Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מדווחים טכניקה לייצור של micropockets בתוך ממברנות electrospun בי ללמוד התנהגות תא. באופן ספציפי, אנו מתארים שילוב של microstereolithography וelectrospinning לייצור PLGA (פולי (lactide-CO-glycolide)) ההתקנים ביולוגי קרני מצוידים בmicrofeatures.

Abstract

בעיות בקרנית משפיעות על מיליוני אנשים ברחבי העולם ולפגום באיכות חיים שלהם באופן משמעותי. מחלה בקרנית יכולה להיגרם על ידי מחלות כגון Aniridia או סטיבן ג'ונסון תסמונת, כמו גם על ידי גורמים חיצוניים כגון כוויות כימיות או הקרנות. טיפולים הנוכחיים (i) השימוש בשתלים בקרנית וכן (ii) השימוש בתאי גזע הרחיבו במעבדה ונמסרו על ספקים (למשל, קרום מי שפיר); טיפולים אלה בהצלחה יחסית, אך למרבה הצער הם יכולים להיכשל לאחר 3-5 שנים. יש צורך לתכנן ולייצר מכשירים בחומר ביולוגי של קרנית חדשים מסוגלים לחקות בפירוט את הסביבה הפיזיולוגית שבו תאי גזע נמצא בקרנית. תאי גזע limbal ממוקמים בימבוס (האזור העגול בין קרנית ולובן עין) בנישות ספציפיות הידועות כPalisades של וגט. בעבודה זו פיתחנו פלטפורמה טכנולוגית חדשה המשלב את שתי טכניקות ייצור חדשניות (microstereolithography וelectrospinning) עבור הייצור של ממברנות של קרנית המחקות לימבוס במידה מסוימת. ממברנות שלנו מכילות micropockets המלאכותי שמטרתם לספק הגנת תאים כPalisades של וגט לעשות בעין.

Introduction

הקרנית, רוב הרקמות החיצוניות המרכזיות avascular של העין, היא אחת הרקמות החשובות ביותר מעורבות בחזון 1. ישנם מספר סוגים של תאים השומרים על התפקוד של הקרנית. השכבה החיצונית ביותר העליונה של הקרנית מורכבת מתאי האפיתל שיכול להיות על 5-7 שכבות בעובי 2. שכבה זו מונעת פלישת חיידקים לתוך הקרנית 3 ומאפשרת כניסה של חמצן 4. זה כבר דווח כי תאי הגזע של שקר קרנית אפיתל בנישות או מאורות (עם גדלים של 120-150 מיקרומטר) באזור הפריפריה של הקרנית הידוע בשם 5,6 ימבוס. כתאי הגזע מתחלקים, תאי הבת המכונים גם תאי הגברה חולפים לנסוע אל מחוץ לנישות וכחטיבה ממשיכה התאים לנוע centripetally פנימה וכלפי מעלה וכתוצאה מכך תאי סופני מובחנים באזור קרני המרכזי 7,8. תאים אלה מחו באופן שגרתי כהרף עין האלקטרוניxposing תאים חדשים יותר מתחת 9.

בנוסף להיות המיקום של תאי גזע אפיתל, לימבוס גם משחק תפקיד בשמירה על כלי הדם בלחמית מאזור הקרנית 10. נזק לימבוס יכול להיגרם על ידי כוויות תרמיים / כימיות, קרינה וגם מחלות גנטיות 10. כאשר זה קורה, את מחסום ימבוס מתפרק מאפשר לתאי הלחמית להעביר על גבי הקרנית, vascularizing האזור, בגרימת כאב ועיוורון במקרים מסוימים. המצב ידוע כחסר בתאי גזע limbal (LSCD) 10.

מצעים טבעיים שונים דווחו כנישאי תאי גזע אפשריים לסיוע בהתחדשות של קרנית. לדוגמא, קרומים המבוסס על קולגן שמשו Dravida et al. 11 וראמה ועמיתים לעבודה 12 דיווחו על השימוש בהפיברין במחקר עם 112 חולים. כיום לעומת זאת השיטה הנפוצה ביותר של טיפולהוא להשתמש בקרום מי שפיר אנושי מבנק רקמות ותאי אפיתל limbal תרבות על פני השטח שלו 13,14. ברגע שmonolayer יצר, הקרום מי השפיר מודבק תא בצד לעלות על הקרנית הפגומה שבה יש את כל תאי הלחמית ורקמת צלקת הוסרו בניתוח ממנו לפני השתלת תאים זה 14. הקרום מי שפיר מדרדרת בתוך שבועות עד חודשים עוזבים את תאי האפיתל שצורפו לאזור הערום להתחדש האפיתל 15,16. טכניקה זו נוסתה בהצלחה בשיקום ראייה עם זאת יש עדיין כמה סוגיות מעשיות המגבילות את הספיגה הנרחבת שלה מבחינה קלינית. כקרום מי השפיר היא רקמה אנושית שהוא צריך לעבור בדיקות סקר באמצעות נהלי בנקאות רקמה טובים לפני שמשמש להשתלת תאים בחולים. הקרנה זה מורידה רק את הסיכון להעברת מחלות, אך לא יכולה לחסל אותו לחלוטין 17. בנוסף לכך היו דיווחים של השתנות בעמ 'erformance של הקרום מי השפיר עקב וריאציה בין תורם 18,19 ושיטות עיבוד שונים 19,20. לצד הקטן הסיכון להעברת מחלה יש דרישה למרכזי כירורגיים גישה לבנקי רקמות מנוהלים היטב, אינו זמינים לכל.

