Зеленый флуоресцентный белок на основе Expression Скрининг мембранных белков в<em&gt; Кишечная палочка</em

Резюме

Обтекаемой подход к скрининга для экспрессии рекомбинантных мембранных белков в кишечной палочки на основе слияния с зеленого флуоресцентного белка представлена.

Аннотация

Получение рекомбинантных мембранных белков для структурных и функциональных исследований остается технически сложным из-за низких уровней экспрессии и присущего нестабильность многих мембранных белков раз растворимым в моющих средствах. Данный протокол описывается, что сочетает в себе перевязки независимое клонирование мембранных белков, GFP слияния с выражением в кишечной палочки, обнаруженных флуоресценции GFP. Это позволяет строительство и выражение показ многократного мембранного белка / варианты по определению кандидатов, подходящих для дальнейшего инвестирования времени и усилий. GFP репортер используют в первичном скрининге экспрессии путем визуализации флуоресценции GFP после электрофореза в полиакриламидном геле SDS (SDS-PAGE). Мембранные белки, которые показывают как высокий уровень экспрессии с минимальной деградацией, как показано отсутствие свободного GFP, выбирают для вторичного экрана. Эти конструкции масштабировать и общая доля мембрану, приготовленную, и солюбилизациид в четырех различных моющих средств. После ультрацентрифугирования, чтобы удалить нерастворимый моющий материал, лизаты анализировали с помощью обнаружения флуоресценции гель-проникающей хроматографии (фс). Мониторинг профиль гель-флуоресценции, GFP предоставляет информацию о моно-дисперсности и целостности мембранных белков в различных моющих средств. Белок: комбинации моющее средство, которое элюируют симметричный пик с мало свободного GFP и минимальной агрегации являются кандидатами для последующей очистки. По описанной методике, гетерологичная экспрессии в E. палочка СЭД (форма, относительное удлинение, разделение, и спорообразования) белков из 47 различных видов бактерий были проанализированы. Эти белки обычно имеют десять трансмембранных доменов и имеют важное значение для деления клеток. Результаты показывают, что производство SED, ортолагами в E. палочка была сильно варьируется по отношению к уровням экспрессии и целостности белков GFP синтеза. Эксперимент яdentified подмножество для дальнейшего расследования.

Введение

Было подсчитано, что мембранные белки составляют приблизительно 20-30% генов, кодируемых в геномах всех секвенированных ^1, в том числе человеческого генома ^2. Учитывая их решающую роль во многих биологических процессах, например для транспортных метаболитов, производства энергии и, как лекарственных препаратов, есть большой интерес в определении их трехмерную структуру. Однако по сравнению с растворимых белков, мембранные белки очень слабо представлены в белке банка данных. В самом деле, из 99 624 выпущенных структур в PDB ( http://www.rcsb.org/pdb/ ) только 471 ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ) классифицируются как мембранных белков. Это отражает технические трудности работы с мембранными белками, которые, естественно, высказанных на относительно низких уровнях; родопсина является одним из немногих исключений ^3,4. За экспрессия рекомбинантного версиис в гетерологичных клетках часто приводит к неправильного сворачивания и плохой ориентации на мембране, который ограничивает общий уровень производства. Выбор наилучшего моющее средство для извлечения и солюбилизации мембранного белка в свое время высказал делает последующую очистку сложно и требует тщательного оптимизации.

Кишечной палочки остается наиболее часто используемым хост выражение для мембранных белков, приходящихся на 72% ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ) структур решена до сих которые почти исключительно из бактериальных источников. Удельный E. штаммы кишечной палочки, C41 (DE3) и C43 (DE3), были выделены, которые не приводят к чрезмерной экспрессии мембранных белков и, следовательно, избежать последствий токсичность наблюдается и для других BL21 штаммов ^5,6. Настройка уровня экспрессии рекомбинантного белка мембраны по-видимому, важны для оптимизации уровня производства ^6,7.

Во многих случаях успешного производства мембранных белков для определения структуры потребовало оценку нескольких версий, включая амино- и карбоксильных-концевые делеции, несколько ортолагами с целью извлечения изменение естественной последовательности и различные слитые белки ^6-8. Таким образом, способ скрининга экспрессии нескольких мембранных белков параллельно имеет важное значение. Один широко используемый подход к слиянию белка зеленого флуоресцентного белка (GFP), позволяющей экспрессии, которые необходимо отслеживать без необходимости очистки белка. Таким образом, информация о уровня экспрессии, стабильность и поведение в различных моющих средствах могут быть оценены с небольшими количествами не-очищенного материала ^9-12.

