, lo que resulta en un grado final de sustitución de 16 residuos de biotina por AB y una final concentración de proteína de 10 mg ml ^-1.
5. El uso de múltiples replicar noche culturas, apuntan a las bacterias lavadas con los anticuerpos antes mencionados siguiendo el protocolo adecuado.
   1. En concreto, se lava la K. pneumoniae en 1x PBS, y se vuelve a suspender en 1 x PBS a una DO de 4 (ca. 4 x 10 ⁸ UFC ml ^{-1 OD-1).}
   2. Para cada repetición, se incuban 100 l de PBS, α -Anticuerpos Kp (10 l α-Kp-biotB o 10 l de PBS para el control) y 100 células l durante 90 min a 30 ° C. Lavar las células tres veces en PBS 1x, y resuspender en 196 l de PBS.
6. Etiquetar las células con el conjugado estreptavidina QD705 y dividirlos en dos volúmenes equivalentes.
7. Lave una solución y tres veces y luego volver a suspender en el volumen apropiado.
8. Distribuir 100 l de las soluciones lavadas y sin lavar en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos de color negro. Mida la luminiscencia resultante bajo la luz total, desde 490 hasta 510 nm y 710-730 nm filtros. Concentración de fluoróforo se puede determinar usando 450-480 nm de excitación y 710-730 nm de emisión.

Resultados

Transferencia de energía de resonancia (RET) es una interacción no radiativo entre un donante luminiscente y un aceptor fluorescente, mediante el cual la energía del donante salido es capaz de inducir una respuesta de fluorescencia del aceptor a través de una fuerte interacción dipolo-dipolo ^13. RET, que ha sido descrito utilizando fluorescente ^23, quimioluminiscente ^24, y bioluminiscentes ¹³ donantes, requiere principalmente: 1 solapamiento espectral fuerte entre la emisión del donante y aceptante espectros de excitación;. 2 alineación rotacional apropiada entre las dos entidades.; y 3. una distancia de trabajo no superior a 0,5-a 2 veces el radio de Förster, R _0, entre el donante y el aceptor ^17. En contraste con RET, COMBUSTIBLE ocurre cuando una fuente luminiscente, tal como una bacteria bioluminiscente, emite un fotón que es absorbido y de re-emitida por una segunda entidad, tal como un fluoróforo o una nanopartícula fluorescente, rojo-desplazamiento de la SPECT de emisiónron de la fuente original, luminiscente. Por lo tanto, COMBUSTIBLE sigue un proceso de excitación-emisión estándar similar a las condiciones epifluorescent estándar, sin embargo, sin el uso de una excitación centrada. Evidencia de esto se puede observar fácilmente por la simple mezcla de bacterias luminiscentes y puntos cuánticos altamente fluorescentes. En la presencia de la Vibrio sp, se observa un aumento significativo de la señal de color rojo cuando QD705 eran también en solución en comparación con una no fluorescente de control de microesferas de poliestireno (Figura 1A). Los componentes necesarios para crear bioluminiscencia, esencialmente el sustrato de aldehído, luciferasa, y ATP, son todos producidos y contenidos dentro del citoplasma. Además, la producción luminóforo enzimática se produce en el citoplasma bacteriano (Figura 1B). Como se ha informado en otra parte, la distancia entre la membrana interna y externa de las bacterias es típicamente mayor que 30 nm ^25-27, una distancia que no permite significativa RETque se produzca. Además, las nanopartículas fluorescentes no se cruzan en el citoplasma bacteriano ya que no hay endocitosis u otros medios de absorción. En conjunto, estas limitaciones indican que el combustible es el fenómeno dominante excitación-emisión que se produce cuando las bacterias luminiscentes se mezclan con nanopartículas fluorescentes.