למרות שהקרום מי השפיר הוא מוצלח יחסית, יש צורך בפיתוח של חלופות חדשות סינתטיות מתכלות תא ספק לטיפול במחלה בקרנית. ספקים סינטטיים יהיו להתגבר על הצורך בבנקאי נהלים כמו גם ביטול הקטן סיכון להעברת מחלה ולהבדלים בין תורם. במובן זה, חומרים כגון 21,22 פוליאתילן גליקול וPLGA 23,24 נחקרו.

בפיתוח אלטרנטיבה סינתטית לקרום מי שפיר האדם יש גם האפשרות לעצב לתוכו תכונות רצויות בתקווה לעזור להישרדות של התאים בתרבית. Inclusion של microfeatures בתוך מכשירים ביולוגי לשליטה מסוימת של התנהגות תא הוא אזור מתפתח של עניין. מחברים רבים דיווחו עבודה לקראת הפיתוח של תאי גזע מלאכותיים נישות 25-30. קבוצה זו לאחרונה דיווחה יצירת ימבוס microfabricated PEGDA-biofunctionalized פיברונקטין המלאכותי עבור המשלוח של תאי האפיתל limbal 22 והמתודולוגיה לייצור של ממברנות מתכלות electrospun המכילות כיסי microfabricated לתמיכה של תאי אפיתל limbal יום 31.

מטרת עבודה זו היא לפתח טכנולוגיית ייצור חדשה לפיתוח של התקנים ביולוגי המכילים microfeatures המחקה במידה microenvironments בי תאי גזע מתגוררים בגוף. פיתחנו טכניקה המשלבת microstereolithography וelectrospinning המאפשרת הייצור של ממברנות microstructured מתכלות שמראות greaפוטנציאל t עבור יישומי התחדשות רקמות.

זה חשוב לשים לב שלמרות שבעבודה זו טכניקה זו הוחל הייצור של טבעות להתחדשות קרנית, הטכנולוגיה יכולה להיות מיושמת על הייצור של מכשירים להתחדשות של מגוון רחב של רקמות אפיתל, למשל, עור, דרך הפה epithelia רירית, מעי, בדרכי הנשימה, ושלפוחית ​​שתן. באופן ספציפי, במחקר זה פיתחנו קרום מתכלה סינטטי המתפקד באופן דומה לקרום מי השפיר, כדי לספק לתאי הקרנית. קרום זה מכיל micropockets של כ 300 מיקרומטר (גדול יותר ממאורות limbal של Pallisades של וגט (150 סביב מיקרומטר)). לבסוף, הקמנו פרוטוקול אריזה המאפשר הקרומים האלה להיות מאוחסנים ב-20 מעלות צלזיוס למשך יותר מ -6 חודשים בלי להראות שום סימנים של התמוטטות.

Protocol

הצהרת אתיקה: העיניים שימשו במחקר זה נעשו שימוש בבהתאם להצהרה על פתיחות למחקר בבעלי חיים:

1 ייצור של ממברנות מתכלים PLGA מצויד בMicropockets

  1. פיגומי הטבעת נוצרו על ידי שילוב של טכניקות microstereolithography וelectrospinning 31 ב. בעיקרו של דבר, ניתן לסכם את התהליך ב2 חלקי יצירה (i) של תבניות PEGDA ידי microstereolithography ו( ii) electrospinning על התבניות לרבייה של מבנה PEGDA בסיס (במקרה זה טבעת microfabricated). שני צעדים אלה מתוארים בפירוט בהמשך (איורים 1 ו -2).
    1. ייצור של תבניות PEGDA ידי microstereolithography (microSL)
      1. לפברק טבעות תוך שימוש במודל 2 שכבה, עם השכבה הראשונה (L1) להיות הבסיס של המבנה והשכבה השנייה (L2) מציגה 6 micropockets עם Morphologi הפרסהes במגוון של גדלים 300-500 מיקרומטר. הייצור של טבעות PEGDA תואר לאחרונה על ידי קבוצה זו 22.
        1. צור L1 ידי ציור עיגול 1.2 סנטימטר שחור באמצעות כל תוכנת ציור מתאימה.
        2. צור L2 באותה הדרך, אבל כולל 8 מבנים בצורת פרסה 0.5 x 0.35 מ"מ לבן. להפיץ צורות פרסה הלבנות הקטנות בתוך המבנה העיגול השחור.
        3. שמירת L1 וL2 בפורמט JPEG.
      2. בבקבוקון זכוכית כהה, לערבב diacrylate פוליאתילן גליקול (PEGDA, Mn = 250 גרם / mol) עם 1% w / w Camphorquinone, photoinitiator, על בוחש מגנטי עבור 20 דקות.
      3. הרחב את קרן הלייזר של microstereolithography באמצעות הסדר עדשה טלסקופית הגדרה ולאחר מכן להקרין את זה על גבי מכשיר מחשב לתכנות דיגיטלי multimirror (ערכת Starter-אפשר UV DMD). הערה: DMD משקף את התמונה (במקרה זה טבעת) על גבי מראה באמצעות עדשת צינור אורך מוקד 10 סנטימטר. התמונה מופנה לאחר מכן על ידי הכסף-CoAטד לשקף לתוך בקבוקון המכיל פולימר photocurable (PEGDA).
      4. התאם ולנקות בזהירות אופטיקה של microstereolithography להגדיר.
      5. שים 300 μl של תערובת PEGDA לתוך באר של צלחת תרבית רקמת 12 גם. ודא הבארות מראש מצופות בטפלון או חומר שאינו מקל אחר להסרת קלה של המבנה לאחר הריפוי.
      6. הפעל את הלייזר הכחול (MBL-III 473 ננומטר; 150 mW) ולהעלות L1 לתוך תוכנת ALP3 הבסיסית שהותקנו בעבר במחשב. מכשיר את השכבה הראשונה ל60 שניות. הערה: ALP3 הבסיסי הוא ממשק USB המספק את הקשר בין המחשב ומכשיר micromirror הדיגיטלי.
      7. הוסף לטוב 250 μl יותר של PEGDA, להעלות L2 כפי שתואר לעיל ולהקרין L2 ל60 שניות.
      8. הסר את הפולימר הדפוק ולשטוף את הטבעת עם O isopropanol / N.
    2. המצאה של מתכלה PLGA קרומים באמצעות electrospinning
      הערה: טבעות PEGDA שמשו כתבניתנגמר שPLGA היה electrospun עם PLGA לשחזר את הטופוגרפיה הבסיסית כפי שהוא הסתובב על תבניות אלו. אחרי ספינינג, הגיליון של פולימר PLGA התקלף מהאספן. קרום PLGA הסופי לא יכיל את טבעות PEGDA שנותרו מחובר לאספן המתכתי.
      1. הפץ טבעות PEGDA על גיליון אלומיניום electroplated (12 סנטימטר x 20 סנטימטר) ליצירת אספן electrospinning סטטי.
      2. צרף את הטבעות באמצעות קלטת פחמן מוליך. הערה: טבעות אלה נוצרו פעם אחת יכול להיות שימוש חוזר כתבניות לelectrospinning.
      3. הכן את פתרון הפולימר לטווייה. לפזר PLGA (50/50 DL-lactide (52% mol): glycolide (48% mol), 44 קילוגרם / mol) בdichloromethane (DCM) בשעה 20% w / w ריכוז.
      4. O מערבבים / N לפני השימוש.
      5. מזרקים מקום 4 אינסולין (להקהות מחטים הסתיימו, 0.8 סנטימטר פנימי קוטר) על משאבת מזרק. הערה: ארבעה מזרקים הבטיחו electrospinning המהיר יותר מאשר עבודה עם מזרק יחיד.
      6. לטעון 2.5 מ"ל של תמיסת PLGA בכל מזרק.
      7. באמצעות 30 μl / דקת קצב זרימת Electrospin ומתחים הנעים 12-15 ק. השאר מרחק בין המחטים והאספן של 15 סנטימטר.
      8. Electrospin עבור שעה 1 ו30 דקות ולבסוף לקלף בזהירות את סדין electrospun PLGA מהאספן תומך טבעות PEGDA.
      9. חותך את פיגומי electrospun ל22 חוגי קוטר מ"מ באמצעות אגרוף חור עגול ומשאירים את מבנה הטבעת ממוקם במרכז.

חפצים .2 לטווח ארוך של ממברנות microfabricated PLGA

הערה: טבעות PLGA היו מפוברקות ומעוקרות על ידי חברות חיצוניות מוכרים; דגימות היו מוקרנים בטווח מינונים חיצוני של 25-40 KGy.

  1. הר הקרום במכל קטן (צלחת פטרי פלסטיק) ומניח אותו בתוך שקית כיתה רפואית.
  2. השתמש בנייר מסנן כדי ליצור מסנן שקיות קטנות לdesiccants. To ליצור השקיות, לקפל את נייר הסינון (בקוטר מ"מ 125) ולחתוך בחצי עיגול וכתוצאה מהמחצית; אז לאטום את הקצוות יחד באמצעות קלטת.
    1. מלא שלוש שקיות נייר סינון עם 1 גרם של תפוז סיליקה, כלוריד קובלט (II), ונחושת גופרתית (II), בהתאמה.
    2. שים שלוש שקיות של יבוש בתוך התיק הרפואי הכיתה יחד עם קרום electrospun.
  3. הוסף לשקית כרטיס מחוון לחות שש נקודה זמינה מסחרי כדי לאתר את כל הצטברות לחות בתקופת האחסון.
  4. השתמש במכונת חותם חום ואקום ואקום ולאטום את התיק.
  5. שלח קרומי טבעת לחברה חיצונית לγ-הקרנה.
  6. חנות γ-מוקרן קרומי PLGA במגוון רחב של טמפרטורות של C ° -20 ל37 מעלות צלזיוס בסביבה לחה בתוך חממה המכילה 5% CO 2.
  7. אחסון הודעה, לבחון את מחוון לחות כדי לוודא שרמת לחות היא מתחת 30%.
  8. Use מיקרוסקופית אלקטרונים סורק (SEM) כדי להעריך את היושרה של סיבים.

.3 בידוד של Explants limbal

explants limbal ארנב היו מבודד מעיני ארנב (המתקבלות מחווה שבה ארנבים הם התרבו לצריכה).

  1. לחטא את עיני הארנב באמצעות תמיסת חיטוי (3%).
  2. נקה את העיניים על ידי הסרת כל רקמה עודפת המקיפה את הקרנית.
  3. הפרד את אזור limbal (זוהה כאזור עגול דק שבין הקרנית (השקופה) ולובן העין (לבן)) משאר הקרנית באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה.
  4. חותך לפלחים (כ -1.5 סנטימטר) תחת מיקרוסקופ לנתיחה.
  5. לחטא את מגזרי limbal בתמיסת חיטוי 1.5% דקות 1.
  6. חותך את פלחי limbal לחתיכות קטנות (100-500 מיקרומטר) עם להב סכין מנתחים.
  7. אחסן את החתיכות הקטנות של רקמה בתקשורת והתרבות (DMEM + Glutamax: F12 Ham's (1: 1), 10% בסרום שור עוברי, 1 U / עט מ"לicillin, 100 מ"ג / מ"ל סטרפטומיצין, 2.5 מיקרוגרם / מ"ל amphotericin, 10 / מ"ל ng של EGF, ו5 מיקרוגרם / מ"ל של אינסולין) בשעה 37 ° C ו 5% CO 2 עד לשימוש (לא יותר מ60 דקות).

