Yenidoğan Fareler subventricular Bölgesi içine Plazmid DNA Transpozon Aracılı Entegrasyon Glioblastoma'nın Roman modelleri oluşturmak için

Özet

Here we describe an efficient and versatile protocol to induce, monitor and analyze novel glioblastomas (GBM) using transposon DNA injected into the ventricles of neonatal mice. Cells of the subventricular zone, which take up the plasmid, transform, proliferate and generate tumors with histo-pathological characteristics of human GBM.

Özet

An urgent need exists to test the contribution of new genes to the pathogenesis and progression of human glioblastomas (GBM), the most common primary brain tumor in adults with dismal prognosis. New potential therapies are rapidly emerging from the bench and require systematic testing in experimental models which closely reproduce the salient features of the human disease. Herein we describe in detail a method to induce new models of GBM with transposon-mediated integration of plasmid DNA into cells of the subventricular zone of neonatal mice. We present a simple way to clone new transposons amenable for genomic integration using the Sleeping Beauty transposon system and illustrate how to monitor plasmid uptake and disease progression using bioluminescence, histology and immuno-histochemistry. We also describe a method to create new primary GBM cell lines. Ideally, this report will allow further dissemination of the Sleeping Beauty transposon system among brain tumor researchers, leading to an in depth understanding of GBM pathogenesis and progression and to the timely design and testing of effective therapies for patients.

Giriş

Cerrahi, radyasyon tedavisi, kemoterapi ve ¹ ile tedavi edildiklerinde glioblastoma multiforme (GBM) 15-21 aylık bir medyan sağkalım, erişkinlerde en sık (% 60) primer beyin tümörü olduğunu. GBM için yeni tedaviler zorunludur. Deneysel tedaviler yeterince insan hastalığının belirgin özelliklerini yeniden hayvan modellerinde test gerektirir. Kemirgenler glioma hücre hatları ² kullanılarak kimyasal alkilleyici ajanlarla mutagenezini, mikrop hattı veya somatik genetik değişiklikler, ya nakli dahil Stratejiler GBM ikna etmek. En yaygın olarak kullanılan model, beyin içine veya deri altına aynı genotipe sahip hayvanlarda singeneik hücreleri kullanılarak, ya da ortotopikal, glioma hücre hatlarının implantasyonu kullanır; veya ksenojenik hücreler, bağışıklık implante en yaygın insan GBM hücre çizgileri, fare ³ ele geçirildi. Ksenogratflardır intrakranial tümörlerin çalışma için birçok avantaj sunuyoruz: tekrarlanabilirlik kolaylık, Standardized büyüme oranları, ölüm ve tümör lokalizasyonu zamanı. Sözde pallisading nekroz, nükleer atypias, yaygın işgali, mikro-vasküler proliferasyon: implantasyonu ve doğru histolojik yeniden sınırlı yeteneği için kullanılan yapay, invaziv cerrahi yaklaşım insan GBM (WHO Evre IV) karakteristik özellikleri nedeniyle Ancak, bu modeller sınırlamaları var ve glomerüloid vasküler oluşumu ^4-7 anormallikler. Onkojenik DNA ile, ya viral vektörlerin ^8-12 veya transpozon-aracılı entegrasyon ¹³ ile somatik hücre genomu değiştirerek GBM İndüksiyon, daha yakından insan hastalığı etyolojisi üretir ve insan GBM histopatolojik özellikleri tartışıldı.

Tarihsel, MSS tümörleri sınıflandırılmış gözlendi kökenli algılanan hücreye dayalı olan, hayatta kalma ¹⁴ açısından belirleyici bir faktör olacaktır. GBMs birincil ve ikincil olarak sınıflandırılır. Gelişen kanıtlar today birincil glioblastoma ¹⁵ derece heterojen doğasına işaret. İkincil GBM (% 15), düşük dereceli astrositom (WHO grade I) ve anaplasic astrositomların malign transformasyon sonucu (WHO grade II), hastalığın erken başlaması, daha iyi prognoz ve gen ifadesinin bir "proneural" modeli ile ilişkili olan primer GBM (% 85) ise geç başlangıçlı, kötü prognoz ve glial (klasik), sinirsel ya da mezenkimal ifade kalıplarını göstermektedir. Gen ifadesinin bu kalıplar tümörün köken gerçek hücre ile ilişkili olsun hala aktif araştırılmaktadır. Veri Biriken GBM'lerde ile ilişkili genetik mutasyonlar kombinasyonu yaşam için öngörü olduğunu göstermektedir. Örneğin, kromozom 1p / 19q, IDH1 mutasyonları, PDGFRα amplifikasyonlar, bir heterozygocity kaybı (LOH) EGFR ekspresyonu, Notch ve Sonic kirpi yolu aktivasyonu, Nf ise, ikincil GBM'lerde, proneural ifade desen ve daha iyi prognoz ile ilişkili1 ve PTEN kaybı ve p53 mutasyonları nöral, klasik, ya da mezenkimal birincil GBM ve kötü prognoz ^16,17 ile ilişkilidir. Büyük ölçekli projelerin sıralama gelişi ve test için kullanılabilir sayısız hasta örneklerinin birikimi GBM patogenezinde ve ilerlemesinde ve tedaviler özellikle uygun olabilir bireyselleştirilmiş tıp, olasılığı karıştığı genetik mutasyonlar ve yollar ile ilgili yeni bilgi hazinesi getiriyor Hastanın genetik anormallikler. Sonuçta, sistematik bir şekilde bu mutasyonların ve yolların öngörü değerini değerlendirmek için, ve her durumda olası tedaviler test etmek için, önceden belirlenmiş genetik değişikliklerle GBM hayvan modelleri gerektirmektedir. Genomik DNA transpozon aracılı entegrasyon uygun bir yaklaşım sunmaktadır.