В этой статье мы расскажем, упорядоченных протокол для клонирования и экспрессии скрининга мембранных белков в E. палочка с помощью слияния в GFP в качестве репортера производства и последующей характеристики моющего средства: белка компlexes (Рисунок 1).

протокол

1. Конструирование векторов экспрессии,

1. Использование ПЦР инфузионный клонирование построить до 96 плазмид экспрессии параллельно с использованием векторов pOPINE-3C-GFP и POPIN-N-GFP, которые добавляют либо расщепляемые С-концевые или N-концевых гибридов GFP-His6 с последовательностями ¹³ соответственно.
   Примечание: Выбор вектора диктуется топологии белка с GFP должно быть выражено в цитозоле, таким образом, белок с цитозольного N-концом и внеклеточной C-конце мы будет использовать Popin-N-GFP и для внеклеточный N-конец и цитозольный С-конец в мы будем использовать pOPINE-3C-GFP. Где обоих концах являются цитозольный мы будем использовать pOPINE-3C-GFP, если нет функциональной причин, чтобы не помечать С-конец.
2. Амплификации последовательности ДНК, кодирующие мембранные белки с использованием праймеров, включающих следующие расширения, показанные:
   pOPINE-3C-GFP (Прямой праймер - AGGAGATATACCATG; обратный праймер - CAGAACTTCCAGTTT) и Popin-N-GFP (Прямой праймер - AAGTTCTGTTTCAGGGCCCG; обратный праймер - ATGGTCTAGAAAGCTTTA).
3. Анализ ПЦР электрофорезом в агарозном геле. После того, как чистые продукты ПЦР были получены, добавить 5 U ДПНИ в каждую лунку (составляют в 5 мкл 1x DpnI реакционного буфера). Очищают продуктов ПЦР с использованием магнитных шариков в формате 96-луночного.
   Примечание: DpnI добавляют, чтобы удалить шаблон вектор; этот шаг не является необходимым, если геномной ДНК в качестве матрицы.
4. Добавить 1 мкл (100 нг) соответствующего линеаризованного вектора в каждую лунку пластины ПЦР.
5. Использование многоканальной пипетки добавить х мкл очищенного ПЦР вставить в соответствующие лунки планшета ПЦР. Убедитесь, что все продукты в диапазоне 10-250 нг.
6. Добавить (9-х) мкл воды к скважине и передавать целые 10 мкл на пробирку, содержащую сухой вниз в-синтеза реагента. Оставьте на 30 сек.
7. Смешайте содержимое кратко помощью пипетки вверх и вниз. Переводреакции обратно к первоначальному ПЦР пластины и уплотнения.
8. Инкубировать в течение 30 мин при 42 ° С в амплификаторе.
9. Сразу передачи реакции на льду, как только реакци завершаетс, и добавить 40 мкл ТЕ (10 мМ Трис, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА).
10. Замораживание сразу или превратить в компетентные клетки. Для преобразования необходимо использовать 3 мкл разбавленного реакции на 50 мкл аликвоты высокая компетентность (> 5 х 10 ⁹ трансформантов / мкг) компетентного Е. палочки клетки.
11. Добавить 1 мл LB-агар с добавлением 50 мкг / мл карбенициллина на лунку в 24-луночный планшет для тканевых культур (для клонирования, подготовки скважин в течение 2 х количество конструкций).
12. После вырост, после вырост пластины из 25 мкл и 25 мкл 1 в 5 разведения культуры на агар, содержащий культуры ткани 24-луночные планшеты.
13. Распространение клеток, мягко наклоняя тарелку.
14. Сушат пластины с крышкой с течение 10-15 мин при температуре 37 ° С или в FloW капот при комнатной температуре.
15. Заменить крышку и повернуть пластину вверх дном и инкубируют в течение ночи при 37 ° C.
16. Выберите две колонии и мини-приготовительные векторы.
17. ПЦР проверки конструкции, используя построить специальные обратного праймера и векторные конкретный прямой праймер (например, pOPIN_FOR GAC CGA AAT ТАА TAC GAC TCA CTA TAG GG).