.4 תולדה של תאים מExplants limbal

explants limbal ארנב הונח על שני קרומים טריים הסתובבו microfabricated והקרומים שהיו ומאוחסן במשך 6 חודשים ב -20 מעלות צלזיוס באריזת ואקום.

  1. מעיל פיגומי טבעת עם 15 μl של דבק הפיברין (1: תערובת 1 של פיברינוגן מפלזמה אנושית בריכוז של 18.75 מ"ג / מ"ל ​​ותרומבין מפלזמה אנושית בריכוז של 2.5 U / ml) באמצעות מגרד תא להפצת הפיברין באופן שווה.
  2. הנח את explants הרקמה ישירות על micropockets PLGA באמצעות 25 מחט G ומיקרוסקופ לנתח.
  3. הוסף מדיה תרבית תאים מאוד בעדינות כדי למנוע ניתוק explants.
    1. שינוי בתקשורת כל 3 ימים (מתכון תקשורת מתואר בסעיף 3.7) וkיפ בתרבות עבור 2 שבועות בחממת humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  4. לתקן את הדגימות עם .3.7% פורמלדהיד שנאגרו עבור 10 דקות ואחריו 3 שוטף עם PBS.
  5. Counterstain על ידי דגירה ב1 מיקרוגרם / מ"ל ​​של 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) או יודיד propidium (PI) ל10 דקות ב RT.
  6. לשטוף 3 פעמים ב PBS ולאחסן הדגימות מכוסות בנייר כסף.
  7. תמונת הדגימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי באורכי גל של 543 ננומטר ו800 ננומטר (שני פוטונים).

.5 מודלי הקרנית 3D ארנב פצוע קמה

  1. לנקות ולחטא את עיני הארנב כפי שתואר לעיל.
  2. פצע עיני ארנב על ידי שיקוע שלהם ב0.14% אמוניום הידרוקסיד למשך 5 דקות.
  3. יש לשטוף את העיניים בPBS ולגרד ממנו את האפיתל עם סכין sclerotome.
  4. לחתוך ולבודד את כפתור הקרנית-scleral הסרת כל רקמה שנותרה.
  5. הנח את קרניות הצד אפיתל מטה אלכוס וסטרילי למלא עם אגר 0.5% תוצרת DMEM.
  6. לאחר הגדרה, לשים בצד אפיתל הקרני עד, בצלחות פטרי קטנות ולהוסיף מדיה תרבות (מתכון שתואר לעיל) עד ​​לאזור limbal. הערה: אין לכסות את כל הקרנית; לשמור על תרבות האיבר בממשק האוויר הנוזלי.

.6 בידוד של Explants limbal והכללה של טבעת פיגומים במודלי הקרנית 3D ארנב

  1. מעיל קרומי טבעת עם 15 μl של דבק הפיברין (1: 1 תערובת של פיברינוגן בריכוז של 18.75 מ"ג / מ"ל ​​ותרומבין בריכוז של 2.5 U / ml) .Use מגרד תא כפי שתואר לעיל.
  2. הנח את explants הרקמה ישירות על micropockets PLGA באמצעות 25 מחט G ומיקרוסקופ לנתח.
  3. מניחים את הטבעות עם explants הרקמה על הקרניות הערומות עם explants פונה כלפי מעלה ובתנאי ממשק אוויר נוזלי. (תנאים אלה תוארו בעבר 22).
  4. לשמור על המודלים תרבות איבר ל4 שבועות בחממה humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לשנות את התקשורת בכל 2 ימים.

.7 הערכה של קרנית התחדשות וגזע תחזוקה נייד

  1. לאחר 4 שבועות, לתקן את הקרניות באמצעות פורמלדהיד .3.7%.
  2. לעבד את הקרניות להיסטולוגיה הקונבנציונלית כדי לייצר 6 מיקרומטר חלקי פרפין.
  3. כתם עם hematoxylin ו eosin (H & E).
  4. לimmunocytochemistry, dewax הסעיפים בקסילן (3min) ורעננותם ב100% אתנול (1 דקות), 70% אתנול (1 דקות), ומים מזוקקים (2 דקות).
  5. להתוות את החלקים באמצעות עט Dako כדי לתחום אזורים קטנים ולהימנע משימוש מופרז בנוגדן.
    1. פנק את האזורים שמסומן עם טריפסין 0.05% (100 μl) עבור 20 דקות (37 מעלות צלזיוס).
  6. לשטוף ביסודיות עם PBS ולהוסיף סרום של 10% עזים (חסימה) 100 μl עבור שעה 1.
  7. דגירה הדגימות עם של cytokera נוגדן חד שבטי עכבר 100 μlפח 3 (CK3) ושל p63 100 μl בO הסרום של 1% עזים / N ב 4 ° C..
  8. לשטוף עם PBS ולטפל עם נוגדן biotinylated המשני אנטי עכבר 100 μl (1: 1,000 ב1% עזים בסרום) לשעה 1 בRT.
  9. הוספה של FITC-streptavidin 100 μl (1: 100 ב1% עזים בסרום) ל30 דקות ב RT.
  10. פנק את הדגימות עם DAPI כפי שתואר לעיל.
  11. תמונת הדגימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי באורכי גל של 800 ננומטר (שני פוטונים) ו488 ננומטר.