Como se ha demostrado anteriormente, existe COMBUSTIBLE más allá de la gama de RET. Para investigar la dependencia de los combustibles de la distancia, cubetas espectrofotométricas estándar de volumen reducido se pueden utilizar, con una que contiene una solución fluoróforo, un segundo que contiene un control adecuado que se puede controlar para la dispersión, y la tercera contiene una parte alícuota de la solución luminiscente fresco. Es esencial que el centro de la cubeta se envolvió con cinta negro u otro material opaco, salvo por lo menos dos ventanas ópticas idénticas situadas en caras opuestas, para reducir cualquier contaminación potencial de la luz de la fuente luminiscente. Además, las dos cubetas restantes necesitanser colocados de forma equidistante en cada lado de la cubeta central. Por último, una solución luminiscente fresca, usando bacterias o quimioluminiscencia, se debe utilizar con cada experimento para garantizar la máxima producción de luz. Tras la colocación adecuada, adquirir la señal de luminiscencia bajo los filtros deseados. El total de luz y filtros 710-730 nm se utilizaron en este caso, aunque sólo los datos de la última se muestra. Después de cada adquisición, aumentar gradualmente la distancia cara a cara de 1,0 cm a 3 cm (Figura 2). Por último, normalizar todos los datos hasta el punto más brillante. En los ejemplos utilizados aquí, esto ocurrió en la distancia más corta (D = 1 cm) entre la fuente luminiscente y la cubeta que contiene la QD705. Con este enfoque, la señal COMBUSTIBLE viable se puede observar hasta la adquisición final lo que sugiere que, en ausencia de cualquier absorbedor óptica, el combustible puede ocurrir a distancias más allá de cualquier posible transferencia de energía de resonancia y sólo puede ser explicado a ser puramente radiativoefecto. Ajuste de los datos revela una disminución de la señal como una función de la distancia D después de un D ^-1 a la dependencia D ^-2. Dependiendo de la configuración geométrica, las primera corresponde a la dependencia de la distancia del condensador y el segundo a la ley del cuadrado inverso para fuentes puntuales. Por tanto, este resultado es consistente con nuestra configuración global de adquisición, dado el tamaño de la abertura de la cubeta y la distancia entre la fuente luminiscente y el fluoróforo.

El combustible no sólo se aplica a los puntos cuánticos, pero también se puede observar utilizando una amplia gama de fluoróforos que van desde la serie Alexa a microesferas fluorescentes (Tabla 2). Con el fin de ser comparable a la de control, concentraciones iguales de los diferentes fluoróforos deben usarse y el área de superficie total de las nanopartículas mantienen constantes (Tabla 1). Mediante la comparación de los fluoróforos y nanopartículas para sus controles apropiados (PS o PS con no fluorescentemicroesferas de poliestireno), se observa un aumento significativo de la señal en el máximo de emisión de cada entidad fluorescente. Se encontró que el aumento relativo más grande en la señal que se produzca en el que el máximo de emisión fluorescente fue más alejado del máximo de emisión luminiscente. Esto es más probable debido a la mayor especificidad de la señal fluorescente en comparación con el amplio espectro de emisión de la fuente luminiscente. Por el contrario, se encontró la señal de COMBUSTIBLE menos fiable cuando los dos máximos de emisión no fueron bien separados. Curiosamente, una señal de COMBUSTIBLE discernible se encontró con las microesferas amarillas a pesar de la diferencia espectral es mínima, debido más probablemente a la cantidad sustancial del fluoróforo presente por perla (350 equivalentes de fluoresceína). Los resultados mostrados aquí indican que bajo condiciones apropiadas de combustible se puede lograr con una variedad de fluoróforos, que permite la adaptación de sondas elegidas para aplicaciones más pertinentes bajo tanto in vitro y en condiciones in vivo. El significado de la señal de FUEL observado se determinó mediante la prueba t de Student de dos colas estándar. Como tal, sólo el Alexa555 se encontró que era incompatible con la fuente luminiscente utilizado.