Sleeping Beauty transpozon sistemi, transposonların Tc1 / denizci sınıfının üyesi, bir çok adım prosedürü içinde (inşa) "uyanmış" olduatıl fazla 10 milyon yıl önce ^18,19 oldu bir salmonoid transposaz geni, site özel mutajenez ss. Özünde, belirli dizileri (ters tekrarlar / doğrudan tekrarlar: IR / DR) tarafından çevrili DNA transposonlar Sleeping Beauty transpozazın faaliyet vasıtasıyla "kes ve yapıştır" şekilde genomuna entegre edilebilir. transposaz, IR siteleri uçlarını tanır transpozonun excises ve bazlar, T ve A, transpozisyon (Şekil 1a) sırasında transpozonun her sonunda çoğaltılır bazlar arasında başka bir DNA siteye rastgele bütünleştirir. Uyku Güzellik transposaz üç alanda, bir transpozon bağlama alanı, bir nükleer lokalizasyon dizisi ve katalitik bir etki oluşturmaktadır. Dört transposaz moleküllerin bir araya transpozonun iki ucunu getirmek ve aktarılması için izin transpozazın çok molekülleri mevcut olan, ancak, bunlar dimerize ve önlenmesi için tetramerize gerekmektedirtranspozisyon reaksiyonu ^20. Verimli bir transpozisyon reaksiyon transposonların için transpozazın optimal oranı gerektirir. Transposaz kodlayan DNA (cis olarak) transposon aynı plazmid veya (trans) farklı bir plazmid üzerinde temin edilebilir. Transpozaz ve transpozonlar arasında optimal oranı sağlamak için, yeterli bir etkinliğe sahip bir promotörü (("cis" modeli için) transpozazın ifadesi ya da optimize edilebilir, enjeksiyon çözeltisi içinde plasmidlerin oranı seçilebilir "Trans" modeli). Sleeping Beauty Transpozon sistemi fonksiyonel genomik ekleme mütajenezi, transgenesis ve somatik gen terapisi ²¹ başarıyla kullanılabilir. Sentetik yapı, bir atıl salmonoid varyantı fonksiyonel molekül için yeniden tasarlanmış olan uyku güzellik transposaz, insanlarda ve diğer memelilerde ²⁰ diğer transpozonlar bağlanmaz. Keşfedilmesinden bu yana, moleküler mühendislik donanımlrn vardıred IR dizileri ve TATA dinükleotidleri, transpozonun yan pT2 transposonların sonuçlanan eklenmesiyle değişiklikler yoluyla SB transpozonu sisteminin aktarılması etkinliği. Bu transposonlar IR sitesine SB bağlama optimize edilmiş ve eksizyon etkinliğini artırmıştır. SB transposaz da önemli bir gelişme göstermiştir; Burada sunulan Deneylerde kullanılan transposaz SB100X, memeli hücrelerinde ²² büyük çaplı bir genetik ekranından sonra bir DNA karıştırma stratejisi tarafından üretilen bir hiperaktif transposaz olup.

Bu yazıda yenidoğan farelerin ²³ alt-ventriküler bölgenin hücrelerine plazmid DNA viral olmayan, transpozon-aracılı entegrasyonu ile farelerde iç GBM ikna etmek için hızlı, çok yönlü ve tekrarlanabilir bir yöntem sunuyoruz. Biz Sleeping Beauty transposase kullanarak genomik entegrasyon için mükellef yeni genlerle transpozonlar oluşturmak ve plazmid alımını izlemek için nasıl göstermek için basit bir yol sunmak veışıldaması kullanarak hastalığın ilerlemesi. Biz de bu model ile yeniden GBM histolojik ve immunohistokimyasal özellikleri karakterize. Buna ek olarak, bu tümörler birincil GBM hücre hatları oluşturmak için hızlı bir yöntem sunulmaktadır. Tümörler hayvan orijinal hücrelerden kaynaklı olduğu Sleeping Beauty modeli, indüksiyon ve tümörlerin gelişiminde aday GBM genlerin rolü fonksiyonel değerlendirilmesini sağlar. Bu sistem, aynı zamanda, yerel mikro-değiştirebilir invaziv enflamatuar cerrahi prosedürlerin gerek olmaksızın, bağışıklık-kompetan farelerde bağışıklık terapisi de dahil olmak üzere, yeni GBM tedaviler, test edilmesi için uygundur.

