3D-моделирование боковых желудочков и гистологического Характеристика Перивентрикулярные тканях человека и мыши

Резюме

Using MRI scans (human), 3D imaging software, and immunohistological analysis, we document changes to the brain’s lateral ventricles. Longitudinal 3D mapping of lateral ventricle volume changes and characterization of periventricular cellular changes that occur in the human brain due to aging or disease are then modeled in mice.

Аннотация

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional units of the ventricles are ciliated epithelial cells termed ependymal cells, which line the ventricles and through ciliary action are capable of generating laminar flow of CSF at the ventricle surface. This monolayer of ependymal cells also provides barrier and filtration functions that promote exchange between brain interstitial fluids (ISF) and circulating CSF. Biochemical changes in the brain are thereby reflected in the composition of the CSF and destruction of the ependyma can disrupt the delicate balance of CSF and ISF exchange. In humans there is a strong correlation between lateral ventricle expansion and aging. Age-associated ventriculomegaly can occur even in the absence of dementia or obstruction of CSF flow. The exact cause and progression of ventriculomegaly is often unknown; however, enlarged ventricles can show regional and, often, extensive loss of ependymal cell coverage with ventricle surface astrogliosis and associated periventricular edema replacing the functional ependymal cell monolayer. Using MRI scans together with postmortem human brain tissue, we describe how to prepare, image and compile 3D renderings of lateral ventricle volumes, calculate lateral ventricle volumes, and characterize periventricular tissue through immunohistochemical analysis of en face lateral ventricle wall tissue preparations. Corresponding analyses of mouse brain tissue are also presented supporting the use of mouse models as a means to evaluate changes to the lateral ventricles and periventricular tissue found in human aging and disease. Together, these protocols allow investigations into the cause and effect of ventriculomegaly and highlight techniques to study ventricular system health and its important barrier and filtration functions within the brain.

Введение

An эпендимные клеточный монослой линии желудочковой системы головного мозга, обеспечивающей двунаправленную барьерные и транспортные функции между спинномозговой жидкости (ликвора) и интерстициальной жидкости (ISF) ^1-3. Эти функции помогают держать мозг ядовито-бесплатно и в физиологического равновесия ^2,3. У людей потери частей этой подкладке из-за травмы или болезни видимому, не приводит к регенеративной замены, как и в других эпителиальных накладок; а появляется потеря эпендимных охвата клетки приведет к перивентрикулярного астроглиоза с сетчатой ​​астроцитов, охватывающих регионы лишена эпендимных клеток на поверхности желудочка. Серьезные последствия для важных CSF / обмена ИСБ и оформления механизмов можно было бы предсказать результат от потери этого эпителиального слоя ^1,2,4-7.

Общей чертой человеческого старения увеличивается боковые желудочки (вентрикуломегалия) и связанный перивентрикулярная отек качестве наблюдателей,ред МРТ и жидкости-ослабленный восстановления инверсии MRI (МРТ / FLAIR) ^8-14. Чтобы исследовать отношения между вентрикуломегалии и клеточной организации желудочка подкладке, посмертные последовательности человека МРТ были согласованы с гистологических препаратов бокового желудочка перивентрикулярного ткани. В случаях вентрикуломегалии существенные области глиозом заменил эпендимных покрытие клеток вдоль боковой стенки желудочка. Когда расширение желудочка не был обнаружен МРТ основе анализа объема, эпендимных клеток подкладка была цела и глиоз не был обнаружен по желудочка накладки ^6. Это комбинаторный подход представляет первые комплексные документации подробно изменения в клеточной целостности бокового желудочка с помощью облицовки Wholemount препараты порциями или весь боковой стенки желудочка и 3D моделирование объемов желудочков ^6. Некоторые заболевания (болезнь Альцгеймера, шизофрения) и травмы (черепно-мозговая травма)показать вентрикуломегалия как ранней нейропатологического функции. Денудации областей эпендимных клеток выстилки тем самым можно было бы предсказать мешать нормальной функции клеток эпендимных и компромисс гомеостатического баланса между CSF / ISF жидкости и растворенного обмена. Таким образом, более тщательное изучение изменений в желудочковой системе, ее клеточного состава, и следствие до основных или соседних структур головного мозга, в конечном счете начинают раскрывать больше о невропатологии, связанной с расширением желудочка.

