Nanogold תיוג של מערכת endosomal שמרים לניתוח Ultrastructural

Summary

שמרים, שמר האפייה, כבר אורגניזם מודל מפתח כדי לזהות וללמוד גנים המסדירים את קיום החיים ופונקציות של מערכת endosomal. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לתיוג הספציפי של תאי endosomal ללימודי ultrastructural.

Abstract

Endosomes אחד של הקרום הגדול מיון מחסומים בתאי אוקריוטים והם מווסתים מחזור או הרס של חלבונים בעיקר מקרום הפלזמה וGolgi. כתוצאה מכך מערכת endosomal ממלאת תפקיד מרכזי בשמירה על הומיאוסטאזיס, ומוטציות בגנים השייכים לרשת זו של האברונים מחוברים על ידי תחבורת ועי, לגרום לפתולוגיות חמורות, כולל סרטן והפרעות הנוירוביולוגי. לכן זה רלוונטי ראש כדי להבין את המנגנונים העומדים בבסיס קיום החיים והארגון של מערכת endosomal. שמרי Saccharomyces cerevisiae היה מרכזי במשימה זו. לתייג באופן ספציפי ולנתח ברמת ultrastructural מערכת endosomal של אורגניזם מודל זה, אנו מציגים כאן פרוטוקול מפורט לספיגת nanogold הטעונה חיובי על ידי spheroplasts אחריו ההדמיה של חלקיקים אלה באמצעות תגובת שיפור כסף. שיטה זו מדי יקר היא גםl לבחינה מורפולוגית של מוטציות עם מומים בסחר endosomal. יתר על כן, זה לא ישים רק לבחינות ultrastructural אבל זה גם יכול להיות משולב עם labelings immunogold לחקירות לוקליזציה חלבון.

Introduction

מערכת endosomal היא מנגנון קרום גדול שמיון משחק תפקידים סלולריים חיוניים רבים, כולל סחר בקולטנים מיון אנזים lysosomal והמחזור של קרום פלזמה (PM) קולטניים ^1,2. Endosomes מחולקת בשלושה תאים שונים, כלומר. endosomes המוקדמת (EE), endosomes המאוחרת (LE) וendosomes המיחזור. סיווג זה מבוסס על המשך הזמן שלוקח לחומר endocytosed להגיע אליהם, על חלבוני סמן ספציפיים ועל המורפולוגיה שלהם. ממברנות, כלומר bilayers חלבונים ושומנים בדם, הפנימו מPM יכולים להיות מועברות לlysosomes באמצעות endosomes לשפלה או להיות ממוחזרות בחזרה. ממברנות גם מועברים לendosomes מGolgi ובאופן דומה, או להמשיך lysosomes או להאסף בחזרה לGolgi. יתר על כן, ניתן למיין חלבונים לתוך שלפוחית ​​luminal ניצנים פנימה מן קרום endosomal מגביל, תהליך שמוביל להיווצרות שלקטגוריית משנה של LE, גופי multivesicular.

מערכת endosomal השמרים היא יחסית פחות מורכב מזו של תאי אוקריוטים גבוהים. endosomes שמרים מחולקות לEE ו LE. בניגוד לתאי יונקים הם אינם מכילים endosomes מחזור אלא גם אברונים הקשורות לליזוזום רקמות ספציפיות. כתוצאה מכך שיש להם רשת פחות מורכבת של נתיבי סחר endosomal ^3,4. לכן שמרים ייצג ועדיין מייצג את מערכת ניסיונית יתרון ללמוד חלק מתנועת הממברנה הבסיסית העקרונות במערכת endosomal. יתרון זה מודגש על ידי העובדה כי גנים רבים המעורבים במסלולי endosomal היו מבודדים בתחילה עם מסכי גנטיים בשמרים ^5. בעוד מערכת endosomal השמרים בסוג בר ותאים שעברו מוטציה, נחקרה בהרחבה שימוש בגישות מיקרוסקופית ביוכימי וקרינה, את חקירתה ברמת ultrastructural כבר רקמינימאלי. ניתוחים מורפולוגיים הם רלוונטיים במיוחד בשמרים, כי רוב האברונים endosomal מזוהים כמו מבני פיסוק על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אשר הופכים קשה זיהוי חד משמעי שלהם ^6. למרבה הצער רק מספר מוגבל של נסיובי הכרת סמני חלבון השמרים endosomal הוא עובד באימונו אלקטרון מיקרוסקופיה הכנות (IEM) ^7-10. לחלבונים מסוימים, בעיה זו כבר לעקוף על ידי התיוג אנדוגני של הגן של עניין והשימוש בנוגדן הכרת התג לזהות אותו ^7,11,12. לעתים קרובות, לעומת זאת, חלבונים הם לגילוי על ידי IEM בגלל רמות הביטוי הנמוכה שלהם. ביטוי היתר שלהם הוא לא פתרון, כי גישה זו יכולה לגרום לאי - מגוירת ו / או שינויים במורפולוגיה / פונקציות אברון. כך התיוג של תאי endocytic עם בדיקה לזיהוי על ידי EM במיקרוסקופ אלקטרונים הוא אפשרות יעילה. זה פתרון אופטימלי במיוחד אם יחסי הציבורOBE הוא להיכנס למסלול endocytic באופן תלוי בזמן, המאפשר לדעת מתי זה יהיה סימן אברון ספציפי ^6.