תוצאות

טבעות electrospun microfabricated יוצרו באמצעות שילוב של microstereolithography וelectrospinning (איורים 1 ו -2). טבעות PEGDA בגדלים שונים היו מפוברקות באמצעות microstereolithography (איור 3); טכניקה זו מאפשרת למבני הייצור בצו של סנטימטר וההתאגדות בו זמנית של microfeatures. במקרה זה, טבעות של קטרים ​​הנעות 1.2-1.6 סנטימטר המכיל micropockets של 350-500 מיקרומטר היו מפוברקים (איור 4).

במונחים של ייצור, עיקור ואריזה של חומרים לשימוש קליני בעתיד נמצא כי אריזות ואקום בשקיות כיתה רפואיות שיפרו את היכולת להשיג אחסון לטווח ארוך של ממברנות PLGA (איור 5) באופן משמעותי; השימוש בשקית כיתה רפואית (PET / לסכל / פוליאתילן) עם עובי של 0.12 מ"מ אפשר לנו להשיג חיי מדף ארוכים יותר. זה נחקר על ידי שליחת membranes למשתפי הפעולה שלנו בהודו וקרומים אוחסנו לתקופה של חודשים ב -20 מעלות צלזיוס, ב RT ועל 37 מעלות צלזיוס בתנאים בכוונה לחים (חממה לחה). איור 5 מראה כי שימוש בתנאים במכוון הפרובוקטיביים של אחסון ב 37 C ° בתנאים לחים, קרומים היו רק יציבים למשך כ 1 חודש תחת שאינו ואקום ארוז תנאים, אך השיגו אחסון 3 חודשים בתנאי ואקום ארוז (איור 5 ובלוח 1).

טבלה 1 מדגימה את השיפור בתנאי אחסון שניתן להשיג גם בתנאים שנבחרו להיות תורם לספיגת מים וסיבים תזונתיים נפיחות אם אחד מקדיש תשומת לב לבחירה של תיק משמשת.

הטבעות נתמכות תולדת תא מexplants limbal בתנאים שונים (i) טבעות טריות וכן (ii) טבעות מאוחסנים במשך 6 חודשים (איור 6). תא העברה הושגה לאחר 4 שבועות כאשר pl acing קרומי PLGA על מודלים 3D פצועים. תאי צמח מתוך מexplants הרקמה מונח על קרומי יצירת אפיתל חדש על הקרניות הערומות בעבר (איור 7). חיוביות (קרניות ללא כל טיפול) ובקרות שליליות (קרניות פצועים) גם נשמרו בתרבות לתקופות של זמן. הבקרות השליליות אישרו את חוסר ההיווצרות של האפיתל חדש בהעדר כל תאים הוסיפו. Immunocytochemistry הוכיח כי התאים צומחים מתוך מexplants היו תאי האפיתל של קרנית מאז שהיו חיוביים לCK3 סמן בידול הקרנית (איור 7E).

figure-results-2331
איור 1 סכמטי של microstereolithography להגדיר ליצירת טבעות PEGDA.

her.within-page = "תמיד"> figure-results-2648
איור 2 סכמטי של electrospinning תהליך באמצעות טבעות PEGDA microfabricated כתבניות.

figure-results-2967
איור 3 (א) מראה דוגמא של אספן סטטי (גיליון אלומיניום electroplated עם טבעות PEGDA) לספינינג של קרומי PLGA microfabricated. (B) ו( E) מראה מחצלות electrospun שונות שקלפו מאספני סטטי. מופעים (C) תבניות PEGDA בגדלים שונים המדגישים את הרבגוניות של שימוש microstereolithography עבור הייצור של משטח הבסיס. (D) מראה העתק PLGA microfabricated."Target =" /files/ftp_upload/51826/51826fig3highres.jpg _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-3702
איור 4 תמונת SEM של טבעת PEGDA עם microfeature פרסה (); תמונת SEM הגדלה גבוהה של כיס microfabricated (B). תמונה בניגוד שלב של טבעת PLGA עם microfeature פרסה (ג); תמונה בניגוד שלב הגדלה גבוהה של כיס microfabricated (D). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-4371
איור אפקט .5 של טמפרטורה וזמן במערכות אחסון של ואקום ולא ואקום ארוז PLGA (50/50) ממברנות (44 קילוגרם / mol) עם טבעות-מפוברק מיקרו מעל 6 חודשים. יושרת ממברנה, נכבש כסיבים בשלמות באופן מלא (+++), כמה סיבי נפיחות (++), סיבי מיזוג (+) או לא סיבים ללא פגע (-). תמונות SEM ושלושה desiccants (כתום סיליקה, קובלט (II) כלוריד, והנחושת (II) סולפט) לא מראים שינויים בשלמות סיבים או לחות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-5130
איור 6 תמונות הקרינה מראה תולדה של LEC מexplants limbal על טבעות PLGA מתכלות טריות (A, B) ועל טבעות לאחר אחסון 6 חודשים ב -20מעלות צלזיוס (C, D). תמונות () ו (ב) מתאים לתאים מוכתמים DAPI (כחול) ויודיד propidium (אדום) בהתאמה. תמונה ב הוא נוף מאונך מz-ערימת confocal של explant מונח על כיס microfabricated. תמונות (C) ו( ד ') מראים צביעה חיובית לp63 (ירוק). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-5924
איור 7 (א) מראה מודל קרנית ארנב פצוע עם explants פיגום ורקמת טבעת נמצא על הפיגום שהיה מצופה בעבר עם דבק הפיברין (ב) ו (ג) הם בקרות חיוביות ושליליות.; הביקורת החיובית היא רב טרי . קרנית t והבקרה השלילית קרנית שבו האפיתל הוסר במכוון (הבקרה השלילית הייתה גם בתרבית למשך 4 שבועות) (ד) היא תמונת H & E של קרנית רקמות מהונדסת לאחר 4 שבועות בתרבות; איור מציג את האפיתל רב שכבתי החדש שהוקם על ידי התאים שיוצאים מexplants מונח על הנישות (E) היא תמונת immunocytochemistry מראה תולדת תא מexplant limbal.; גרעיני מגואלות DAPI (כחולה) והתאים מראה צביעה חיובית לcytokeratin 3, סמן קרנית בידול (ירוקה). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