Отсутствие мультимодальных данных изображений, и, в частности продольных последовательностей данных, вместе с ограниченным доступом к соответствующей образцы тканей гистологические делает анализ патологий головного мозга человека трудно. Моделирование фенотипы найдены в старения человека или заболевания часто может быть достигнуто с мышиных моделях и моделях животных стать одним из наших лучших средств для изучения вопросов о возбуждении заболеваний человека и прогрессии. Несколько исследований вздоровых молодых мышей описали цитоархитектуры из боковых стенок желудочка и нишу, лежащий в основе стволовых клеток ^4,7-15. Эти исследования были расширены, чтобы включить 3D-моделирования и анализа сотовой стенок желудочков через ^6,15 старения. Ни перивентрикулярная глиоз ни вентрикуломегалия наблюдаются у мышей в возрасте, а мыши обнаруживают относительно надежный subventicular зона (СВЗ) стволовых клеток нижележащих нишу на неповрежденной эпендимных клетки подкладка ^6,15. Таким образом, бастующие видоспецифичны различия существуют как в общем обслуживание и целостности облицовки боковой желудочек в процессе старения ^6,15. Поэтому, лучше всего использовать мышей, чтобы допросить условия, найденные в людях, различия между этими двумя видами необходимо охарактеризовать и соответствующим образом учитываться в любом моделирования парадигмы. Здесь мы представляем процедуры оценки продольные изменения в боковых желудочков и связанное перивентрикулярная ткани в обеих людях и мУз. Наши процедуры включают 3D-рендеринга и Волюметри обоих мыши и человека желудочков, и использование иммуногистохимического анализа вся гора препаратов перивентрикулярного ткани, чтобы охарактеризовать как сотовый организацию и структуру. Вместе эти процедуры обеспечивают средства для характеристики изменений в желудочковой системе и связанный перивентрикулярная ткани.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры животных были одобрены Университета Коннектикута IACUC и соответствует руководящим принципам NIH. Человек ткани и анализ данных и процедуры были в соответствии с утвержденной и Университета Коннектикута IRB и соответствует руководящим принципам NIH.

1. Мышь: Анализ Перивентрикулярные клеточную целостность и 3D моделирования бокового желудочка

1.1) Подготовка мыши бокового желудочка Стеновые тотальных

1. Подготовьте мышь боковой желудочек тотальных для иммуногистохимии (IHC), как описано ранее ^16,17.