הספיגה של nanogold הטעון חיובי על ידי spheroplasts שמרים (כלומר. שמרים שבו תא הקיר הוסר אנזימים) בהצלחה נעשתה שימוש כדי לזהות את שמרי endosomal מלתחות ^10. חלקיקים אלה מאוד להיקשר לשומנים טעונים השלילי המרכיבים את הקרומים הביולוגיים. כך מקורבי nanogold הטעונים חיובי עם ראש הממשלה, חודרים את התא על ידי אנדוציטוזה ועוברים דרך EE וLE לפני שהגיע לvacuole. חלקיקי זהב הקטנים אלה, עם זאת, אין לי גודל מתאים כדי להיראות על ידי EM. כדי להבהיר להם גלויים, הגודל שלהם יכול להיות מוגדל על ידי תגובות כימיות שיובילו לתצהיר של כסף או זהב סביב חללית זהב ^13-15. פיתחנו ויישמו בהצלחה גישת IEM מבוססים על שיטת Tokuyasu לבצע subcellularלוקליזציה לומדת ^8,16. שיטה זו מאפשרת ביצוע תיוג immunogold על שמרי הכנות עם רזולוציה מצוינת של המורפולוגיה ^8,17-24. יש לנו גם הקימו הליך שילוב פרוטוקול IEM זה עם תיוג nanogold של מערכת השמרים endosomal מלתחות ^6. שימוש בגישה זו יש לי מורפולוגית מאופיינת subclasses שונה של endosomes וultrastructurally בדקה מוטנטים עם סחר endosomal פגם ^6,25. יתר על כן, אנו מראים כי תיוג nanogold זה יכול להיות משולב עם labelings immunogold מתן האפשרות לחקור את ההפצה של חלבון של עניין באוכלוסיות endosome השונות. כאן אנו מציגים כיצד התיוג של מערכת השמרים endosomal עם nanogold מטען החשמלי חיובי מבוצע כמעט.

Protocol

1. Spheroplast הכנה

1. דגירה הלילה בשעה השמרים 30 מעלות צלזיוס ב10 מיליליטר של המדיום המתאים נקבע על ידי העיצוב של הניסוי.
2. היום אחרי, למדוד את הצפיפות האופטית של התרבות ב 600 ננומטר (OD ₆₀₀₎ באמצעות פוטומטר, לדלל תאים באותו מדיום תרבות ₆₀₀ OD של 0.2-0.4 ולגדל אותם לשלב גידול מעריכי, אלא אם כן את העיצוב של ניסוי דורש תנאים שונים. תאים נמצאים בשלב מעריכי כאשר התרבות יש OD ₆₀₀ של 1-2.
3. לאסוף 10 OD ₆₀₀ שווה של תאים על ידי צנטריפוגה ב3,500 XG במשך 5 דקות בצינור 50 מיליליטר. לאחר צנטריפוגה, לבטל את supernatant.
4. Resuspend התא גלולה ב 5 מיליליטר של 100 צינורות מ"מ (pH 9.6), 10 dithiothreitol מ"מ וטופחו ב30 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
5. לאסוף שוב את התאים על ידי צנטריפוגה ב3,500 XG במשך 5 דקות. בטל supernatant.
6. Resuspend התאים in 5 מיליליטר של מדיום (שנקבע על ידי העיצוב של הניסוי) המכיל 1 M סורביטול ו5 מ"ג של אנזים ממס, ודגירה את התערובת על 30 ° C עם הרעד עדין למשך 30 דקות.
7. צנטריפוגה ההשעיה תא XG 300 5 דקות כדי לאסוף את החלק יחסי גלולה, אשר תואם את spheroplasts. בטל supernatant.
8. Resuspend spheroplasts ב960 μl של תקשורת קרה כקרח (נקבע בינוני על ידי העיצוב של הניסוי) המכיל סורביטול 1 M ולהעביר את התערובת לקרה כקרח 2 מיליליטר צינור microcentrifuge.