PLGA (50/50)
יום 0 חודש 1 חודש 2 חודש 3 חודש 4 חודש 5 חודש 6
ללא אבק ארוז +++ - - - - - -
עובי בשואב אבק (תיק) (PE, PA Composite): 0.14 מ"מ +++ + - - - -
בשואב אבק (תיק B) (PET / לסכל / פוליאתילן) עובי: 0.75 מ"מ +++ +++ +++ + - - -
x; "> שלמות סיבים לממברנות המאוחסנות על 37 מעלות צלזיוס לחות 64px; "> -

(50/50) קרומי אפקט .1 טבלה של שקיות ואקום ואחסון שונה בשלמות PLGA (44 קילוגרם / mol) בחן מעל 6 חודשים של אחסון. יושרת ממברנה, נכבש כסיבים בשלמות באופן מלא (+++), קצת נפיחות סיבים (++), מיזוג סיבים (+) או לא סיבים ללא פגע (-).

Discussion

מחקר זה מתאר (א) טכניקה לייצור של ממברנות electrospun מכיל microfeatures בתוכם וכן (ב) כיצד להכין קרומים כאלה לשימוש קליני על ידי אריזת ואקום, קרינת גמא ולאחר מכן אחסון לפני שימוש. ביישום מסוים זה פיתחנו ממברנות PLGA מכילות micropockets המחקה את התכונות הפיזיות של הנישות של תאי גזע limbal. מטרותיו של מחקר זה הן (i) כדי לתאר את השיטות לספק לקוראים עם הידע הדרוש כדי לתכנן ולייצר פיגומים המכילים microfeatures לחקר התרומה של נישות של תאי גזע להתחדשות רקמות וכן (ii) כדי לספק את הקורא עם הבנה טובה יותר כיצד לאחסן פיגומי electrospun לפרקי זמן ארוכים.

במונחים של יישום קליני, האחסון של קרומי הטבעת הוא בעלת חשיבות עליונה. בעבודה זו, את ההשפלה של הטבעת נחקרה על פני תקופה של 6 חודשים. השפלה שלקרומים הוא מונעים על ידי הידרוליזה כך פשוט על ידי שמירה על ממברנות לחות ללא התהליך נעצר. בלקווד et al. דיווח כי על ידי שינוי היחס של PLA לPGA, השפלה של הקרום משתנה 32. מחקר זה הראה גם כי על ידי הגדלת הכמות של PGA, קצב הפירוק של קרומי electrospun מוגבר in vivo 22. כאן זה כבר הראה כי עם ואקום אריזת הקרומים יחד עם כמה יבוש והקרנתם ואחסונם בטמפרטורות נמוכות למשך 6 חודשים, אין שינוי בשלמות הסיבים והשפלה. נכון לעכשיו, 6 חודשים הוא ככל שלמדנו עם הקרומים האלה מכילים micropockets אבל נתונים אחסון לשנה 1 דווחה על קרומי electrospun רגילים ב -20 מעלות צלזיוס 22 ועכשיו יש לנו נתונים שלא פורסמו לאחסון שלהם ב -20 ° C 2 שנים ללא כל סימנים של השפלה. כך עבור אחסון לטווח ארוך זה יהיה מומלץ לאחסן אותם יבש ב-206; C אבל זה אפשרי לאחסן אותם ב RT גם בהודו במשך לפחות 6 חודשים (ואולי עוד הרבה זמן). הכללתו של מדד לחות נותנת אמצעי קל של בדיקת שהאריזה שמרה קרומים יבשים ובמקרה כזה הם יהיו כשירים לצורך.

העברה של תאים מטבעות אלה לדגמי קרנית 3D הוצגה בעת ביצוע explants limbal בתוך micropockets. קבוצה זו דיווחה לאחרונה על העברה של תאים על במבחנה מודל קרנית ארנב על ידי הצבת explants על קרומי PLGA רגילים (ממברנות ללא מבני טבעת) 24. באמצעות העברת תא פיגומי microfabricated הנוכחית כבר נלקח צעד אחד קדימה כפי שאנו יכולים כעת באופן ספציפי לאתר explants רקמה בתוך microfeatures. היכולת להציב explants ישירות בתוך הנישות גם מאפשרת למנתח להשתמש בממברנות ישירות בתיאטרון כירורגית למנוע את הצורך של חדר נקי לראשון להרחיב את תאי גזע limbal. למרות שפיסת wor זהk כבר מתמקד בפיתוח התקנים לטיפול במחלת קרנית, טכנולוגית microfabrication זה יכול להיות מיושמת גם לפיתוח מכשירים ליישומים רבים אחרים. לעבוד בעתיד יהיה לחקור את הייצור של מבנים להתחדשות של רקמות אחרות כגון עור ועצמות.