Con el fin de explorar los efectos de la orientación en el combustible, se utilizaron anticuerpos con biotina para atacar bacterias luminiscentes y puntos cuánticos estreptavidina enlazada. Es importante que las bacterias o fuente de luminiscencia proporcionan una capa lo suficientemente gruesa como para reducir al mínimo la posibilidad de RET entre el luminóforo y el fluoróforo correspondiente. Después de la incubación y el lavado para eliminar los anticuerpos no unidos, las bacterias marcadas con biotina se exponen entonces a cualquiera de QD705 conjugada con estreptavidina o QD705 no funcionalizado como el control, las soluciones divididas y un conjunto expuesto a lavados adicionales con el fin de eliminar cualquier no adheridas QD705. Aquí, para las cuatro condiciones, la luminiscencia resultante se observa bajo la luz total, 490-510 nm, unad 710-730 nm filtros, aunque sólo los dos últimos filtros se utilizan para el análisis de datos. La presencia de la QD705 se comparó el uso de 450-480 nm de excitación y filtros de emisión de 710-730 nm. Sobre la investigación hemos encontrado poca o ninguna diferencia en la señal desplazada al rojo cuando las soluciones se dejaron en un estado sin lavar (Figura 3). La señal de fluorescencia resultante bajo esta condición también se encuentra para ser muy similares, lo que sugiere que un número igual de QD705 estuvo presente tanto en virtud del estado objetivo y no objetivo. Sin embargo, lavar las muestras para eliminar cualquier QD705 no unido proporciona un aumento de casi dos veces en la señal roja relativa para las bacterias específicas en comparación con su control no específica. Investigación por fluorescencia se puede utilizar para verificar la presencia o ausencia de la QD705. Comparativamente, la condición se lavó definido dio lugar a una intensidad de fluorescencia que era casi tres veces menos que la condición sin lavar, sin embargo, el desplazamiento hacia el rojo resultante disminuyó en sólo30%, lo que sugiere que en condiciones puramente unidos la focalización de las bacterias se traducirá en un aumento en la emisión desplazada al rojo. Esto implica fuertemente la utilidad de FUEL objetivo para futuras aplicaciones.