1.2) Иммуногистохимия для боковой анализа желудочка

1. Fix и раздел мозга мыши ткани, как описано ранее ^18,19.
   1. Вкратце, мышей флеш транскардиальную с нормальным, при комнатной температуре раствор, до тех пор, пока органы очистили (обозначено бледно окраски), а затем при комнатной температуре 4% параформальдегида(PFA) в 0,1 М фосфатном буферном солевом растворе (PBS) до ткани застыл.
   2. Удалить мозг из черепа. Используйте ножницы радужной оболочки глаза рассечение вырезать из основания черепа вдоль стреловидного шва.
   3. Expose черепа и удаления мозг щипцами. Погружают мозг в 4% PFA фиксатором течение ночи при 4 ° С. Затем промыть 3 раза в течение 20 мин с PBS.
2. Подготовка серийных срезов для иммуногистохимического анализа и громкости.
   1. Использование микрохирургической скальпель, сделайте небольшой надрез в продольном направлении вдоль коры левого полушария, чтобы позволить идентификацию левого полушария от правого полушария, когда плавающие разделы иммуноокрашиванию.
   2. Накрыть фиксированной мозги в 3% агарозном для дополнительной структурной поддержки во время vibratome срезов. Теплый 3% агарозном в дистиллированной воде (вес / объем) до полного растворения с использованием либо микроволновую печь или горячую плиту.
   3. С бритвой, удалить хвостовой участок мозга в мозжечок скорональной вырезать, оставляя ровную и ровную поверхность. Применить супер клей на стадии ткани и поместите мозг на вновь сократить поверхность обонятельных луковиц, стоящих перед вверх.
   4. При жидкости раствор агарозы остынет до температуры чуть теплой на ощупь, применяются равномерно по мозгу, чтобы полностью накрыть весь мозг. Разрешить агарозном закрепить.
   5. Раздел агарозном заключен мозги коронки на vibratome в 50 мкм секций, с участков, расположенных последовательно в 24-луночный планшет, содержащий PBS, чтобы сохранить последовательном порядке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вообще 12 скважин используются для одного мозга, с коллекцией тканей, начиная 5 разделов до наблюдаем появление боковых желудочков, начиная с ячейки А1, двигаясь численно до B6 и езда на велосипеде А1. Это позволяет нескольким различимы разделы из того же мозга, который будет обработан в течение той же скважине. Для бокового желудочка анализа объема, сбор ткани прекратилось, когда боковой желудочекс и третий желудочек слияние, в результате чего примерно на 3 секции в скважине или 36 Всего форумов.
   6. Аспирируйте PBS использованием передачи пипетки, прикрепленную с микропипетки наконечник в 20-200 мкл, чтобы убедиться, что плавающие разделы не случайно атмосферный. Блок и проницаемыми плавающей секции в 10% сыворотки, 0,1% Тритон Х-100 (ТХ) в PBS (PBS-TX) в течение 1 ч при комнатной температуре. Используйте 300 мкл раствора на лунку, чтобы покрыть разделы свободно плавающих ткани в 24-луночного планшета и выполнять все инкубации разделов на качающейся пластины.
   7. Аспирируйте блокирующий раствор и инкубировать секций с первичными антителами в PBS-TX в течение ночи (по крайней мере, 12 ч) при температуре 4 ° С. Для желудочка объемом следов с использованием корональные разделы, используйте анти-антитела S100β маркировать эпендимных клетки.
   8. Аспирируйте решение первичного антитела и промыть разделах 3 раза в течение 10 мин каждый с PBS-TX.
   9. Выдержите разделы в темноте в течение 1 часа при комнатной темпераТуре с люминесцентными вторичными антителами в концентрации 1: 1000 в 10% сыворотки, PBS-TX. Держите секций в темно для всех остальных этапов инкубации.
   10. Аспирируйте раствор вторичного антитела и инкубировать секций с 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола в PBS (DAPI, 10 мкг / мл) в течение 5 мин, чтобы контрастное клеточные ядра. Аспирируйте решение DAPI и промыть разделах 3 раза в течение 10 мин каждый с PBS.
   11. Mount разделы серийно на слайды с помощью корковой знак, чтобы сохранить оставили против правого полушария ориентации. Воздух сухой секции в темноте, а затем покровное путем применения тонким слоем монтажных СМИ к слайду и аккуратно поместить стекло покровное на вершине. Разрешить coverslipped скользит высохнуть в течение ночи при комнатной температуре.

1.3) бокового желудочка Сегментация для 3D реконструкций

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните трассировку боковых желудочков с помощью программного обеспечения отображения на вертикальном эпифлуоресцентной microscoПЭ с автоматизированной стадии и цифровой камерой CCD для регистрации флуоресценции.