בעוד העיצוב והייצור ראשוני של microstructures PEGDA יכולים להיות זמן רב, פעם אחת מפוברק ניתן לעשות שימוש חוזר במבנים פעמים רבות ללא השפלה. לכן, הייצור הבא של ממברנות מתכלות PLGA microstructured ידי electrospinning יכול להתבצע בקצב דומה לייצור של ממברנות רגילים ('בלתי מובנים') בעקבות ההרכבה של האספן. למרות בעבודה זו השתמשנו microstereolithography עבור בודה התבניות, שיטות ייצור אחרות כגון 3D-הדפסה או הזרקה יכולות לשמש גם. בהתאם לכך, העובש שבבסיס יכול להיות עשויים מפולימרים או מתכות אחרים במקום PEGDA. ככזה בטכניקה זו היא מאוד תכליתית וחוקרים יכולים בקלות להתאים את השיטה כדי להתאים לצרכימים שלהם ומתקנים.

הגדרת microstereolithography הבית ב- שימשה במחקר זה לא יאפשר ההכנה של מבנים עם תכונות תחת 30μm; זו היא לא מגבלה עבור היישום קרני שתואר כאן, אבל זה יכול להיות מכריע בעיצוב של דגמים אחרים. שבטכניקות אחרות מקרה פילמור כגון 2 פוטון (2PP) יכול להיות עניין עם זאת טכניקת electrospinning יכולה שלא לאפשר הרבייה של מבנים בקנה המידה תת מיקרון (היום זה נחקר על ידי הקבוצה שלנו).

שלבים קריטיים בתהליך הייצור הם (i) הימנעות overcuring של תבניות PEGDA אשר יכול להיות נשלטו על ידי התאמת זמן וכמויות של photoinitiator. (Ii) שליטה תנאי electrospinning כגון טמפרטורה ולחות. (Iii) אחסון כראוי electrospuקרומי טבעת n באמצעות ואקום ומוצרי החלב וdesiccants.

לסיכום, על ידי הצבת explants רקמת limbal בתוך microfeatures של הקרום שהראינו תוצאה תא מexplants על תחומי נישה, העברת תאים על גבי קרנית נפצעה ארנב ומחדש epithelization הבא של הקרנית. השפלה של הקרומים המאוחסנים בטמפרטורות שונות גם נחקרה ופרוטוקול אריזה המאפשר אחסון לטווח הארוך של ממברנות פותח, האחרון להיות חיוני בפיתוח ממברנות לשימוש קליני.

Disclosures

יש לי המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

We gratefully acknowledge funding from the Wellcome Trust Affordable Healthcare for India and an EPSRC Landscape Fellowship for Ilida Ortega as well as contributions from The Electrospinning Company Ltd.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Name of  reagents/material/equipmentCompanyCatalogue numberComments (optional)
Poly lactic-co-glycolic acidPuracPDLG5004
DichloromethaneSigma Aldrich Or Fisher270997 Or D/1850/17>99.8% contains 50-150 ppm amylene stabiliser
Digital Micromirror Device (DMD) Discovery 1100 Controller Board & Starter KitTexas Instruments1076N732 (UV)
473 nm LaserLaser 2000MBL-III150 mW
Poly (ethylene glycol) diacrylateSigma Aldrich475629Mn = 250g/mol              500 ml
DEMEM + GlutamaxFisher12077549
Ham’ s F12Labtech bioseraLMH1236/500
Fetal Bovine SerumLabtech bioseraFB-1090/50
EGFR&D236-EG-200
InsulinSigma Aldrich91077C-1G
AmphotericinSigma AldrichA2942-100ml
Penicillin/StreptomycinSigma AldrichP0781-100ml
DAPISigma Aldrich32670
Propidium IodideSigma AldrichP4864
ThrombinSigma AldrichT9326
FibrinogenSigma AldrichF3879
p63Sigma AldrichP3737
CK3Merck MilliporeCLB218
HematoxylinSLSHHS16-500ML
EosinSigma AldrichHT110232-1L
Medical grade bag (PET/Foil/LDPE) Peelable pouchRiverside Medical Ltd. Derby, UKFoil laminate PET/Foil/LDPE, (12,7,50)
gamma- irradiation (Sterilisation)Applied Sterilisation Technologies (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) - external dose range of 25-40KGyN/A
Silica gel orangeSigma Aldrich10087
Cobalt (II) chlorideSigma Aldrich232696
Copper (II) sulphateSigma-AldrichC-1297
Six spot humidity indicator cardSCC, USA6HIC200
Vacuum heat seal machineAndrew James UK Ltd, Bowburn, UKVS518
Andrew James Vacuum Sealer rolls 28cm X 40 metre rollsAndrew James UK Ltd, Bowburn, UKBR2805
Scanning Electron Microscopy (SEM)Philips/FEI XL-20 SEMN/A
Confocal MicroscopeZeiss LSM 510 METAN/A
Videne Antiseptic SolutionEcolab, Swindon, UKN/A3%