2. Трансформация Е. палочка E XPression Штаммы

Примечание: Перед выполнением настоящего Протокола, Е. палочки компетентные клетки сделаны, аликвоты и хранили в замороженном виде при -80 & deg; С, как описано ранее ^13. Выражение мембраны белок регулярно проходят обследование в двух штаммов, Lemo21 (DE3) и C41 (DE3) pLysS. Чтобы помочь интерпретацию результатов это может быть полезно включить положительный контроль, например, плазмиды, выражая GFP или мембранный белок, слитый с GFP, известный выразить и отрицательный контроль пустой вектор.

1. Оттепель Алиquotted E. палочки на льду. Добавить 3 мкл мини-нацелен плазмиды экспрессии каждой аликвоты компетентных клеток.
2. Инкубируйте смесь на льду в течение 30 мин.
3. Теплового шока клеток в течение 30 сек при 42 ° С.
4. Разрешить клетки для восстановления на льду в течение 2 мин, а затем добавить 300 мкл бульона мощности в каждую пробирку.
5. Инкубировать в течение 1 часа в 37 ° C статического инкубаторе.
6. Подготовка LB агар в планшет для тканевых культур 24-а, с добавлением 50 мкг / мл карбенициллина и 35 мкг / мл хлорамфеникола. Добавить рамнозу до конечной концентрации 0,25 мМ до лунок, содержащих Lemo21 (DE3).
   Примечание: Если продукт может быть токсичным лунки, содержащие C41 (DE3) pLysS может быть дополнена 1% (вес / объем) глюкозы.
7. Передача 30 мкл клеток из смеси трансформации на пластинах LB агар. Распространение и высушить плашку, как описано в 1.13-1.15.

3. Подготовка в течение ночи заквасок

Примечание: Всегда подготовить ночных культур на следующий день после трансформации никогда от старого пластины трансформации.

1. Добавить 0,7 мл бульона мощности в каждую лунку 96-луночного глубокого-луночный планшет с добавлением 50 мкг / мл карбенициллина и 35 мкг / мл хлорамфеникола. Добавить рамнозу в лунки, содержащие Lemo21 (DE3) до конечной концентрации 0,25 мМ. По желанию, в дополнение C41 (DE3) pLysS с 1% (масса / объем) глюкозы; см выше (2,6 записке).
2. Выберите один колонию из ночных преобразований пластин в каждую лунку. Уплотнение блок с газопроницаемых печатью.
3. Взболтать блок на 250 оборотов в минуту в инкубаторе с большим броска (например, 25 мм орбиты) или при 600 оборотах в минуту в инкубаторе с небольшим броска (например, 4,3 мм орбиты) при 37 ° С в течение ночи.

4. Рост и индукции культур

1. Добавить 3 мл мощности бульона с добавлением 50 мкг / мл карбенициллина и 35 мкг / мл хлорамфеникола друг масELL 24-а глубоко-луночного планшета. Добавить L-рамнозу (и глюкозы), как описано в разделе 3.1. Использование 3 мл культуры, чтобы позволить сбор в двух экземплярах и для обеспечения некоторой испарения воды через проницаемую уплотнение газа.
2. Настройте культуры экспрессии путем добавления 150 мкл Lemo21 (DE3) или C41 (DE3) pLysS ночных культур в каждую лунку 24-луночных блоков глубоководных скважин.
3. не взболтать блоки при 37 ° С до тех пор, среднего ОД на 595 нм ~ 0,5 сквозь пластину.
4. Индуцируют экспрессию добавлением IPTG к культурам до конечной концентрации 1,0 мМ IPTG.
5. Выращивают культуру в течение ночи (18-20 ч) при встряхивании при 20 ° С.