1. Включите микроскопа оборудования флуоресценции и запуска программного обеспечения отображения в режиме флуоресценции. Откройте "Показать параметры", чтобы загрузить соответствующие панели инструментов и панели док-инструмента, необходимых для отслеживания. Функции> Показать параметры> Аксессуары и выберите 'Main' и панели инструментов "Маркер". В этом же меню, выберите 'Camera гистограмма', 'Многоканальный управления »,« Настройки камеры »и« Приобретение изображения в разделе' Панели инструментов Док.
2. Соблюдайте начало желудочков, основанных на сильном S-100β флуоресценции, которая маркирует эпендимных клетки, которые выстилают боковой желудочек. Определить первый кусок ткани, содержащий боковые желудочки.
3. Создайте новый файл данных и назначить опорную точку для сценического движения, нажав в окне изображения выше левого бокового желудочка. Посмотрите на небольшойРазрез ориентироваться слева от правого полушария. Держите опорную точку в последовательной месте по отношению к боковых желудочков через отслеживание файлов, чтобы помочь при импорте контуров для последовательного восстановления.
4. Выберите подходящий тип контура предварительно от контура выпадающего меню, например, "левого бокового желудочка. Используйте уникальный цвет для каждого из левого и правого боковых желудочков кальки. Если изменения в названия контура и цвета требуется, перейдите к Функции> Настройки> Показать контуры, а затем изменить имена контурных цветов или выбрать "Добавить контура Тип".
5. С контура в "левого бокового желудочка 'выбран, нажмите по апикальной поверхности футеровки эпендимных начать контур трассировки. Проследите желудочек, продолжая последовательно нажмите по апикальной поверхности.
   1. Для нерегулярных областях, требующих больше изящества, нажмите и удерживайте левую кнопку мыши для того, чтобы проследить свободной рукой. Нажмите Ctrl + Z, или пойти тО Опции> Undo, чтобы отменить предыдущую точку контура. Перемещение кальку окно, используя клавиши со стрелками или путем точки контура от экрана и позволяет окно автоматически центрироваться. Чтобы закончить желудочек трассировки правой кнопкой мыши и выберите "Закрыть" Контур.
6. Выберите новый цвет контура (тип контура) для правого бокового желудочка с помощью выпадающего меню. Проследите правый желудочек, как в шаге 1.3.4 для левого.
7. Если изменения в названия контура и цвета требуется, щелкните правой кнопкой мыши на контуре и выберите Изменить контура Тип, чтобы выбрать подходящий цвет.
8. Добавить маркеры вдоль средней линии, чтобы помочь в выравнивании серийные контуры для 3D реконструкции. Чтобы добавить маркеры, выберите соответствующий маркер (используйте 'X') на панели инструментов Маркеры слева и нажать на кнопку еще их на экране трассировки. Импорт маркеры вместе с контурами для каждого раздела тканей следа.
9. Чтобы сохранить ткани следы, выберите Файл> СохранитьФайл данных Как и создать новую папку и имя файла. Количество обводка [слайд #] - [#] ткани для легкой идентификации следов от серийных срезов. Например, секция с третьими ткани на втором слайде имеет имя файла "2-3" в пределах каталога для каждого мозга.
10. Повторите шаги 1.3.4 1.3.9 для каждого последовательного части мозговой ткани, чтобы проследить желудочки через весь мозг, за исключением регионов желудочка стены адгезии.
11. Если желудочек имеет область адгезии, суб-сегмента передней области от тех спинной и брюшной к адгезии сайта. Создать два новых типа контура для каждого желудочка (например, «Спинной левого желудочка" и "Брюшной левого желудочка"). На первом тканей срез с адгезией, проследить боковой желудочек и с оригинальной боковой желудочек контура и новой спинных и брюшных контуров для обеспечения полной реконструкции желудочка может быть создан.
12. В разделах позади в ventriclстены адгезии е, создать множество новых цветов контурных для задней части каждого желудочка (например, «Задний левый желудочек"). Дважды проследить этот первый воссоединился раздел как с текущей адгезии и новых видов задняя контура.

1.4) бокового желудочка 3D реконструкция

1. Выравнивание и составить последовательный контур прорисовки мыши боковых желудочков генерировать 3D реконструкций и объемные данные.
2. Открыть 3D программа реконструкции. Нажмите Файл> Открыть и выберите файл контурную первый серийный прослеживается разделе. Импорт горизонталей прорисовки левой и правого желудочка, а также любые дополнительные маркеры.
3. Чтобы выбрать контуры, нажмите кнопку "Выбрать объекты" (значок курсора) и выберите два желудочка и маркеры, удерживая клавишу "Ctrl". Чтобы установить Z позицию контуров, щелкните правой кнопкой мыши и выберите "Изменить Z позиции. Установите первый кусочек ткани в 0 мкм.
4. Чтобы сохранить реконструкцию, выберите Файл> Сохранить файл данных как. Сохранить после каждого импорта файлов, так что если допущена ошибка восстановления, как легко, как перегрузка предыдущий файл.
5. Чтобы добавить следующий ткани ломтик реконструкции, нажмите Файл> Добавить к изображению. Выберите файл .DAT, который будет добавлен и флажок "Объединить".
6. Следуйте шаг 1.4.3 снова настроить Z позицию импортированного файла трассировки. Выберите только добавленных левые и правые контуры в главном окне, чтобы избежать перемещения других следов. Установка каждого последующего файла трассировки до 50 мкм из Z позиции предыдущего контура в течение 50 мкм секций. (Первый контур: г = 0, второй контур: г = 50, третий контур: г = 100, и т.д.)
7. Чтобы настроить X, Y позиции отдельных контуров и маркеров, нажмите "Включить перевод с помощью мыши 'кнопку, и тащить контуры по согласованию с предыдущими контурами тканей. Держите оба левые и правые контуры текущей трассы выбранДля синхронного движения.
8. Чтобы повернуть следы по часовой стрелке или против часовой стрелки, чтобы выстроиться средней линии маркеров, выберите кнопку 'оси вращения. Чтобы перевернуть контуры всей Y-оси (если слева контур справа) выберите оба импортные контуры и маркеры, щелкните правой кнопкой мыши, выберите 'Set' Угол поворота, и введите "180" в "Y ротации".
9. Убедитесь, что желудочки и средней линии маркеры лучше выровнены перед сохранением файла реконструкции, как в шаге 1.4.4.
10. Повторите шаги 1.4.5 1.4.9 для каждого последующего ткани ломтик, пока все не были импортированы и правильно выровнены.
11. Для просмотра объема данных последовательного реконструкции, нажмите анализ> "Маркеры и область Анализ" и выберите "3D Контур Сводка". Выберите все контуры в левой панели, а затем нажмите кнопку "3D визуализация" для отображения окончательного восстановления 3D.