Figura 1. Una interacción de combustible entre bacterias luminiscentes y puntos cuánticos disponibles comercialmente conduce a un aumento en la producción de fotones rojo. Dos cubetas espectrofotométricas se llenaron con soluciones que contienen 100 ml de alícuotas de V. fresco cultura fischeri con un OD ₆₀₀ de 1-1,5, 895 l de PS, y, o bien 5 l de QD705 o solución salina fisiológica (PS), antes de ser colocado en un espectro IVIS y el espectro de emisión adquirida. Un aumento significativo de la señal de color rojo se logra debido a la presencia deel QD705, como se puede observar por el aumento de fotones detectados • ^s-1 • cm ^-2 (p • • s ^-1 cm ^-2) en comparación con el control en el marco del filtro de emisión 710-730 nm (A). Aquí, la doble membrana de las bacterias excluye la interacción de los restos luminiscentes (círculos azules) y la QD705 (círculos negros). El primero sólo se encuentran en el citoplasma bacteriano mientras que el segundo se distribuyen libremente en la solución a granel (B). N = 3 para cada solución bacteriana. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Evidencia de FUEL ocurren en distancias complexcluyendo etely transferencia de energía de resonancia. cubetas espectrofotométricas se llenaron con soluciones que contengan cualquiera de 50 l de QD705 y 950 l de solución salina fisiológica (PS) o 97,2 l de no fluorescentes microesferas de poliestireno 48 nm y 902,8 l de PS, y se colocan de manera equidistante en lados opuestos de una cubeta negro central que contiene 1 ml de fresco Photobacterium luminiscente sp a un OD ₆₀₀ de 1 a 1,5. La cubeta central tenía dos ventanas ópticas idénticas que permiten a los fotones emitidos a dispersan libremente. La adquisición de imágenes a distancias (D) que van desde 1,0 cm a 3 cm, la producción observada de la luz roja disminuyó como una función de la distancia que muestra la evidencia de que el combustible puede ocurrir a distancias no alcanzables por la transferencia de energía de resonancia. La intensidad parecía tener dependencia ^D-2, similar a la ley del cuadrado inverso (izquierda). El mismo protocolo se siguió para E. coli (derecha). Las líneas de tendencia resultantes tienen forma al concepto that las bacterias actúan como fuentes puntuales de luz. Un total de tres mediciones de distancia independientes fueron adquiridos con cada uno usando una subcultura única. Las barras de error están presentes en cada punto. En algunos casos, las barras de error eran más pequeños que los símbolos empleados que indican la intensidad normalizada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Una comparación entre objetivo (específico) y no específica (solución a granel) COMBUSTIBLE. K. pneumoniae fueron funcionalizado con anticuerpos con biotina y luego expuesto a cualquiera de estreptavidina marcada con (dirigida) o no marcado (no dirigida) QD705. Las soluciones resultantes fueron igualmente divisiónDED y un conjunto lavaron tres veces con PBS antes de ser resuspendido en su volumen inicial en PBS. Las soluciones se dispensan en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos negro y la bioluminiscencia observado bajo los filtros de emisión de 490-510 nm (500 nm) y 710-730 nm (720 nm) (indicado como barras azules). El p • seg • cm ^{-1 -2} encuentra desde el filtro 720 nm para cada pocillo se normalizó por la respectiva p • seg • cm ^{-1 -2} intensidad de la bioluminiscencia 500 nm de la misma así. La intensidad de fluorescencia relativa resultante de una excitación de epifluorescencia se determinó a través de excitación 450-480 nm y 710-730 nm filtros de emisión (indicado como barras rojas). Poca o ninguna diferencia en la señal bioluminiscente o fluorescente se observó en las condiciones sin lavar (no específica sin lavar y sin lavar focalizados). Esto sugiere que el atado y libre flotación QD705 eran igualmente emocionados por los fotones bioluminiscentes. Tras el lavado, NSe observó una diferencia temprana de dos veces en señal roja relativo para las bacterias marcadas con QD705 (Targeted lavados) en comparación con el control (no específica Lavado). La ausencia de QD705 en la no orientada por lavado fue confirmada por la falta de señal fluorescente y verificó el etiquetado QD705 en el estado lavado Targeted. Los datos provienen de cuatro cultivos independientes de K. pneumoniae. Para mayor claridad, la leyenda indica que la fuente de la excitación QD705. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Fluoróforo	Concentración	l	PS (l)	λ max ex / em (nm)	Filtro de emisiones (n m)
Alexa 555	37,2 M	4.77	995.23	555/565	570-590
Alexa 568	37,2 M	4.77	995.23	578/603	590-610
Alexa 633	37,2 M	4.77	995.23	632/637	650-670
37,2 M	4.77	995.23	702/723	710-730
No fluorescente	2,62% de sólidos	9.72	990.28
μSph Pink	5% de sólidos	4.77	995.23	580/605	610-630
μSph Amarillo	5% de sólidos	4.77	995.23	505/515	510-530
QD705	2 M	5	995	465/705	710-730
2 M	5	995	465/705	790-810

ancho: 108px; "> Alexa 700 altura: 22px; ancho: 108px; "> QD800

Tabla 1. Propiedades de fluoróforos utilizados en las demostraciones de combustible.

	Control	filtro	fluoróforo		Control		valor p
			p · s -1 · cm -2	SD	p · s -1 · cm -2	SD
A555	PS	580	1.08 x 10 7	3.31 x 10 6	9.09 x 10 6	1,75 x 10 6	0.233
A568	PS	600	8.47 x 10 6	4.23 x 10 6	4.49 x 10 6	9,71 x 10 5	0.094
A633	PS	660	2.40 x 10 6	1.25 x 10 6	7,85 x 10 5	2,39 x 10 5	0.046
A700	PS	720	5,53 x 10 5	2,46 x 10 5	1,54 x 10 5	6,05 x 10 4	0.026
MSPH Amarillo	μspheres no fluorescentes	520	1.19 x 10 8	4.85 x 10 7	5.79 x 10 7	1.99 x 10 7	0.057
MSPH Pink	μspheres no fluorescentes	620	2.37 x 10 7	1.36 x 10 7	2.16 x 10 6	8,00 x 10 5	0.026
QD705	μspheres no fluorescentes	720	1.76 x 10 7	7.33 x 10 6	2,08 x 10 5	7.16 x 10 4	0.007
QD800	μspheres no fluorescentes	800	7.79 x 10 6	4.72 x 10 6	3.60 x 10 4	1.52 x 10 4	0.023

Tabla 2. Identificación de los fluoróforos y nanopartículas fluorescentes compatibles con el combustible.