5. Анализ экспрессии с помощью In-гель флуоресценции

1. Урожай в двух экземплярах. Передача 1 мл культуры из каждой лунки в прямоугольной ямы, коническим днищем, 96-а блока глубокой скважины.
   Примечание: Harvest в двух экземплярах в случае поломки блока или позволить тестирование в alternatiве моющего средства, если это необходимо.
2. Уплотнение блоки и сбора клеток путем центрифугирования при 6000 х г в течение 10 мин.
3. Обратить блок и переливать СМИ. Нажмите на блок мягко на бумажное полотенце, чтобы слить остатки бумаги.
4. Печать пластины и хранить при температуре -80 ° С в течение не менее 20 мин. При желании, оставьте эксперимент в этой точке и блок обрабатывается, когда это удобно.
5. De-мороз гранул в течение 20 мин при комнатной температуре.
6. Используйте или пипетки многоканальный или орбитальном шейкере (1000 оборотов в минуту в течение 10 мин) при 4 ° С для ресуспендирования клеток полностью в 200 мкл буфера для лизиса (50 мМ NaH ₂ PO _4, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазола 1% об / об Твина 20, доведения рН до 8,0 с помощью NaOH).
7. Добавить 20 мкл раствора DLPI (20 мкл DNAseI (4000 ед / мл), 20 мг лизоцима и 20 мкл ингибитора протеазы коктейль в конечном объеме 2 мл воды). Инкубировать в течение 10 мин при встряхивании (~ 1000 оборотов в минуту) при 4 ° С.
8. Добавить 25 мкл 10% N -Dodecyl β-D-maltoside (DDM).
9. Инкубировать в течение 60 мин при встряхивании (~ 1000 оборотов в минуту) при 4 ° С.
10. Центрифуга блок глубокой скважины на 6000 мкг в течение 30 мин при 4 ° С.
11. Передача 10 мкл очищенного лизата к микротитрационного планшета и добавить 10 мкл SDS-PAGE гель-загрузочного буфера (100 мМ Трис, рН 6,8, 4% вес / объем ДСН, 0,2% вес / объем бромфенолового синего, 10% об / об β -mercaptoethanol, и 20% об / об глицерин). ВНИМАНИЕ! Не кипятить образца.
12. Добавить 10 мкл образца, полученные на стадии 5,11 / лунку на SDS геле (ов) и работают на 100-120 V (постоянный ток) в холодной комнате, пока фронт красителя не достигнет дна (2-2,5 ч).
13. Поместите гель на качестве тепловизора (например, с сине-светофильтр для обнаружения белков GFP синтеза). Время экспозиции выбирается так, чтобы гарантировать, что яркие полосы не насыщен.

6. Расширение масштабов клеточных культур

1. Трансформации аликвоты компетентных E. палочки, как описано в разделе 2.
2. Выберите колонию в 10 мл мощности бульоне (с добавлением, как описано в разделе 3) и расти в течение ночи при 37 ° С.
3. Развести 5 мл ночной культуры в 500 мл бульона мощности.
4. Выращивают при встряхивании при 250 оборотах в минуту при 37 ° С до OD при 595 нм ~ 0,5.
5. Индуцируют экспрессию добавлением IPTG до конечной концентрации 1,0 мМ.
6. Расти в течение ночи при встряхивании при 250 оборотах в минуту при 20 ° С.
7. Урожай клетки центрифугированием при 5000 мкг в течение 15 мин.
8. Удалите супернатант. Клеточные осадки можно хранить при -80 ° С.

7. Подготовка мембран

1. Оттаивания клетки (при необходимости) при комнатной температуре и ресуспендируют в 1X PBS, рН 7,5 в объеме 5 мл на грамм клеточного осадка; Увеличение объема мере необходимости, пока вязкость не сводится к жидким консистенции. Добавить MgCl ₂ до конечной концентрации 1 мМ, ДНКазы I до конечной концентрации 10 мкг / мл и одинпредварительно упакованные таблетки ингибитора протеазы на 20 г клеточного осадка. Взламывай клеток с использованием охлажденной дезинтегратора клеток при давлении 30 kpsi.
2. Гранул неразрушенных клеток и мусора при 30000g в течение 15 мин при 4 ° С. Передача супернатант в ультра-центрифужную пробирку.
3. Собирают общую мембранную фракцию счет остановки супернатант в ультра-центрифуге при 200000 х г в течение 1 ч при 4 ° С.
4. Удалите супернатант.
5. Re-приостановить осадок мембран в ледяной 10 мл PBS рН 7,5 с помощью мобильного гомогенизатора. 1 мл ресуспендированные мембраны требуется для каждого моющего средства. По желанию, на данном этапе, флэш-заморозить суспензии мембран в жидком азоте и хранят при -80 ° С.