2. Человеческий Анализ Перивентрикулярные клеточную целостность и 3D моделирования бокового желудочка

2.1) Анализ данных МРТ человека

ПРИМЕЧАНИЕ: Протоколы перечислены для создания 3D-реконструкции изображения и объемного количественного боковых желудочков и оценить объемные изменения с течением времени, используя продольный анализ наложения. Важно отметить, что последовательность в сборе МР данных (например, машины и силой магнита, толщины сечения, ориентации и разрешение) и обработки после приобретения крайне важные критерии для включения наборов данных ^20.

1. Желудочковая Сегментация
   ПРИМЕЧАНИЕ: ИТК / мгновенного используется для сегмента желудочки от T1-взвешенных МРТ высокого разрешения. В качестве альтернативы, другой бесплатной программы, такие как Freesurfer могут быть использованы.
   1. Открыть ИТК / мгновенного, Файл> Открыть изображение в градациях серого. Выберите нужный файл и открыть как .nii файла (NITFI файла).
   2. Прокрутка каждого Анатomical самолет, отметив желудочковая аномалии (суженный регионы, большие или малые временные рога, и т.д.). В основной панели инструментов нажмите кнопку "Snake ROI Tool". Нажмите кнопку "Segment 3D". Выберите опцию 'Интенсивность региона.
   3. Нажмите кнопку "Предварительная обработка изображения». Выберите «выше», чтобы включить регионы ниже определенного порога интенсивности, с тем чтобы подчеркнуть ROI в белом. Запишите максимальную интенсивность использования ползунка. Установите порог до 15% от максимальной интенсивности (запись этого значения). Установите параметр гладкость до 10. Нажмите "OK", затем "Далее".
   4. Добавить 10-12 небольшой размер (2) 'пузыри' на каждой желудочка: два в передней фронтальной рога, семь равномерно распределенных по верхней поверхности боковой желудочек тела, один в затылочной рога и один в височной рога бокового желудочка. "Выберите Параметры" и установить силу кривизны до 0,4. Нажмите Play, чтобы начать символ эволюции активное контур,
   5. Нажмите кнопку "Обновить" Mesh для визуализации поверхности; проверить 'Auto-Update'. Стоп сегментации, когда все области бокового желудочка включены в области интереса (ROI). Избегайте включения третьего желудочка. Нажмите кнопку "Готово".
   6. Вручную редактировать файл, если необходимо, чтобы удалить нежелательные области с помощью следующих методов (как правило, необходимо, чтобы стереть третий желудочек утечки). Вручную использовать '3D' скальпеля инструмент для удаления избытка регионы или вручную с помощью 'Кисть' инструмент с 'Clear Этикетка "в качестве активного чертежа метки, чтобы стереть любую включение пределами ROI.
   7. Сохранить результаты сегментации как .nii изображения (формат файла "NIFTI ').
   8. Чтобы получить общий объем желудочка, выберите 'Сегментация> Громкость »и статистики; получить общий объем желудочка, используя набор метку цвета.
2. Продольный Представление боковых желудочков От MRIScans
   ПРИМЕЧАНИЕ: ИспользованиеПрограммное обеспечение Манго, продольные трансформирования накладываются на качественно и количественно продемонстрировать изменения в объеме желудочка в пределах субъектов с течением времени.
   1. Открыть Манго. Нажмите Файл> Загрузить ROI в момент времени первый ROI (базового) как зеленый. Файл> Загрузить ROI второй момент времени ROI как красный. Сохранить продольную накладку, выбрав Файл> Сохранить как; назначить каждое изображение как 'файла name_ [Первая точка возрастной время] - [точка возрастной второй раз] .nii ".
   2. Откройте ИТК-SNAP. Повторно комбинированный ROI как «исходном изображении», выбрав сегментации> Load From Image> объединенного файла ROI. Для получения данных продольные объем выполните следующую: сегментация> Громкость и статистика> Метка 1 (красный) = объем расширения; Этикетка 2 (зеленый) = объем стеноз; Этикетка 3 (синий) = базовый объем.