Discusión

La manifestación fundamental de FUEL puede lograrse simplemente mediante la mezcla de bacterias luminiscentes con nanopartículas o puntos cuánticos fluorescentes. Las dos entidades serán separados físicamente y permanecen más allá de cualquier distancia RET eficiente. Más difícil es la optimización de la señal COMBUSTIBLE tanto in vitro como in vivo. En condiciones in vitro, con y sin un absorbedor óptico presente, por lo general la adición de un exceso fluoróforo será suficiente para maximizar la respuesta de combustible. Sin embargo, a altas concentraciones fenómenos tales como la atenuación estática o de colisión puede conducir a una pérdida de señal fluorescente. Realización de una serie de diluciones variando de forma independiente de la concentración de la fuente luminiscente y el fluoróforo ayudará a optimizar las concentraciones deseadas. El establecimiento y la optimización de combustible bajo las concentraciones in vivo es mucho más difícil y debe ser abordado en una base de caso por caso. Puede ser difícil para crear un condition donde la entidad fluorescente se puede acceder ópticamente por la fuente luminiscente. Como tal, comenzando con los compañeros de las inyecciones directas de los dos restos puede proporcionar información sobre el éxito de combustible bajo condiciones óptimas.

Existen protocolos estándar para las bacterias de etiquetado y células eucariotas con las entidades fluorescentes tales como la serie Alexa y puntos cuánticos. A menudo esto requiere funcionalización de la superficie o de la activación con anticuerpos, que puede conducir a efectos no deseados, como reducción de la viabilidad celular o la actividad metabólica alterada. Para superar esto, es importante para determinar la cantidad óptima de anticuerpo o agente de activación necesario que minimiza las perturbaciones celulares y aumentar al máximo el etiquetado fluorescente. El uso de puntos cuánticos es ventajoso debido a su amplia característicamente espectros de excitación, espectro de emisión estrecho y sintonizable, y la posibilidad de un gran desplazamiento de Stokes. Sin embargo, los puntos cuánticos pueden ser citotóxicos y pueden no ser deseable en algunos casos.

combustible es un fenómeno que está presente en muchos experimentos BRET ¹³ y es aplicable a una variedad de fuentes luminiscentes y fluorescentes. Hasta ahora, los fotones procedentes del combustible se consideraron el producto de interacciones no específicas o una señal de fondo desafortunado resultado de experimentos BRET mal diseñados. Es sólo con el tipo de experimentos se ha demostrado aquí que hemos sido capaces de identificar la utilidad de esta señal no deseada. En los ejemplos mostrados, las bacterias luminiscentes actúan como una fuente de excitación difusa capaz de provocar una respuesta fluorescente estándar a partir de una amplia variedad de entidades fluorescentes. Además, debido a la distancia de trabajo sustancial, es seguro concluir que mientras que el combustible se puede construir sin la aparición de BRET, en BRET en general no puede ser observado sin una contribución de FUEL. Es importante destacar que, debido a la falta de un requisito de la orientación, el combustible puede ser utilizado para cubrir la brecha espacial que existe entre BRET y Clas técnicas de imagen en los animales intactos onventional.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Escherichia coli expressing the luxABCDE operon			kindly provided by José A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer
Klebsiella pneumoniae 52145			52145 is a serotype K2 reference strain
Luria Bertani (LB)			standard growth media
Q-Tracker 705	Life Sciences	Q21061MP
Q-Tracker 800	Life Sciences	Q21071MP
Alexa 555	Life Sciences	S21381
Alexa 568	Life Sciences	S11226
Alexa 633	Life Sciences	S21375
Alexa 700	Life Sciences	S21383
Non-fluorescent microspheres	Polysciences, Inc	15913
Pink microspheres	Life Sciences	F8887	40nm diameter
yellow microspheres	Life Sciences	F8888	40nm diameter
Ivis Spectrum	PerkinElmer
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin	Thermo Scientific Pierce	21425
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO	Thermo Scientific Pierce	21425
HABA assay kit	Thermo Scientific Pierce	28005
Bradford assay	Bio-Rad	500-0201