8. Повышение растворимости и анализ мембранной фракции

1. Оттепели мембранную фракцию (если это необходимо), и для каждого моющего средства, которые будут использоваться для солюбилизации, аликвоту 900 мкл суспензии мембран в 1,5 мл polyallomer микро-centrifuGE трубки.
2. Добавить 100 мкл каждого свежеприготовленного моющего средства (10% вес / объем растворов ДДС, дм, Cymal-6 и LDAO) до конечной концентрации 1% к указанной трубке 1,5 мл. Для солюбилизации мембранных белков эукариотической холестерина гемисукцината (0,2% конечная концентрация) может быть добавлен к моющим средствам.
3. Инкубируйте смеси при 4 ° С в течение 1 ч при умеренном перемешивании.
4. Гранул моющего нерастворимой фракции с рабочей поверхностью ультра-центрифуги, обеспечивающие трубы, по меньшей мере наполовину, по меньшей 150000 г при 4 ° С в течение 45 мин и сохранить супернатант.
   Примечание: Эффективность моющего солюбилизации может быть оценена с использованием флуоресцентного планшет-ридера с помощью измерения флуоресценции GFP солюбилизированного мембран с моющим средством нерастворимой фракции ресуспендировали в том же объеме PBS.
5. Анализ моно-дисперсности различного моющего средства: мембранные белковые комплексы, использующие флуоресценции обнаружена гель-хроматографии (FSEC),
6. Для анализа фс, равновесие эксклюзивной колонке с широким спектром фракционирования, например, от 5000 до 5000000 молекулярной массы, с рабочим буфером (20 мМ Трис, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 0,03% DDM) при скорости потока 0,3 мл / мин , Используйте этот буфер для всех образцов, то есть не изменяется для каждого моющего средства испытания.
7. Вводят 100 мкл растворенных мембран на колонку при скорости потока 0,3 мл / мин. Монитор профиль элюирования с помощью флуоресцентной оптики (возбуждение при 488 нм и излучение на 512 нм). Если встроенный флуоресценции монитор не доступен, собирать фракции и читать флуоресценции в ридере.
8. Объем импорта элюирование и данные интенсивности флуоресценции в программе электронных таблиц для графического дисплея.
9. Анализ остальные растворимый материал мембраны по флуоресценции в геле, как описано в разделе 5.

Результаты

SEDS семейство белков (форма, относительное удлинение, разделение, и спорообразования) имеет важное значение для разделения бактериальной клетки. Эти интегральные белки обычно имеют десять трансмембранных доменов с обеих амино- и карбокси-концах внутри клетки. В качестве примера протокола, описанного выше, 47 SEDs ортологи были клонированы в вектор pOPINE-3C-EGFP. Маленький экран шкалы экспрессии конструкций проводилась в двух штаммов E .coli, Lemo21 (DE3) выращивали в присутствии 0,25 мМ рамноза блокировать экспрессию и вытекающей C41 (DE3) pLysS, которые обычно используемый для экспрессии мембраны белки ^5-8.

Моющие солюбилизировали лизаты индуцированных культур анализировали с помощью электрофореза в ДСН-полиакриламидном геле. Использование флуоресценции в геле для визуализации выраженные слитые белки GFP показал, что между этими двумя штаммами 38 из 47 SEDs конструкций были произведены. Интересно было различия между двумя штаммами экспрессии, Из 38 выразил конструкции, только 18 были произведены в обоих штаммов, 14 экспрессируется только в Lemo21 (DE3) и 6 только в C41 (DE3) pLysS. В целом, было выше вероятность успеха для Lemo21 (DE3) по сравнению с C41 (DE3) pLysS (38 против 24). Однако факт, что некоторые белки оказались штамм-специфическими означает, что скрининг в обоих полезно.

Репрезентативные данные по 24 из 47 SED, конструкции показаны на рисунке 1. Интенсивность полос дает представление об уровне экспрессии, например, слитого белка в хорошо С4 на рис 1А и 1В хорошо выражена в обоих штаммов однако дополнительная нижние полосы рные предположить, что белок является частично снижается. Во многих полос есть группа, которая соответствует по размеру, чтобы в одиночку GFP. Качественная оценка целостности белка может быть осуществлена, глядя на интенсивности слитого белка по отношению к свободной GFP;к примеру, G4 и H4 полностью разрушены, чтобы освободить GFP в C41 (DE3) pLysS (рис 1б), тогда как в Lemo21 (DE3) есть некоторые интактный белок (1А). Для 14 из 38 экспрессированных белков интенсивность свободного GFP группы аналогично слитого белка, на 21 интенсивность свободной GFP полосы больше, чем у слитого белка и меньшинство слитых белков (3 / 38 выражены), например, F6, G6 на фиг.1А, имеют относительно мало свободного GFP сравнению с слитого белка.