2.2) Человеческий Перивентрикулярная Подготовка ткани и анализ

1. Инструкции по технике безопасности для работы с человеческой ткани
   1. Получить appropетел обучение технике безопасности (например,., ГКИ, конечно).
   2. Соблюдайте стандартные (универсальные) меры предосторожности. Надевайте перчатки. Изменить перчатки, прежде чем прикасаться любой общее оборудование или поверхностей, которые не одноразовые. Добавьте все детали обычно обрабатываются при работе с человеческой ткани с "использование человеческих тканей" обозначений.
   3. Следуйте практики обеззараживания для всех элементов, контактирующих тканей человека. Bleach все загрязненных жидкостей в течение как минимум 24 часов до утилизации, лечения загрязненных поверхностей с отбеливателем пропитанной полотенцем (например, скамейка верхней) или путем размещения объекта непосредственно в отбеливателем (например, щипцы).
   4. Подготовить план на случай непредвиденных обстоятельств для контакта с человеческой ткани непосредственно на кожу, которая может включать замачивания бумажное полотенце в хлорной и проведение на пораженный участок (5-10 мин).
   5. Используйте соответствующую утилизацию отходов для всех элементов, контактирующих с человеческой тканью.
2. Боковой желудочек Всего горе Подготовка
   1. Вeginning с интактной полушарии (фиксировали в 10% формалине и тщательно промывают 0,1 М PBS), нарезать 1,5 см Коронарные срезы через всю полусферу, используя большой нож.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все протоколы фиксации требуют предварительной проверки антител.
   2. Разделы маркировки спереди назад, начиная с первой секции, содержащей боковой желудочек. Используйте систему маркировки буквенно-цифровой, называя ломтики с буквами (спереди назад) и подразделе с числами (сверху вниз). Избегайте нарушая эпендимных поверхность.
   3. Использование микрохирургической скальпель, рассекают стенку желудочка 1 см глубоко, поддерживая одну непрерывную раздел всей боковой стенке. Разделите стены, как нужно создавать соответствующего размера разделов для окрашивания хорошо. Выемка раздел на противоположной стороне стенки желудочка для выявления превосходной / низший ориентацию.
   4. Выполнение извлечение антигена путем инкубации срезов ткани в 10 мМ натрий-цитратном буфере (рН 6,0) при 100 ° С в течение 10-20 мин с использованием двойного boileг (оптимальное время инкубации определяют эмпирически). Промыть 3 раза в PBS / 0,1% Triton X-100 (PBS-TX).
   5. Блок в 10% лошадиной сыворотки с помощью PBS / PBS-TX в течение 1 часа при комнатной температуре.
   6. Инкубируйте с первичными антителами в течение 48 ч при 4 ° С. Для визуализации желудочка облицовки, immunostain тотальных со следующими комбинациями антитела: анти-мыши β-катенин (1: 250); козий анти-GFAP (1: 250); кролика против AQP4 (1: 400).
   7. Выполните все последующие шаги в темноте. Промыть 3 раза ткани в PBS, инкубируют со вторичными антителами (1: 500) в течение 24 ч при 4 ° С или 2 ч при комнатной температуре, и промыть еще 3 раза в PBS. Инкубируйте ткани в DAPI в течение 7 мин при комнатной температуре с последующим с еще 3 полоскания в PBS.
   8. Подготовьте ткань для окончательного вскрытия, покрывая воском нижнюю тарелку с парафином. Заполните блюдо с PBS, поместите ткань в чашке с использованием тонких щипцов, избегая контакта с эпендимных стене.
   9. Под микроскопом рассекает, твердо ВХСУRe ткани на боковых помощью штифтов. С 22,5 ° микрохирургических колотой ножом, создать единые тонких срезов (примерно 300 мкм) из боковой стенки желудочка. Для больших участков или участков с затрудненным кривизны, нарезать кубиками небольших до резки в заключительной части для монтажа и примечания месте.
   10. Осторожно положите расчлененный раздел эпендимы стороной вверх на слайде с использованием тонких щипцов, принимая к сведению регионального местоположения и ориентации на слайде. Обложка ткани с тонким слоем aquapolymount, заботясь, чтобы избежать пузырей. Поместите покровное над ткани, добавить дополнительные aquapolymount, как нужно заполнить пробелы в покровное.
   11. Поместите установлены секции в темное и сухое в течение 2-3 дней при комнатной температуре. Хранить в slidebox при 4 ° С.
3. Иммуногистохимия и Гистологический анализ
   1. Использование конфокальной микроскопии для просмотра флуоресцентного иммуногистохимии, установлен в фокальной плоскости изображения на поверхности желудочка, как определено с использованием Oе β-катенин (маркер для верхушечные слипчивых соединительных белков эпендимных клеток). Очертить регионы эпендимных охвата клетки и поверхности астроглиоза (GFAP окрашивания на поверхности желудочка).
   2. Для документа и фотомонтаж всей поверхности желудочка, использовать перекрывающихся изображений, чтобы покрыть всю поверхность. Чтобы создать монтаж последовательных изображений, откройте Adobe Photoshop. Используйте Файл> Автоматизация> Photomerge> Интерактивная макета выберите изображения для наложения, ручной настройки, если это необходимо.
   3. Создайте новый слой, чтобы проследить монтаж генерировать мультфильм представительство нетронутыми покрытия Эпендима клеток или желудочка поверхности глиозом. Повторите для каждого слайда или ROI. Составьте все разделы реконструировать карту стенки желудочка и ссылка на соответствующий регион на реконструкцию МРТ.