2. Nanogold ספיגה

1. בעזרת פיפטה, לערבב בעדינות spheroplast עם 4 nmol של חלקיקים בעלי מטען חשמלי חיוביים nanogold resuspended ב40 μl מים. הנפח הסופי של התערובת צריך להיות של 1 מיליליטר.
2. מניחים את ההשעיה התא שהושגה על קרח במשך 15 דקות.
3. מעביר את ההשעיה בטמפרטורת חדר והדגירה אותו לזמן הנדרש כדי לאפשר הפנמת nanogold באמצעות דוארndocytosis.
   הערה: ספיגת 5 דקות בעיקר תוביל לתיוג של שלפוחית ​​endocytic ומדורי endosomal מוקדם, תוך ספיגת 15 דקות תאפשר לסמן את מערכת כולה endosomal (מוקדם וendosomes המאוחרת). פעמים דגירה ארוכות יותר (יותר מ 30 דקות) גם תאפשר לתייג vacuole.
   הערה: לא ניתן לבצע ניסויי תיוג Pulse-מרדף עם שיטה זו. לכן, כאשר התיוג לניתוח של LE, nanogold יהיה נמצא גם באתר ראש הממשלה וinEE.

3. קיבוע וחתך

1. לעצור את ספיגת nanogold על ידי הוספת 1 מיליליטר של מקבע כפול כוח [paraformaldehyde 4% (PFA), glutaraldehyde 0.4% (GA) במאגר M 0.1 PHEM (20 צינורות מ"מ, 50 HEPES מ"מ, pH 6.9, 20 מ"מ EGTA, 4 מ"מ MgCl _2)] המכיל סורביטול M 1 עד ההשעיה התא. שמר את הצינור בטמפרטורת חדר.
2. בעדינות להפוך ידני את צינורות micocentrifuge מספר פעמים במהלך 30 דקות (זה יאפשר לשמור spheroplasts בהשעיה) ואז צנטריפוגות אותו פעמיים ב1,700 XG במשך 25 שניות.
3. החלף את מקבע על ידי השלכת supernatant ועל ידי הוספת 1 מיליליטר של מקבע כוח סטנדרטי טרי (2% PFA, 0.2% GA במאגר M 0.1 PHEM) מכיל 1 סורביטול M ו דגירה עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר על גלגל מסתובב באיטיות.
4. לעבד את התאים לcryo-חתך כפי שתואר לעיל ^6. הערה: לקבלת נהלי שיפור ספיגת nanogold וכסף, הטיפול בחומצה התקופתית שתוארה בפרוטוקול שצוין לא שיש לבצע. הטיפול בחומצה התקופתית הוא permeabilize דופן תא ²⁶ טוב יותר אבל המבנה הזה כבר בוטל בדור של spheroplasts.
5. חותכים 50 cryosections הדק ננומטר ב-C ° -120 עם סכין יהלום יבש באמצעות ultramicrotome UCT כפי שתואר בעבר ⁸ ומניח אותם על פחמן Formvar המצופה 50 משתלב רשתות ניקל.

4. כסף שיפור לNanogold החלקיקים visualization

הערה: ההליך להכנת תערובות התגובה הוא בעצם אחד שצוין על ידי היצרן. עיבודים מעשיים באמצעות פרוטוקול זה, הופך את הליך שיפור הכסף יעיל ואמין על cryosections.