Два из конструкций, которые хорошо выражена в основной B5 экран (полосы высокой интенсивности для свободного GFP и слитых белков) и G6 (немного свободного GFP) были высказаны и общей мембранной фракции, полученной из 500 культуры мл клеток. Ресуспендированные мембраны разделяли на аликвоты и анализировали с помощью флуоресцентно-обнаружено гель-проникающей хроматографии (фс). В фс профили представлены в Figurе 2А и 2В, соответственно, и показывают, что два SEDs белки себя по-разному в четырех протестированных моющих средств. В одном случае (2А: Образец B5) белок только дал симметричный пик с небольшим агрегации в DDM поэтому, которая была бы моющее средство выбора для последующей очистки. В отличие от этого другой слитый белок (фиг.2В: Образец G6) дает аналогичный профиль во всех испытанных моющих средств.

Рисунок 1: Схема процесса для скрининга экспрессии белка мембраны в E. палочка с помощью GFP репортер.

Рисунок 2: главный экран выражения мембранных белков с помощью флуоресценции в геле. Моющие лизаты Е. палочки клетки анализировали SDS-PAGE и гели визуализируют с помощью подсветки синий эпидемию и 530/28 фильтр. Полученные результаты приведены в течение 24 конструктов (обозначенный A4-Н6 в зависимости от их позиции в 96-луночный планшет). Позиции групп для свободного GFP и GFP слитых белков указаны. (A) белки, экспрессируемые в Lemo21 (DE3). (B) белки, экспрессируемые в C41 (DE3) pLysS.

Рисунок 3:. Вторичный экран экспрессии белка мембраны с использованием флуоресцентно-обнаружено эксклюзионной хроматографии (фс) Всего мембранные фракции экстрагировали в четырех различных моющих средств и растворенные мембранные белки анализировали с помощью гель-проникающей хроматографии с использованием FPLC системе, связанной с флуоресцентным детектором. Фс профили (А) мембранным белком B5 и (В) мембранный белок G6. Положение пиков, соответствующих агрегированного белка, солюбилизированного белка GFP слитого и свободного GFP указаны. Моющие средства испытанные указаны ниже профилей.

Обсуждение

В методике, описанной в этой статье, лигирование независимое клонирование в GFP репортерного вектора в сочетании с флуоресцентной детекции быстро экран относительную экспрессию нескольких мембранных белков в E. палочка. Векторы могут быть сделаны в четырех рабочих дней с первичной скрининга выражение принимает дополнительно неделю. В-гель флуоресценции моющих лизатов целых клеток используется для ранжирования выражение парад для дальнейшего анализа в средней экране. Экран первичное выражение, как представлено не требует, кроме шейкер-инкубатор, пригодной для выращивания клеток в глубоких блоков также любое специальное оборудование. Все другие жидкости обработки с участием 96-а SBS пластины может быть осуществлена ​​с использованием многоканальных пипеток. Протокол может быть легко модифицирован, чтобы включать в себя другие штаммов E.coli, выращенных в различных условиях экспрессии (например, ниже температура). В случае LEMO21 (DE3) титрованием уровень рамнозы (от 0 до 2,0 мм)добавлен, чтобы модулировать скорость транскрипции может повысить уровень экспрессии некоторых мембранных белков ^7. Кроме DDM Моющие могут быть использованы для извлечения в основной экран, хотя более жесткие моющие средства могут солюбилизации белков из телец включения и, следовательно, дает ложных срабатываний. Очевидно, что чем сложнее начальный экран становится более трудоемким эксперимент.

Дополнительный экран включает подготовку общей мембранной фракции хитов экспрессии определенных в основной экран. Это очень важный шаг, поскольку он подтвердит локализацию слитых белков в мембраны Е. палочки клетки. После экстракции белка GFP слитого в различных моющих средствах будет контролироваться с помощью флуоресцентной-обнаружено эксклюзионной хроматографии растворенного вещества, чтобы оценить моно-дисперсность детергента-белковых комплексов. Это еще один важный шаг, поскольку он определяет наиболее подходящий стиральный порошок длясолюбилизации мембранного белка для последующей обработки вниз по течению. Тем не менее, опыт показывает, что дальнейшая оптимизация выбора моющего средства (ов) таки может потребоваться во время очистки и кристаллизации. Свидетельство единого поведения в различных моющих средств в том числе с относительно небольшим размером мицелл (например LDAO) появляется, чтобы быть хорошим индикатором склонности к образованию и дифракция, кристаллы, по крайней мере для прокариотических мембранных белков ^14. В этом отношении профиль показан на мембранного белка на фиг.2В представляется весьма выгодно.