Результаты

Контур отслеживания мыши боковых желудочков на основе иммуноокрашиванию 50 мкм корональных секций и 3D реконструкций (рис 3) позволяет получить сведения об объеме, чтобы быть собраны в различных экспериментальных парадигм, используя мышь в качестве модельной системы для болез?...

Обсуждение

Мы представляем инструменты и протоколы, которые могут быть использованы для оценки целостности системы желудочков мозга у мышей и человека. Эти инструменты, однако, может также применяться к другим структурам головного мозга или органов и систем, которые подвергаются изменениям в св...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline (PBS)	Life Technologies	21600-069
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Sciences	19210	Use at 4% in PBS, 4 °C
Normal Horse Serum	Life Technologies	16050	10% in PBS-TX (v/v)
Normal Goat Serum	Life Technologies	16210	10% in PBS-TX (v/v)
Triton X-100 (TX)	Sigma-Aldrich	T8787	0.1% in PBS (v/v)
Vibratome	Leica	VT1000S
Fluorescence Microscope	Zeiss	Imager.M2
Camera	Hamamatsu	ORCA R2
Microscope Stage Controller	Ludl Electronic Products	MAC 6000
Stereology software	MBF Bioscience	Stereo Investigator 11
Stereology software	ImageJ/NIH	NIH freeware
3D Reconstruction software	MBF Bioscience	Neurolucida Explorer
Confocal Microscope	Leica	TCS SP2
MRI Software
Freesurfer	https://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/DownloadAndInstall	Segmentation and Volume
ITK-Snap	http://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.php		Segmentation and Volume
Multi-image Analysis GUI (Mango)	http://ric.uthscsa.edu/mango/		Longitudinal overlay
Whole Mount Equipment
22.5° microsurgical straight stab knife	Fisher Scientific	NC9854830
parafilm
wax bottom dissecting dish
pins
fine forceps
aquapolymount
Dissecting Microscope	Leica	MZ95
Whole Mount Antibodies
mouse anti-b-catenin	BD Bioschiences, San Jose, CA, USA		1:250
goat anti-GFAP	Santa Cruz Biotechnology		1:250
rabbit anti-AQP4 (aquaporin-4)	Sigma-Aldrich		1:400
Coronal Antibodies
Anti-S100β antibody	Sigma-Aldrich		1:500
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Life Technologies	D-1306	10 µg/ml in PBS