1. הסר את ערכת שיפור כסף מהמקפיא ולהפשיר אותו ב37 מעלות צלזיוס חממה או אמבט מים. כשהפשיר, הנח את הערכה בחממה 24 ° C להציב לתוך חדר חשוך עד לשימוש (ראה 4.7).
2. מניחים את צלחת החימום בחדר החשוך ולחמם אותו לטמפרטורה הסופית של 24 ° C.
3. מכסה את החלק העליון של צלחת חימום עם מגן פני השטח, צד מבריק, ולאבטח אותו עם קלטת.
4. הנח את Parafilm על Benchkote ולסמן את הקצוות עם טוש שחור כדי להיות מסוגל לראות את קצות Parafilm בחושך.
5. קלטת מדחום בחלק העליון של Benchkote לנטר את הטמפרטורה של פלטת החימום. בהדרגה להתאים את הטמפרטורה אם לא 24 ° C.
6. Plaלסה"נ צינור 50 מיליליטר עם מים מזוקקים כפולים וערכת שיפור כסף בפנים.
7. למלא את צלחות פטרי קטנות עם מים מזוקקים פעמיים, חימם מראש על 37 ° C. הנח את הרשתות במים, הדגימה צד למטה, ל30 דקות.
8. חזור על פעולה עוד פעם אחת 4.7 שלב זה.
9. העבר את הרשתות בקופסא האחסון ולהביא אותם לחדר החשוך.
10. יש לשטוף את הרשתות שוב על ידי עובר אותם (עם צד הדגימה למטה) על כמה טיפות של מים מזוקקים פעמיים ב24 ° C מונחות על Parafilm שתוקן על צלחת החימום.
11. ודא כי 9 טיפות מים נוספות מזוקקים כפולות מוכנות בParafilm, לשטיפה לאחר תגובת שיפור כסף.
12. כבה את האור ולוודא שכל האורות כבויים. כבה את האור האדום על.
13. קח את פתרונות A ו-B של ערכת שיפור כסף מן החממה 24 מעלות צלזיוס.
14. שים 6 טיפות הראשונות של הפתרון ולאחר מכן 6 טיפות של תמיסת B ב1.5 מ 'צינור l microcentrifuge, ולערבב היטב עם זכוכית פיפטה פסטר הימנעות לעשות בועות. הפתרון הוא די עבה ויש לו להיות מעורב באופן ידני עם טפטפת לפני סוף סוף vortexing את זה בקצרה.
15. שים את פתרונות A ו-B בחזרה בחממת 24 ° C ולהוציא את פתרון C.
16. הוסף 6 טיפות של תמיסת C ל/ B התערובת. אז לערבב שוב ראשון עם פיפטה פסטר ולאחר מכן על ידי vortexing, להימנע בועות.
17. השתמש באופן מיידי את התערובת הסופית על ידי הצבת טיפות (~ 20 μl / ירידה) על Parafilm.
18. עם פינצטה נקייה, אנטי מגנטית, הנח את הרשתות על התערובת (לדוגמא., תגובת כסף שיפור) במשך 6 עד 15 דקות בהתאם לשיפור (כלומר. הגודל של חלקיקי זהב) ביקש להתקבל.
19. הסר את הרשתות מהתערובת ולהעביר אותם בחלק העליון של המים מזוקקים פעמיים טיפות ב24 מעלות צלזיוס במשך שוטף. ראשית, להשתמש במהירות רצף טיפות 6 ולאחר מכן 3 טיפות עם 7 דקות זמן דגירה לכל טיפה, לפני שמפנה את האורות הדולקים.
20. המשך לשלב הבא, בין אם תיוג חיסוני זהב או מכתים קרום ²⁷ כדי להמחיש את התוצאה לחקירת EM.

תוצאות

על פי הפרוטוקול שהוצג, את המורפולוגיה של מערכת השמרים endosome יכולה להיות גישה על ידי א.מ. שידור. איור 1 מציג סוגים שונים של תאי endosomal שכבר הגיעו ולכן כותרתו עם nanogold. Nanogold משופר הכסף ניתן לראות באופן ברור כחלקיקים צפופים אלקטרונים. ההגדרות אופטימליות שהוקמו לשיפו...

Discussion

חיסוני אלקטרונים מיקרוסקופית הוא טכניקה המאפשרת שילוב של לוקליזציה של חלבונים עם הרזולוציה ultrastructural של הנשאים ואברונים שבו חלבונים אלה מתגוררים. זה חיוני במיוחד כאשר לומד את מערכת השמרים endosomal כי התאים שלה מופיעים מבני פיסוק כמו במיקרוסקופ פלואורסצנטי. לכן קשה להבח...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure)	Merck, Darmstadt, Germany	1,102,200,250
HEPES	Merck, Darmstadt, Germany	391,340
EGTA	Sigma, St louis, MO	E4378
MgCl2.6H2O	Merck, Darmstadt, Germany	1,058,330,250
DL-Dithiothreitol	Sigma, St louis, MO	D0632
Sorbitol	Sigma, St louis, MO	S1876
Positively charged Nanogold	Nanoprobes, Yaphank, NY	2022	store at -20 ̊C
HQ-silver™ enhancement kit	Nanoprobes, Yaphank, NY	2012	store at -20 ̊C
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma, St louis, MO	441244
Glutaraldehyde 8% EM grade	Polyscience, Inc. , Warrington, PA	216	store at 4 ̊C
Lytic enzyme	MP Biomedicals, Santa Ana, CA	153526	store at 4 ̊C
Parafilm M	Sigma, St louis, MO	P7793
50 meshes nickel grids	Agar Scientific, Stansted, United Kingdom	G209N
Cryo-immuno diamond knife 35 º	Diatome AG, Biel, Switzerland	N.A.
UCT ultramicrotome	Leica, Solms, Germany	N.A.
Formvar 15/95 resine	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA	15800
50 meshes nickel grids	Agar Scientific, Stansted, United Kingdom	AGG2050N
Parafilm	Sigma, St louis, MO	P7793
Grids storage box	Leica, Solms, Germany	162-50
Falcon 100mmx15mm petri dishe	Corning, Corning, NY	351029
Pasteur capillary pipettes 150 mm	Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands	10216234
1.5 ml microcentrifuge	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	72690001
50 ml tube	Bio-one, Alphen aan den Rijn, The Netherlands	210296
Benchkote surface protector	Whatman, Maidstone, United Kingdom	1159201