Основное преимущество использования GFP репортер, что она дает быстрое считывание экспрессии в образцах не-очищали. Недостатком является то, что белок GFP слитый должен быть удален в течение очистки белка дл кристаллизации. В случае векторов, используемых здесь, протеазы сайт риновирусов 3C обеспечивает расщепление GFP. С другой стороны, это простоповторно-Clone кандидатов белки, выявленных на экране, в векторы, которые добавляются только полигистидиновый или другой аффинной метки для последующей очистки. Это предполагает, что слитый с GFP не является необходимым для экспрессии. Основной альтернативой использованию сплав с GFP для обнаружения экспрессии белка мембраны и солюбилизации является добавление только гистидин тег. Однако этот подход, как правило, требует, начиная с мембранной фракции ^15, которая для оценки многих вариантов стала бы очень много времени.

Таким образом, основная цель протокола, описанного в этой статье, для того, чтобы большое количество последовательности мембранных белков варианты, чтобы быстро оценить с точки зрения выражения и моющих средств солюбилизации и приоритеты для более глубокого анализа.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
pOPIN-N-GFP	addgene (www.addgene.org)
pOPINE-3C-GFP	addgene (www.addgene.org)
C41(DE3)pLysS	Lucigen (http://lucigen.com/)	60444-1
LEMO21(DE3)	New England Biolabs	C2528H
In-Fusion HD EcoDry Cloning System, 96 Rxns	Clontech/Takara	639688
Power broth	Molecular Dimensions (http://www.moleculardimensions.com/)	MD12-106-1
Protease Inhibitor tablets	Roche	11697498001
cOmplete, Mini, EDTA-Free; Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836170001
L-Rhamnose monohydrate	Sigma-Aldrich	83650
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	P8849
DNAse 1	Sigma-Aldrich	DN25
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L7651
Cholesterol hemisuccinate	Sigma-Aldrich	C6512
CYMAL-6 (6-Cyclohexyl-1-Hexyl-β-D-Maltoside)	Anatrace	C326
DDM (n-Dodecyl β-maltoside)	Generon	D97002
DM (n-Decyl β-maltoside)	Generon	D99003
LDAO (N,N-Dimethyl-n-dodecylamine N-oxide)	Generon	D71111
E1 ClipTip Eq384 8 channel 1-30 µl	Thermo Scientific	4672030
Rainin Pipette Pipet-Lite XLS 6ch 100-1,200 µl LTS Spacer	Anachem	LA6-300XLS
Rainin Pipette Light XLS+ 8ch 2-20 µl LTS	Anachem	L8-20XLSPLUS
Pipette Pipet-Lite XLS 8ch 100-1,200 µl LTS Tip	Anachem	L8-1200XLS
24 well V bottom deep well blocks	Porvair sciences	360115
BenchMark Fluorescent Protein Standard	Life Technologies	LC5928
NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Midi Protein Gels, 26 well	Life Technologies	WG1203BOX
XCell4 SureLock Midi-Cell	Life Technologies	WR0100
Vibramax 100	Heidolph	544-21200-00
Tension rollers attachment	Heidolph	549-81000-00
ptima L-100 Ultracentrifuge running 45-Ti rotor	Beckman Coulter	393253
Optima Max-XP ultracentrifuge running TLA-55 rotor	Beckman Coulter	393315
Floor standing centrifuge, Avanti J-26S XPI running JA-17 and JS-5.3 rotors	Beckman Coulter	B14535
Prominence UFLC with RF-20A Fluorescence detector	Shimadzu
Sepharose 6 10/300 GL size exclusion column	GE Healthcare	17-5172-01
SSI5R-HS SHEL LAB Floor Model Shaking Incubator, 5 Cu.Ft. (144 L), 30-850 rpm	Shel Lab	SSI5R-HS
Innova44R incubator	New Brunswick /Eppendorf	Innova44R
TS Series 0.75 kW Disrupter 230 V 50 Hz 1 PH (40 kpsi)	Constant systems	PL083016
L-Rhamnose monohydrate	Sigma	83650