References

  1. Ambati, B. K., et al. Corneal avascularity is due to soluble VEGF receptor-1. Nature. 443, 993-997 (2006).
  2. Reinach, P., Capó-Aponte, J., Mergler, S., Pokorny, K., Tombran-Tin, J., Barnstable, C. J. Ophthalmic Diseases And Drug DeliveryOphthalmology Research. Ch 2, Ocular Transporters. 2, 17-46 (2008).
  3. Kinoshita, S., et al. Characteristics of the Human Ocular Surface Epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 20, 639-673 (2001).
  4. Fatt, I., Bieber, M. T. The steady-state distribution of oxygen and carbon dioxide in the in vivo cornea: I. The open eye in air and the closed eye. Experimental Eye Research. 7, 103-112 (1968).
  5. Shortt, A. J., et al. Characterization of the Limbal Epithelial Stem Cell Niche: Novel Imaging Techniques Permit In Vivo Observation and Targeted Biopsy of Limbal Epithelial Stem Cells. STEM CELLS. 25, 1402-1409 (2007).
  6. Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. British Journal of Ophthalmology. 89, 529-532 (2005).
  7. Thoft, R. A., Friend, J. The X, Y, Z hypothesis of corneal epithelial maintenance. Investigative Ophthalmolog., & Visual Science. 24, 1442-1443 (1983).
  8. Lehrer, M. S., Sun, T. T., Lavker, R. M. Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation. Journal of Cell Science. 111, 2867-2875 (1998).
  9. Djalilian, A., et al. Down-regulation of Notch signaling during corneal epithelial proliferation. Molecular Vision. 14, 1041-1049 (2008).
  10. Dua, H. S., Azuara-Blanco, A. Limbal Stem Cells of the Corneal Epithelium. Survey of Ophthalmology. Survey. 44, 415-425 (2000).
  11. Dravida, S., et al. A biomimetic scaffold for culturing limbal stem cells: a promising alternative for clinical transplantation. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 2, 263-271 (2008).
  12. Rama, P., et al. Limbal Stem-Cell Therapy and Long-Term Corneal Regeneration. New England Journal of Medicine. 363, 147-155 (2010).
  13. Koizumi, N., Inatomi, T., Suzuki, T., Sotozono, C., Kinoshita, S. Cultivated corneal epithelial stem cell transplantation in ocular surface disorders. Ophthalmology. 108, 1569-1574 (2001).
  14. Fatima, A., et al. Technique of cultivating limbal derived corneal epithelium on human amniotic membrane for clinical transplantation. Journal of Postgraduate Medicine. 52, 257-261 (2006).
  15. Nubile, M., et al. Amniotic membrane transplantation for the management of corneal epithelial defects: an in vivo confocal microscopic study. British Journal of Ophthalmology. 92, 54-60 (2008).
  16. Nubile, M., et al. In Vivo Analysis of Stromal Integration of Multilayer Amniotic Membrane Transplantation in Corneal Ulcers. American Journal of Ophthalmology. 151, 809-822 (2011).
  17. Dua, H. S. Amniotic membrane transplantation. British Journal of Ophthalmology. 83, 748-752 (1999).
  18. Gicquel, J., et al. Epidermal Growth Factor Variations in Amniotic Membrane Used for Ex Vivo Tissue Constructs. Tissue Engineering Part A. 15, 1919-1927 (2009).
  19. Connon, C. J., et al. The variation in transparency of amniotic membrane used in ocular surface regeneration. British Journal of Ophthalmology. 94, 1057-1061 (2010).
  20. Hopkinson, A., McIntosh, R. S., Tighe, P. J., James, D. K., Dua, H. S. Amniotic Membrane for Ocular Surface Reconstruction: Donor Variations and the Effect of Handling on TGF-β Content. Investigative Ophthalmolog., & Visual Science. 47, 4316-4322 (2006).
  21. Sitalakshmi, G., et al. Ex Vivo Cultivation of Corneal Limbal Epithelial Cells in a Thermoreversible Polymer (Mebiol Gel) and Their Transplantation in Rabbits: An Animal Model. Tissue Engineering Part A. 15, 407-415 (2008).
  22. Ortega, I., Deshpande, P., Gill, A. A., MacNeil, S., Claeyssens, F. Development of a microfabricated artificial limbus with micropockets for cell delivery to the cornea. Biofabrication. 5, (2013).
  23. Deshpande, P., et al. Using poly(lactide-co-glycolide) electrospun scaffolds to deliver cultured epithelial cells to the cornea. Regenerative Medicine. 5, 395-401 (2010).
  24. Deshpande, P., et al. Simplifying corneal surface regeneration using a biodegradable synthetic membrane and limbal tissue explants. Biomaterials. 34, 5088-5106 (2013).
  25. Wheeldon, I., Ahari, A. F., Khademhosseini, A. Microengineering Hydrogels for Stem Cell Bioengineering and Tissue Regeneration. Charlottesv Va. 15, 440-448 (2010).
  26. Moeller, H. C., Mian, M. K., Shrivastava, S., Chung, B. G., Khademhosseini, A. A microwell array system for stem cell culture. Biomaterials. 29, 752-763 (2008).
  27. Fisher, O. Z., Khademhosseini, A., Langer, R., Peppas, N. A. Bioinspired Materials for Controlling Stem Cell Fate. Accounts Chem. Res. 43, 419-428 (2010).
  28. Raimondi, M. T., et al. Three-dimensional structural niches engineered via two-photon laser polymerization promote stem cell homing. Acta Biomaterialia. 9, 4579-4584 (2013).
  29. Gobaa, S., et al. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nat Meth. 8, 949-955 (2011).
  30. Truckenmüller, R., et al. Fabrication of cell container arrays with overlaid surface topographies. Biomedical Microdevices. 14, 95-107 (2012).
  31. Ortega, &. #. 2. 0. 5. ;., Ryan, A. J., Deshpande, P., MacNeil, S., Claeyssens, F. Combined microfabrication and electrospinning to produce 3-D architectures for corneal repair. Acta Biomaterialia. 9, 5511-5520 (2013).
  32. Blackwood, K. A., et al. Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement. Biomaterials. 29, 3091-3104 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

91electrospinningmicrostereolithographyexplants limbal

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved