Мышь фетальной печени Культура Система рассекать гена-мишени Функции на ранних и поздних стадиях терминала эритропоэза

Резюме

Мы представляем в пробирке мыши плода систему культуры эритробласт печени, что рассекает ранние и поздние этапы терминала эритропоэза. Эта система облегчает функциональный анализ специфических генов в разных стадиях развития.

Аннотация

Эритропоэз включает динамический процесс, который начинается с решимости эритроидная пакетных единиц (БОЕ-ES) с последующим быстро делящиеся эритроидного колониеобразующих единиц (КОЕ-ES). После КОЕ-Эс, клетки морфологически узнаваемым и обычно называют терминальные эритробласты. Одна из проблем для изучения терминала эритропоэза является отсутствие экспериментальных подходов рассекать функций генов в хронологическом порядке. В этом протоколе, мы описываем уникальную стратегию, чтобы определить функции генов в ранних и поздних стадиях терминального эритропоэза. В этой системе, мышь плода Ter119 печени (маркер зрелых эритроидных клеток) отрицательные эритробластов очищали и трансдуцированных экзогенной экспрессии кДНК или малых РНК шпильки (shRNAs) для интересующих генов. Затем клетки культивировали в среде, содержащей факторы роста других, чем эритропоэтин (ЕРО), чтобы поддерживать их предшественников этап в течение 12 часов, позволяя экзогенные кДНК или shRNAsвыразить. Клетки были изменены на Epo среды после 12 часов, чтобы индуцировать дифференцировку и пролиферацию клеток, а экзогенные генетические материалы были уже выражены. Этот протокол облегчает анализ генных функций в ранней стадии терминального эритропоэза. Для изучения поздно терминала эритропоэз стадии, клетки немедленно культивировали в Эпо среду после трансдукции. Таким образом, эти клетки уже дифференцированы в поздней стадии эритропоэза терминала, когда были выражены трансдуцированных генетические материалы. Мы рекомендуем общее применение этой стратегии, которая помогла бы понять подробные функций генов в различных стадиях терминала эритропоэза.

Введение

Эритропоэза является процесс дифференциации мультипотентных гемопоэтических стволовых клеток в зрелые эритроциты. Это поэтапный процесс включает в себя формирование привержены эритроидная пакетных единиц (БОЕ-ES), быстро делящиеся эритроидные колониеобразующих единиц (КОЕ-Эс), и морфологически распознаваемых эритробластов ^1,2. Терминал эритропоэз из клеток-предшественников CFU-E включает в себя последовательную эритропоэтин-зависимые и независимые этапы ^2,3. На ранней стадии терминального эритропоэза, эритропоэтин (ЕРО) связывается со своим рецептором на поверхности клетки и индуцирует серию последующих сигнальных путей, которые предотвращают апоптоз клеток и способствуют быстрому клеточных делений и экспрессию гена ^1,4. В поздней стадии терминального эритропоэза, эритробласты пройти выход терминал клеточного цикла, хроматин и ядра конденсации, и экструзию высоко конденсированных ядер ^5.

Наше понимание терминалаэритропоэз значительно улучшилась за последние несколько десятилетий, что во многом благодаря успешному использованию нескольких в пробирке и в естественных мышиных моделях ^6-9. Среди этих моделей, в пробирке культуру мыши плода эритробластов печени предоставляет много преимуществ, включая простоту очистки клеток, быстро пролиферации и дифференцировки, и ближе имитировать человеческой эритропоэза ^10,11. В этой системе, большое количество клеток-предшественников эритроидного от мыши печени плода может быть легко изолированы от одной стадии очистки Ter119 (маркер для зрелых эритроидных клеток) негативных эритробластов. В течение двух дней культуры эритробластов, дифференцировки этих клеток можно контролировать с помощью проточной цитометрии анализа, основанного на поверхностной экспрессии рецептора трансферрина с (CD71) и Ter119 антигена ^12. Кроме того, энуклеации из терминальной дифференцировки эритробластов могут быть обнаружены с помощью ДНК-производителя (Hoechst 33342) ¹3. Кроме того, очищенные предшественники могут быть генетически модифицированы экзогенного выражения кДНК или малых РНК шпильки (shRNAs) для интересующих генов, что облегчает механистические исследования функций экспрессии генов на эритропоэз ^11,13,14.

С другой стороны, высокая скорость роста клеток может быть обоюдоострым оружием, так как трудно характеризуют функции генов в различных стадиях терминала эритропоэза. В большинстве случаев, трудно определить, является ли конкретные функции генов в ранней стадии терминального эритропоэза так как по времени кДНК или shRNAs выраженной, клетки уже прошли раннюю стадию. Чтобы решить эту проблему, мы разработали уникальную систему, чтобы вскрыть ранние и поздние этапы терминала эритропоэза. Для ранней стадии терминала эритропоэза, генетически модифицированные Ter119 отрицательные эритробластов культивировали в EPO-свободного среды, но содержащий фактор стволовых клеток (SCF), ИЛ-6 и FLT3лиганд сохранить свой ​​статус предшественников и позволяют трансдуцированных кДНК или ShRNA выражению ^13. Клетки были изменены на Epo, содержащей среду после 12 часов, чтобы индуцировать пролиферацию и дифференцировку клеток. Таким образом, когда клетки начали дифференцироваться, уже выразили трансдуцированных кДНК или shRNAs. Для поздней стадии терминального эритропоэза, Ter119 отрицательные эритробласты культивировали в ЭПО сразу среде, содержащей после трансдукции. Таким образом, можно проанализировать функции генов, представляющих интерес в поздней стадии терминального эритропоэза. Таким образом, широкое применение этой системы поможет рассекать функций генов в различных стадиях терминала эритропоэза.

протокол

Эксперименты, описанные в этом протоколе были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Северо-Западного университета Уходу за животными и использованию комитета.

1 Получение культуральной среде

1. Подготовьте фибронектина решение. Добавить 1 мл воды на одну ампулу человеческого фибронектина (1 мг). Оставьте раствор в капот культуры ткани в течение 30 мин без перемешивания. Передача общий объем жидкости в 50 мл PBS, чтобы получить конечную концентрацию 20 мкг / мл, и осторожно перемешать также. Сделать фибронектин раствор свежей перед нанесением на пластину (смотри ниже).
2. Подготовьте 50 мл ЭПО свободной среде (SCF среднего). Комбинат перечисленных ингредиентов в таблице 1. Среда может храниться при температуре 4 ° С в течение 1 месяца, когда только что приготовлен.
3. Подготовьте 50 мл ЭПО, содержащей среде. Комбинат перечисленных ингредиентов в таблице 2. Среду можно хранить при температуре 4 ° С в течение 1 месяца, когда только что приготовлен.

2 Фибронектин покрытием плиты

1. Добавить 1 мл раствора фибронектина в каждую лунку 6-луночного планшета (или 0,5 мл в каждую лунку 12-луночного планшета). Оставьте пластину в капот культуры ткани в течение 1 часа.
2. Промыть лунки стерильной водой в два раза и просушить на воздухе пластину.
3. Оберните пластину и сохранить в холодном помещении при температуре 4 ° C.

3 Очистка печени плода эритробласты

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте плода печень от E13 до E15 приурочен беременных мышей (C57BL / 6). E13.5 печени являются предпочтительными для максимизации выхода CFU-E предшественников. Для получения приуроченные беременных мышей, от 6 до 8 недель мужские и женские мышей помещали в одной клетке (обычно один самец с одним или двумя самками). Женский вагинальные пробки были проверены на следующее утро, чтобы определить, если спаривание прошло успешно. Первый день беременности было на следующий день после вилка был найден.

1. Подготовка клеток печени плода Всего
   1. Жертвоприношение МОВсебе на СО ₂ вдоха и смещения шейных позвонков. Спрей живота с 70% этанола для дезинфекции. Откройте живота с рассекает ножницы, чтобы удалить матку. Вымойте матку в 1x PBS.
   2. Проанализируйте плодов в стерильных условиях с использованием капюшон тканевой культуры и автоклавного инструментов и мыть в 1x PBS.
   3. Проанализируйте фетальные печень из плодов. Держите тело плода с одним пинцетом, осторожно потяните плода печень (розового цвета) от тела с другим пинцетом. Очистите печень плода пинцетом удалить связанные фиброзных тканей. Поместите все плода печень в свежую 1x PBS, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки.
   4. Механически нарушить плода печень с помощью пипетки вверх и вниз.
   5. Фильтр клеточной суспензии через сито 40 мкм клеток в 50 мл коническую пробирку. Гранул клетки при 800 х г в течение 5 мин.
   6. Аспирата супернатант и ресуспендирования клеток в 1 мл PBS с 10% FBS (примерно 8 E13.5 плода печеньна мл).
2. Очистка Ter119 отрицательных эритробласты
   1. Блок клетки с крысиным IgG (0,2 мг / мл) на льду в течение 15 мин.
   2. Без промывки или центрифугированием, добавить биотинилированного анти-Ter119 антитела к клеточной суспензии (1 мкг / мл). Выдержите в течение 15 мин на льду.
   3. Промыть в 1х PBS с 10% FBS (1:10) и центрифугируют при 800 х г в течение 5 мин. Ресуспендируют клеток в 1 мл PBS с 10% FBS.
   4. Добавить 75 мкл стрептавидин сопряжено с магнитными частицами и выдержать в течение 10 минут на льду.
   5. Добавить объем в 2,5 мл ЗФР, содержащим 10% FBS. Передача клеточной суспензии в 5 мл полипропиленовые трубки с круглым дном.
   6. Вставьте трубку в клеточной сортировки аппарата магнитного и инкубировать в течение 10 мин. Ter119 позитивные клетки будут приложить к стороне трубки. Одиноких Ter119 отрицательные эритробласты останется в суспензии.
   7. Налейте клеточной суспензии в новую 5 мл полипропиленовые трубки с круглым дном.
   8. Повторите шаги 3.2.6 и 3.2.7 для удаления остаточного Ter119 положительных клеток.
   9. Гранул клетки при 800 х г в течение 5 мин. Аспирируйте от супернатанта. Ресуспендируют клеток в 1 мл PBS, содержащей 10% FBS, и рассчитывать живых клеток трипановым синим.