Protokol

NOT: Tüm hayvan protokolleri Hayvanlar Kullanımı ve Bakımı Michigan Komitesi Üniversitesi (UCUCA) tarafından onaylanmıştır.

Yeni Uyuyan Güzel transposonların içine İlgi Sıra 1. Klonlama

NOT: genleri veya Sleeping Beauty transposaz sistemini kullanarak (shRNA gibi) önleyici unsurlar eklemek için, bir pkt veya pT2 plazmid omurgası haline ilgi dizisi klonlamak. Klonlama yönlendirin düzenleyici elemanlar, faiz ve belirteçlerin gen ters tekrarlar (IR / DR) tarafından çevrili kalmasını böyle. Aşağıda ayrıntılı bir PKT omurgasına PDGFβ klonlama bir örneği (bakınız ayrıca Şekil 1b).

1. Reaksiyon hacmi 50 ul Xbal / Xhol sınır enzimleri 5-10 birimleri ile 37 ° C 'de 4 saat süre ile, plazma vektörü PKT-IRES-Katushka 5 ug Digest.
2. 5-10 birimi ile 37 ° C 'de 4 saat süre ile, pGEM-T mPDGFβ plazmid 5 ug mPDGFβ cDNA'nın sindirilmesiNcol / SacI kısıtlama enzimleri s.
3. % 100 etanol içinde 2.5 hacim ve 3 M Na asetat, pH 5.8 1/10 hacmi eklenerek toplam DNA'nın çökeltilmesi ve -20 ° C'de gece boyunca inkübe edilir.
4. 15 dakika boyunca 13.800 x g'de örnekleri santrifüjleyin.
5. 1 dakika boyunca 13.800 xg'de% 70 etanol, santrifüj 500 ul DNA pelet yıkayın kez tekrarlayın ve steril DNaz ücretsiz su 19 ul yeniden askıya.
6. (MPDGFβ) hem vektör (PKT-IRES-Katushka) uçlarını künt ve eklemek için Hızlı Duraklama Kit üreticinin talimatlarına uyun.
7. Köreltilmiş vektör yükleyin ve% 1.2'lik etidyum bromür ile boyanmış agaroz jeli üzerinde yerleştirin ve 40 dakika için 80 V çalışır. Üreticinin protokolüne göre, bir jel arıtma takımı kullanılarak DNA'nın saflaştırılması, bantları görselleştirmek temiz bir jilet bıçağı ve jel ile tüketim.
8. 1 mol oranında (ekleme: vektörü) bir 4 olan bir tüp içinde ekleyerek aşama 1.7'de saflaştırılmış insert ve vektör DNA Arter. Bu tüp, p içineipette T4 ligaz 1 ul (ATP ihtiva eden), T4 ligaz tamponu 2 ul ve steril su ile 20 ul göre ayarlayın. 16 ° C'de 18 saat ligasyon reaksiyonu inkübe edin.
9. Lige ürünleri ile kimyasal olarak yetkili DH5a bakteriyel hücreleri dönüştürmek.
   1. Buz üzerinde yetkili hücreleri çözülme.
   2. Yetkili hücrelerin 50 ul ligasyon reaksiyonunun tüm hacmi ekleme tüp hafifçe sallamak ve 30 dakika süreyle buz üzerinde inkübe karışımı. 42 ° C'de 45 saniye boyunca bakteri ısı şok ve buz hemen geri; başka 2 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
   3. Kültüre Luria 950 ul ilave edin ve 1 saat boyunca 37 ° C'de çalkalayarak kuluçkalayın. Santrifüj bakteri 2400 xg'de 3 dakika boyunca ve LB 200 ul pelet yeniden askıya
   4. LB-agaroz ve ilgili antibiyotik ile kaplanmış bir Petri kabı üzerine dönüştürülmüş bakteri yayılır. 37 ° C'de gece boyunca plaka inkübe edin.
   5. Son olarak, 5-10 bacte toplamakarteryel koloni ve antibiyotik ile LB ortamı, 5 ml, gece boyunca 37 ° C'de kültürü.
   6. Üreticinin talimatlarına uygun olarak bir plazmid DNA mini kiti kullanılarak plazmid DNA arındırın. Bir tanı kısıtlama vektörü içine insertin doğru birleşme doğrulamak ve insertin doğru yönlenmesini sağlamak üzere DNA sekanslaması için pozitif klonları göndermek için özet yapın.
10. Ücretsiz plazmid hazırlık seti endotoksin, doğru koloniler seçin ve yüksek kalitede kullanılarak DNA üretimi büyütmek.
11. Steril su ya da 1 mM Tris-HCI DNA Zehir. Hazır olana kadar -20 ° C'de saklayın DNA yenidoğanlarda içine enjekte etmek.

2. içi ventriküler Neonatal Enjeksiyonlar

1. Deneme Üç dört hafta önce, bir erkek ve bir kadın fare ve plastik renkli Eskimo ile bir fare üreme kafesi yukarı ayarlayın. Bu zenginleştirilmiş bir ortam sağlar ve çiftleşme sürecini yardımcı olur.
2. Gebelik teyit edildiğinde, m kaldırmakYeni bir kafese bira. Onsekiz gün çiftleşme sonra, teslimat için günlük kafes izlemek. Doğum sonrası günde 1 (P1) üzerine intraventriküler enjeksiyonları gerçekleştirin.
3. Enjeksiyon çözeltisinin hazırlanması
   NOT: Enjeksiyon çözeltisi transfeksiyonu için parçacıklar oluşturmak için transfeksiyon reaktifi ile plazmid DNA karıştırılması ile elde edilir. PT2 / SB100x-Luc ve iki transpozon plazmidleri: Pt / CAGGS-NRASV12 ve Pt / CMV, SV40-LGT bir oranda, aşağıda uyku güzellik transposaz ve lusiferaz kodlayan bir plazmid ile bir enjeksiyon solüsyonunun hazırlanması ile ilgili bir örnektir 1: 2: 2. Bütün plasmidler 2 ug / ul bir konsantrasyona sahiptir. Enjeksiyon çözeltisinin hazırlanması Önemli ayrıntılar Tartışma sunulmaktadır.
   1. / CMV-SV40-LGT ve 10 ul 4 ug (2 ul) PT pT2 / SB100x-Luc, pT / CAGGS-NRASV12 8 ug (4 ul) ve 8 mikrogram (4 ul): ekleyerek DNA çözüm hazırlayın 1 ug / ml'lik bir konsantrasyonda 20 ul son hacim olması için% 10 glikozDNA, ve% 5 glikoz ihtiva eder.
   2. % 5 glukoz bir son konsantrasyon elde etmek için in vivo püskürtme PEI 2.8 ul steril su içinde 7.2 ul% 10 glükoz 10 ul ekleyerek PEI çözelti hazırlayın.
   3. DNA solüsyonuna PEI solüsyonu ilave karıştırın ve girdap ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) bekletin. Çözelti enjeksiyon için hazırdır. Oda sıcaklığında bir saat sonra, buz üzerinde çözüm tutmak.
   4. Micropump içine 12.5 ° konik bir 30 ayar hipodermik iğne ile donatılmış bir 10 ul temiz bir şırınga monte (Şekil 2 # 1).
4. Enjeksiyon sisteminin düzgün çalışmasını doğrulamak için, otomatik enjektör kullanın (Şekil 2 # 1) şırınganın içine su 10 ul çekilme ve daha sonra tamamen şırınga boşaltmak için
5. Yenidoğan stereotaksik aşama soğutun (Şekil 2 # 3), 2-8 ° C bir sıcaklığa, kuru buz ve alkol, bir bulamaç ile.
6. Islak buz üzerinde yavrular yerleştirerek anestezi neden2 dakika karıştırıldı. Anestezi prosedürün geri kalan kısmında soğutulmuş stereotaksik çerçeve devam edecektir. C termal yanık yaralanmaları önlemek olacaktır ° 2-8 arasında, donma yukarıdaki çerçevenin ısısını muhafaza. Özel önlem yavrular ıslak buz üzerinde yerleştirmeden önce gazlı bez sarılmış olabilir.
7. DNA / PEI solüsyonu ile şırınga doldurun.
8. Gazlı bez kapalı kulak çubukları (Şekil 2b) arasındaki baş yerleştirerek stereotaksik çerçeveye yavru hareketsiz. Kafatasının dorsal tarafı yatay olduğundan emin olun, çerçevenin yüzeyine paralel ve kranial sütürler açıkça görülebilir ki. % 70 etanol ile baş silin.
9. Şırınga iğne indirin ve iğne lambda (parietal ve oksipital kemiklerin orta hat kesişme) (Şekil 2b) temas edene kadar stereotaksik çerçeve aramalar kullanarak stereotaksik koordinatları ayarlayın.
10. İğneyi kaldırın ve 0.8 mm yanal ve 1,5 m sterotaksik koordinatları ayarlayınLambda (Şekil 2b) m, rostral.
11. Dokunduğu ve hafifçe cildi gamzeler kadar iğne indirin. Koordinatları ölçün. Iğne başka bir 1.5 mm indirin. İğne deri ve kafatası delip, ve yanal ventrikül (Şekil 2c) girmek için korteks geçecek.
12. Otomatik enjektör kullanılarak, / dakika, 0.5 ul bir oranda bir DNA / PEI solüsyonu 0.75 ul enjekte
13. Çözüm ventriküller içine dağıtmak için izin bir dakika çerçeve üzerinde yavru tutun. Bu arada, bir sonraki enjeksiyon için hazırlanması için 2 dakika boyunca buz üzerinde, bir yavru anestezi.
14. Ve yavaşça iğne kaldırın ve bir ısıtma lambası altında yavru yerleştirin. Nefes ve etkinliğini izlemek. Gerekirse ilk nefes meydana gelene kadar, bacaklarda hafif uyarılması sağlar.
15. O kadar ısındı, düzenli nefes alıyor, bir pembe renk ulaşmıştır ve normalde 5-7 dk aktif sonra kendi annesine yavru dönün. Mo Eğerbir yavru bir defada enjekte edilir daha yeniden, tüm enjeksiyonlar yapılır kadar birlikte tüm yavrular tutmak. Enjeksiyonlar uzun 30 dakika alırsak, ilk 30 dakika ve işlem sonunda dinlendikten sonra yavruların yarısı döner.
16. Baraj duyarlı ve onu yavrularına beslenmesi olduğunu izleyin. Gerekirse, kafes bir taşıyıcı anne ekleyin.
17. Buz üzerine yavru yerleştirilmesi ve ısıtma lambası altına yerleştiren arasındaki süre, en az 10 dakika olduğundan emin olun. sağkalım daha iyi prosedür hızlı. Genellikle, bu uyutmak ve bir yavru enjekte için gereken süre 4 dakikadır.

Tümör oluşumu ve ilerleme 3. Biyoparlaklık İzleme

3.1) Enjeksiyonu sonra Plazmid Alımı İzleme

1. Enjeksiyondan sonra 24-72 saat, 6 de temiz doku kültürü çanak, bir yavru annenin kafes ve yerden tüm yavrular kaldırmak başına iyi.
2. Normal tuzlu su ya da fosfat gibi içinde çözülmüş luciferase 30 mg / ml solüsyon hazırlanmasıe tampon. Önceden bu çözelti hazırlanır ve -20 ° C'de küçük parçalar halinde saklayın.
3. Bir 30 gog hipodermik iğne ile donatılmış bir 1 ml şırınga kullanarak yavru omuz kemikleri arasında lusiferin deri altından 30 ul enjekte edilir. İğne cildi kısma ve iğne takmadan önce hafifçe kaldırarak, herhangi bir organ delmek değil emin olun.
4. Görüntü hemen, bir in vivo biyoışıldama görüntüleme sistemi kullanılarak. Otomatik pozlama, büyük binning ve diyafram f = 1: IVIS Spektrum için, satın almalar için aşağıdaki ayarları kullanın.

3.2) İzleme Tümör oluşumu ve İlerleme

NOT: Hayvanlar, 2½-6 hafta içinde biyolüminesans ve histoloji ile tespit makroskopik tümör oluşturmalarına enjekte onkojenik plazmidler bağlı başlayacak.

1. 26 gauge'lik bir iğne ile donatılmış bir 1 ml şırınga kullanarak 30 mg / ml lusiferin çözeltisi 100 ul intraperitoneal olarak enjekte edilir.
2. Anestezi bölmesi içinde hayvan yerleştirin. Aynı anda beş hayvanlara kadar enjekte edilir.
3. Daha sonra hayvanların uyutmak için oksijen / izofluran akışını (1.5-2.5% izofluran) başlatmak 5 dakika bekleyin. 3-4 dakika sonra, anestezi odasından hayvanları çıkarmak biyoışıldama odasında oksijen / izofluran akışını başlatın. Anestezi ve ışık engelsiz geçişine imkan vermek için bir cam ucu koni ile donatılmış ilgili yuvalarına hayvanlar koyun.
4. Tipik olarak, bir otomatik pozlama süresi, medyan binning ve f = 1 açık diyafram ile 2 dakika aralıklarla 6 görüntülerin bir dizi, kazanır.
5. Baş bölgesi üzerinde, tipik bir oval görüntülü tüm hayvanlar için ilgi bölgeyi ayarlayın, ve / s / cm ² / sr kalibre birimler fotonlar kullanılarak ışıma şiddetini ölçer.
6. Her bir hayvan için azami bir değer kaydedilir. Daha sonra, kayıtlar, örneğin whe, her bir hayvan ve / ya da hayvanların arası bir süre boyunca tümörün ilerlemesi sırasında karşılaştırılabilirn farklı tedaviler kullanılmaktadır.

Yeni GBM'lerde 4. histolojik ve immünohistokimyasal analizi

NOT: tümörler istenilen deneysel zaman noktasına ulaştığında, hayvanlar kurban edilebilir, beyinleri, perfüze sabit ve analiz. Hayatta kalmak için hayvan semptomatik gösteren engelli hareketlilik, kambur duruş ve pasaklı kürk olduğunda klinik evre ile tanımlanan hayvanlar insanca, tümör yükü ilk belirtileri kurban zaman can çekişen evre, deney uç noktasını temsil analizleri. Kullanılan standart histolojik ve immunohistokimyasal yöntemlerin kısa bir açıklaması aşağıda sunulmuştur.

4.1) Perfüzyon ve fiksasyon

1. 100 ketamin mg / kg ksilazin 10 mg / kg bir intra-peritoneal enjeksiyonu ile fare anestezisi.
2. Fare ayak sıkıştırarak pedal refleksini kontrol edin. Bu refleks kaldırılmıştır belirten derin anestezi, immob, karın boşluğuna açın, iğneler ile bir diseksiyon gemide fare ilize diyaframı incelemek ve kalp görselleştirmek için göğüs boşluğu açın.
3. Kalbin sol ventrikül içine bir künt 20 ayar kanül yerleştirin. Plastik boru, _CaCl2 2H ₂ O oksijenli ve heparinize edilmiş Tyrode çözeltisi (% 0.8 NaCl,% 0,0264 olan bir kaba peristaltik bir pompa aracılığıyla geçen ile kanül geç 0.005% NaH ₂ PO _4,% 0.1 glükoz,% 0.1 NaHCO _3, 0.02 % KCI). Yavaş ve sabit bir akış, hayvanlar daha küçük ise saniye ya da daha az, yaklaşık bir damla sağlamak için peristaltik pompa hızının ayarlanmasıyla Tyrode çözeltisi akışını başlatır.
4. Kan ve Tirod en akıtılmasını izin kalbin sağ atrium içine küçük bir kesi yapmak.
5. Onlar kan yoksun olmak gibi (karaciğer ve böbrekte en belirgin), iç organların haşlama gözlemleyerek perfüzyon etkinliğini izlemek.
6. Ne Zamankalp tahliye çözümü (3-5 dk) açıktır, tespit (% 4 PFA, fosfat tamponlu tuzlu su pH 7.34) için% 4 paraformaldehid için Tyrode en çözümler geçiş.
7. Boyun ve kuyruk artan sertliği ile dokuların iyi tespit izleyin.
8. Fareyi başını kesmek ve dikkatle kafatası beyni incelemek.
   1. Burun doğru, rostrally kafatası kapsayan kürk çekin ve baş, sırt tarafı yukarı stabilize etmek için sıkıca yakala.
   2. Yörünge kasları ve altta yatan elmacık kemerler transect için, yörüngesinin kenarında aşağıya kesilmiş bir keskin neşter, kullanma.
   3. Baş ventral yüzü yukarı çevirin ve bir rongeur kullanılarak ekli boyun kasları kaldırın. İlk omur Crush ve beyin sapı çıkarın.
   4. , Koklea görselleştirmek ronjur ile örten zamansal kemik kapmak ve temporal ve oksipital kemik arasında bir açıklık oluşturmak. Beyincik yüzeyinden oksipital kemik soyulabilir.
   5. Ronjur ile burun kemiği örten Crush. Dikkatlice kalan frontal kaldırmak ve beynin yüzeyine zarar vermemek için dikkatli olmak beynin yüzeyinden kemikleri parietal. Orbital alanda özellikle dikkat edin.
   6. Baş ventral yüzü yukarı çevirin. Beyin sadece kranial sinirler aracılığıyla artık bağlı, kafatasının geri kalan aşağı doğru kayacaktır. Kullanımı küçük makas koku, optik ve trigeminal sinirleri kesti. Bu beyin yayınlayacak.
9. Sonrası tespiti için gece boyunca 4 ° C 'de% 4 PFA beyin yerleştirin.
10. Histolojik analiz ve hematoksilen-eozin boyama için, 24 saat boyunca fosfat tampon beyinleri aktarmak ve daha sonra gömme parafin devam edin.
11. (Beyin tüpün dibine çöker kadar) immüno-histolojik analiz için, 24-48 saat boyunca fosfat tamponlu tuzlu su içinde bir% 30 sukroz çözeltisi içine beyin aktarmak
12. Tümör bölgenin ortasından ikiye Bölüm beyinleri, kesme yerleştirmekaşağı dondurma kalıp içine yandan, kuru buz etanol, kuru buz izopentan bir bulamaç veya sıvı azot içine kriyo gömme ortamı (Ekim bileşiği) ve ani-dondurma içine gömmek. Kesit ve boyama kadar -80 ° C donmuş blokları tutun.

4.2) Parafin Hematoksilen-Eosin Boyama İçsel GBM'lerde ve Histo-patolojik Analiz Brain Gömülü

1. Bölüm parafin cam slaytlar üzerine 42 ° C su banyosunda düşmesi ve montaj, 4 mikron kalınlığında beyin gömülü.
2. Iksilen ile doldurulmuş üç kayıcı kaplar bir dizi 5 dakika aralıklarla aktarılması daha sonra 60 ° C'lik bir fırında 10 dakika boyunca yerleştirilerek tarafından De-paraffinize kayar.
3. 2 dakika boyunca% 100 etanol kez tekrar,% 95 etanol, 2 dakika, bir kez, tekrar% 70 etanol, 2 dakika süreyle ve daha sonra su, slaytlar: etanol banyoları bir dizi slaytlar hidratı.
4. 2 dakika boyunca Harris hematoksilin ile dolu bir slayt kap içine daldırılmasıyla slaytlar Leke.
5. Su netleşene kadar musluk suyunda yıkayın.
6. Dip iki bluing solüsyonu (% 0.1 Sodyum Bikarbonat) içine kayar.
7. Slaytlar 2 dakika süreyle musluk suyunda bekletin, daha sonra 2 dakika süreyle% 80 etanol transfer.
8. 5 dakika boyunca Eosin ile dolu bir kap içine daldırılmasıyla slaytlar Leke.
9. (Kez tekrarlayın, bir kez% 100 etanol 2 dakika tekrarlayın,% 80 etanol 3-4 dips,% 95 etanol 2 dakika) etanol banyoları bir dizi slaytları kurutmak.
10. Ksilen 3 ardışık banyoları, 3 dakika, her ile Berrak.
11. Bir ksilen bazlı yapıştırma vasatı ile lamel ve görüntüleme için hazır olana kadar oda sıcaklığında düz bir yüzey üzerinde kurumaya bırakın. Oda sıcaklığında saklayınız.

De Novo Bağlı GBM'lerde Moleküler ve Hücresel Karakterizasyonu için Cryo-korunmuş Gömülü Brain 4.3) Immuno-histokimya

1. -80 ° C'de depolama donmuş blok almak kriyostat içine koyun ve sıcaklık 30 dakika boyunca dengelenmeye bırakın.
2. Bölüm 12-14 Mikron kalınlığında kesitler ve pozitif yüklü cam slaytlar üzerine 2-3 bölümleri monte edin. Farklı slaytlar bitişik bölümleri toplayarak, seri bölümleri kesin. Bu tümör içinde yan doku kesimlerinde farklı antikorlarla boyama sağlar.
3. Doku iyi yapışma sağlamak için kesit sonra en az 1 saat boyunca bir kurutucu içinde kuru kayar.
4. Bölümleri kapsayacak şekilde ve yıkama sırasında slayt üzerinde kalmak için sıvı sağlamak için sürgünün her iki ucunda da (bir hidrofobik işaretleyici ile) bir hidrofobik engel oluşturur. % 0.1 Triton-X ile fosfat tamponlu tuzlu bir çözelti ile bölümleri (PBS,% 0.1 TX) ile kaplayın ve yavaşça doku geçirgenliği yatay çalkalayıcı üzerinde 5 dakika boyunca çalkalanır. Iki kez tekrarlayın.
5. Yumuşak çalkalama ile 30 dakika boyunca, spesifik olmayan (sekonder antikor yükseltilmiş olan bir hayvan ya da serumda),% 10 normal keçi serumu çözeltisi ile bağlanmasını bloke
6. PBS içinde% 0.1,% 2 normal keçi serumu içinde primer antikor çözeltisi hazırlayınTx ve bölümler üzerinde çözüm pipetle. Karanlıkta kapalı nemli bir oda içinde slaytlar yerleştirin ve gece boyunca oda sıcaklığında tutulması.
7. Sonraki gün, PBS,% 0.1 Tx 5 dakika boyunca bölümleri üç defa yıkamak ve bir saat boyunca,% 2 normal keçi serumu ile PBS, 0.1% Tx seyreltildi fluorescent sekonder antikor inkübe edin.
8. Floresan koruyacak montaj orta tabanlı bir suyla yıkayın kez daha, temiz su ve lamel içinde, 2 dakika süreyle bir nükleer leke (örneğin, DAPI) ile counterstain PBS% 0.1 Tx ile 5 dakika boyunca bölümleri üç kez yıkayın. Düz bir yüzey üzerine slaytlar yerleştirin ve onları görüntüleme için hazır olana kadar karanlıkta, en az 24 saat süreyle tedavi sağlar. 4 ° C'de daha sonra tutun.

Belirli Genetik Farklılık Primer Tümör Hücre Hatları 5. Nesil.

1. Güzellik tümör taşıyan farelerin Sleeping hücre hatları oluşturmak için teyit büyük tümör (biyolüminesans 10 ⁷ -10 ⁸ fotonlar / s / cm olan bir fare seçin2 / sr).
2. (4. bölümde açıklandığı gibi) kafatası beyni incelemek dikkatli, izofluran anestezi aşırı dozda fare Euthanize hayvan başını kesmek ve. Temiz bir Petri kabındaki beyin yerleştirin.
3. Bir jilet kullanarak, tümör koronal kesim anterior ve posterior yapmak. Tümörün yeri nedeniyle beynin şeffaflık genellikle tanınabilir.
4. Ince forseps ile çapı tümör, genellikle 5-7 mm inceleyin ve 300 ul Nöral Kök Hücre Medya ile dolu bir 1.5 ml tüp içine yerleştirin (MGK Medya: B-27 takviyesi, N2 ek ve Normocin ile DMEM / F12 ile desteklenmiş 20 ng bir konsantrasyonda insan rekombinant EGF ve bFGF / ml her biri).
5. Hafifçe tüpün duvarlarına uygun plastik bir havan ile tümör homojenleştirin.
6. Enzim içermeyen doku ayrılma çözeltisi 1 ml ilave edilir ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
7. , 70 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu geçmesi 10 ml süzgeç yıkayınMGK medya, 4 dakika, decant süpernatant ve 300 xg'de santrifüj MGK medya 7 ml pelet yeniden askıya.
8. % 95 hava ve% 5 _CO2 doku kültürü kuluçka makinesine sahip ve bir atmosferde 37 ° C 'de bir T25 kültür şişelerinde ve kültür üzerine plaka. 3 gün sonra, bazı hücreler bazı kültür çanak alt yapıştırılır, öldü ve bazı serbestçe medya yüzen, şekillendirme neurospheres vardır.
9. Bir T75 doku kültürü şişesine üzerine bu askıya hücreleri ve yeniden plakasını sökün.
10. Kültür bir üç gün sonra, neurospheres toplamak, Aşama 5.6 de tarif edildiği gibi hücre süzgecinden, gerilme ayırmak ve hücreleri sayın. T75 şişe için EGF ve FGF ile takviye MGK 14 ml bir milyon hücre yoğunluğunda fetal sığır serumu,% 10 DMSO içinde hücreler ve geçiş hücreleri hacimde dondurun. büyüme tümör oluşturmak için kullanılan onkogenler bağlıdır. Büyümeyi engellemek ve nispeten yüksek yoğunlukta hücreleri korumak için hücre kültürü koşulları adapte.

Sonuçlar

SB-kaynaklı glioblastomlar histo-patolojik özellikleri karakterize etmek için, C57 / BL6 fareleri, neonatal plazmidler onkojenik DNA, örneğin, NRAS (Pt / CAGGS ile transpozonlar kodlayan ile kombinasyon halinde bir plazmid kodlayan lusiferaz (pT2 / SB100x-Luc) ile P1 enjekte edilmiştir -NRASV12) SV40 LGT (PT / CMVSV40-LGT) (Şekil 3c) veya PDGFβ ile kısa saç tokası p53 ve NRAS (Şekil 3d ile kombinasyon halinde bir GFP raportör (pT2shp53 / GFP4 / mPDGFβ) kodlayan bi...

Tartışmalar

Bu makalede, biz detay yenidoğan farelerin subventriküler bölgesini çevreleyen hücrelerin içine onkojenik plazmid DNA SB transposase- aracılı entegrasyon kullanarak GBM yeni modeller üretmek için çok yönlü ve tekrarlanabilir bir yöntem. Biz yeni ilgi genleri ile Transposon plasmidlerini oluşturmak için bir protokol mevcut, canlı hayvanlarda tümörlerin ilerlemesini izlemek için nasıl, bu tümörlerin histopatolojik ve immunohistokimyasal özellikleri karakterize nasıl göstermektedir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Stoelting's Lab Standard with Rat and Mouse Adaptors	Stoelting	51670	Other companies produce similar frames, any of them with small mouse adaptors are suitable
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)	Stoelting	53311	Injections can be made without it, ,but    the automatic injector allows for increased reproducibility and convenience
10 μL 700 series hand fitted MICROLITER syringe	Hamilton	Model 701	This syringe model will deliver from 0.5 to 500 ul of solution reliably. Other syrnges (fro example 5 ul, Model 75) may also be used
30 gauge gauge hypodermic needle (1.25", 15o bevel)	Hamilton	S/O# 197462	This needle is ideal to pierce the skin and the skull of a neonatal mouse without the need of other invasive procedures. If it gets dull (doesn't easily enter the skin), it needs to be replaced.
in vivo-jetPEI	Polyplus Transfection	201-10G	Aliquot in small volumes and keep at -20oC
D-Luciferin, Potassium Salt	Goldbio.com	LuckK-1g	Other sources of firefly lucifierase are just as adequate
Hematoxylin Solution, Harris Modified	Sigma Aldrich	HHS128-4L
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Electron Microscopy Sciences	62550-01	for embedding brains for cryosectioning and immunohistovhemistry
Advanced DMEM/F-12, no glutamine	Life Technologies	12634-010	for the culture of neurospheres
B-27¨ Supplement (50X), serum free	Life Technologies	17504-044	serum free supplement for the culture of neurospheres
N2 Supplement (100x)	Life Technologies	17502-048	serum free supplement for the culture of neurospheres
Normocyn	InvivoGen	ant-nr-1	anti-mycoplasma agent for the culture of neurospheres
Recombinant Human EGF	PEPROTECH	AF-100-15	growth factor supplement for the culture of  neurospheres
Recombinant Human FGF-basic	PEPROTECH	100-18B	growth factor supplement for the culture of  neurospheres
HyClone HyQTase  Cell Detachment Reagent	Thermo Scientific	SV3003001	for the dissociation of neurospheres
Kimble-Chase Kontes Pellet Pestle	Fisher Scientific	K749510-0590	for the dissociation of freshly dissected tumors
Falcon Cell Strainers mesh size 70um	Fisher Scientific	08-771-2	for generating single cell suspensions of dissociated neurospheres
Xylenes Histological grade	Fisher Scientific	C8H10
Protocol Harris Hematoxylin Mercury free ( acidified)	Fisher Scientific	245-678
Protocol Eosyn Y Solution ( intensified)	Fisher Scientific	314-631