4 Трансдукция Вирусы кДНК, кодирующей или ShRNA

1. Пластина очищенный Ter119 негативные фетальных клеток печени на 3-5 х 10 ⁵ / хорошо в фибронектина покрытием 12-луночного планшета (регулировать количество клеток, если используете другую тарелку).
2. Добавить полибрена до конечной концентрации 10 мкг / мл для облегчения вирусной трансдукции. Вращение инфицировать клетки с лентивирусов или ретровирусы, кодирующей кДНК или ShRNA, при 800 х г в течение 1-1,5 ч при 37 ° С.

5 Культура Трансдуцированные Ter119 Отрицательный мыши печени плода эритробласты

1. Чтобы проверить функции генов в ранней стадии терминального эритропоэза (Рисунок 1 пунктирными линиями).">
   1. Культура Трансдуцированные клетки в Европейской бесплатно средней (SCF среды) в течение 12 часов, чтобы позволить экспрессию трансдуцированными генов и поддержание состояния предшественников.
   2. Центрифуга клетки при 800 х г в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант. Ресуспендируют клеток в 1 мл среды, содержащей Epo в каждую лунку 12-луночного планшета.
   3. После культивирования в течение 24 или 48 часов, сбора клеток для дальнейших анализов.
2. Генный тест функции в поздней стадии терминального эритропоэза (рис 1 сплошные линии).
   1. Культура Трансдуцированные клетки сразу в Европейской содержащей среде.
   2. После культуре для 24 или 48 часов, сбора клеток для дальнейших анализов.

6 Окрашивание клеток, культивированных фетальной печени для проточной цитометрии анализа

1. Вымойте и ресуспендирования клеток в 1x PBS. Урожай 2 х 10 ⁵ культивируемые клетки для анализа проточной цитометрии.
2. Выдержитеклетки с флуорофоров-конъюгированного антитела течение 20 мин при комнатной температуре в темноте. Чтобы проверить дифференциацию, использовать APC сопряженных анти-CD71 и PE сопряженных анти-Ter119. Чтобы проверить энуклеации, использовать Hoechst 33342 пятно в дополнение к другим антителам.
3. Вымойте клеток с 1x PBS. Ресуспендируют клеток в 0,5 мл PBS, содержащим 1% FBS и пропидий йодида (PI) (1 мкг / мл), чтобы окрасить мертвые клетки и исключить их из анализа.
4. Проведение поток cytrometric анализ. Проанализируйте один цвет окрашенных и неокрашенных контрольные клетки сначала для регулировки и компенсации цитометра.

Результаты

Рисунок 1 описывает экспериментальные стратегии. Протокол состоит из двух независимых условий для таргетинга функции сигнальных молекул в ранних и поздних стадиях терминального эритропоэза. Ter119 отрицательные плода эритробласты печени были очищены от E13.5 мыши плода. Проточн?...

Обсуждение

Здесь мы представляем уникальную систему, чтобы хронологически проанализировать мыши плода терминала печени эритропоэз. За счет применения различных условиях культивирования, мы успешно расчлененный терминала эритропоэз в ранних и поздних стадиях. Это особенно важно, чтобы определ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Iscove's Modified Dulbecco's MediumIMDM (IMDM)	Gibco	12440-053
Fetal bovine serum (FBS)	GEMINI Bio-product	700-102P
Penicillin-Streptomycin solution	Hyclone	SV30010	100x
L-Glutamine	Hyclone	SH30034.01	200 mM
Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L)	BD Biosciences	14-8001-80
Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6)	GEMINI Bio-product	300-327P
Fibronectin	BD Biosciences	354008
Bovine Serum Albumin (BSA)	STEMCELL TECH	9300	10% stock in IMDM
Erythropoietin(Epo)	PROCRIT	NOC 59676-303-00	3,000 U/ml stock
Streptavidin particles Plus	BD Pharmingen	557812
EasySep Magnet	STEMCELL TECH	18000
Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml	FALCON	352063