Qué hacer y qué no hacer en la preparación de Muscle criosecciones de Análisis histológico

Resumen

Here we demonstrate the most efficient methods for freezing, embedding, cryosectioning, and staining of muscle biopsies to avoid freezing artifacts.

Resumen

La evaluación histológica de las biopsias musculares ha servido como una herramienta indispensable en la comprensión del desarrollo y la progresión de la patología de los trastornos neuromusculares. Sin embargo, con el fin de hacerlo, el cuidado apropiado debe ser tomado cuando la escisión y la preservación de los tejidos para lograr tinción óptimo. Uno de los métodos de conservación de tejidos implica la fijación de tejidos en formaldehído y luego incrustarlos con cera de parafina. Este método preserva la morfología bien y permite el almacenamiento a largo plazo a temperatura ambiente pero es engorroso y requiere la manipulación de productos químicos tóxicos. Además, los resultados de fijación en formol antígeno entrecruzamiento, lo que requiere protocolos de recuperación de antígeno por inmunotinción eficaz. Por el contrario, seccionado congelado no requiere la fijación y por lo tanto retiene conformación antígeno biológica. Este método también proporciona una clara ventaja en vuelta rápida alrededor del tiempo, por lo que es especialmente útil en situaciones que requieren evaluación histológica rápida como intraoperaTIVE biopsias quirúrgicas. A continuación se describe el método más eficaz de preparar biopsias musculares para la visualización con diferentes tinciones histológicas e inmunológicas.

Introducción

El examen de histología muscular juega un papel crítico en la comprensión de los diferentes tipos de trastornos neuromusculares ^1-4. Cuando se combina con otras técnicas, permite a los investigadores para obtener una mejor idea de la manifestación y la progresión de la patología y también pueden ser esenciales para evaluar la eficacia de una intervención terapéutica ^5-10. Sin embargo, para ser precisos, los tejidos necesitan ser conservado en la manera apropiada a fin de preservar el estado fisiológico inmediatamente antes de la escisión. Esto requiere gran cuidado durante la extracción, preservación, seccionamiento y tinción.

Los tejidos pueden prepararse de dos maneras diferentes para estudio microscópico de luz. El primer método, formol fija en parafina (FFPE) secciones, requiere tejidos que se fijaron en formaldehído al 10% tamponada naturales antes de ser integrado con cera de parafina ^11,12. La etapa de fijación ayuda a preservar la morfología mejor, pero también vínculos transversales pr endógenaoteins necesitando por lo tanto los procedimientos de recuperación de antígeno intrincada de inmunotinción y eliminando la posibilidad de tinción enzimática en tales secciones ^12. Las secciones congeladas, por otra parte, no tienen que ser pre-fijo o procesados; por lo tanto, las proteínas son capaces de retener conformaciones biológicos nativos ^13,14. Además, las secciones congeladas también permiten el tiempo de respuesta rápida, que a veces es necesario, por ejemplo en el diagnóstico intraoperatorio de los sarcomas y otros biopsias quirúrgicas ^15. Sin embargo, si no se hace correctamente, este método es propenso a los daños por congelación, que introduce cambios en la arquitectura muscular haciendo las secciones no aptos para el examen histológico. En este trabajo se expondrá el método más eficaz para preparar las biopsias musculares para lograr tinción óptimo para examen adecuado.

Protocolo

1. Tejido Cosecha y congelación de los tejidos musculares

1. La eutanasia del ratón con una sobredosis de isoflurano (2-cloro-2- (difluorometoxi) -1,1,1-trifluoro-etano). Realice este paso en una campana de extracción y el uso de un método de contención secundaria, como un secador o una campana de vidrio que contiene un hisopo de algodón empapado en isoflurano.
2. Confirmar la muerte apretando firmemente la almohadilla plantar. Use un método secundario de la eutanasia como la dislocación cervical.
3. Humedezca la piel con alcohol al 70% para reducir la adherencia de los cabellos sueltos sobre los músculos. Pelar la piel de la extremidad utilizando unas pinzas finas como el # 5.
4. Separar cuidadosamente el músculo de interés (tibial anterior (TA) en este caso) de los huesos por debajo, a partir de tendón y quitar.
5. Extirpar el músculo, cubrirlo en octubre (compuesto temperatura óptima de corte), y déjelo sobre un molde de congelación desechables etiquetados. Asegúrese de que el músculo está en su orientación fisiológica normal (cabeza para tail) sin estirar. Alternativamente, congelar el músculo en pequeños cuadrados de espuma de poliestireno y el pin con alfileres de insectos para asegurar la longitud correcta de los músculos.
6. Chill 2-metilbutano (isopentano) en un vaso de precipitados de acero usando nitrógeno líquido. Esto toma en promedio 3-5 min. Mantener la agitación intermitente hasta precipitados blancos comienzan a formarse en la parte inferior y las paredes del vaso de precipitados.
   NOTA: Cuando esto ocurre, isopentano ha alcanzado la temperatura óptima de congelación (-150 ° C)
7. Sumerja los moldes que contienen músculos en el frío 2-metilbutano. Congele pequeños músculos como el diafragma y el extensor largo del dedo dedos (EDL) durante 6-12 segundos y músculos más grandes como el sóleo gastrocnemio (GS) y tríceps de 15 a 20 seg. No congelar los músculos durante demasiado tiempo ya que esto puede conducir a la rotura.
8. Transferir los tejidos congelados sobre hielo seco y dejar que se evapore isopentano (tenga en cuenta que este proceso toma en promedio alrededor de 15 a 20 min). Envuelva los tejidos en papel de aluminio y almacenarlos en ultra baja temperatura (-70 ° C a -80 ° C) hasta el corte.

2. Incorporación de los tejidos en octubre preparar Tissue Bloquear

1. Tejidos Transporte en hielo seco para cyrostat para evitar la descongelación. Transferencia de tejido a criostato cámara (establecido a de -20 a -24 ° C para evitar la descongelación completa de los tejidos) y dejar que se equilibren durante 30 min.
2. Gire la bahía Peltier de enfriamiento en. Si el criostato no tiene este enfriamiento, utilice aerosol spray de refrigeración para congelar rápidamente la OCT. No deje que el deshielo del músculo en cualquier momento durante la incrustación ya que esto puede resultar en daños por congelación.
3. Añadir una fina capa uniforme de octubre en el disco muestra y dejar enfriar. Cuando la mayoría de la OCT se congela en el fondo mientras que todavía líquido en la parte superior, inserte el tejido en la orientación correcta (perpendicular a octubre para las secciones transversales y paralelas a octubre de secciones longitudinales). Utilice aerosol spray de refrigeración para congelar rápidamente octubre Toque la parte unembeded del tejido con el calor extractor y esperar 45 seg.
4. Añadir otra capa delgada de octubre alrededor del músculo, rociar con aerosol spray de enfriamiento y extraer el calor como en el paso anterior.
5. Mantenga la adición de octubre en pequeños incrementos y rápidamente congelar el octubre mediante una combinación de aspersión y extractor de calor de refrigeración aerosol hasta que el músculo está cubierto.
6. Ponga el extractor de calor en la parte superior del bloque de tejido y esperar 5 min.

3. Preparación de las secciones e identificación de las Secciones de Mid-vientre Región de los músculos

1. Montar la muestra sobre la cabeza de la muestra. Apriete la perilla para asegurar el disco. Asegúrese de que el disco de la muestra se encuentra en buen contacto con la cabeza de la muestra.
2. Ajuste la temperatura de la cámara a entre -21 y -24 ° C y espere hasta que se alcanza la temperatura programada.
3. Ajuste los valores de espesor (7 micras); recortar el bloque mediante el avance o retroceso del bloque usando ajustes gruesos y finos.
4. Recoge las seccionesen pre-calentado portaobjetos cargados positivamente presionando la parte superior de la diapositiva en secciones, con la atracción entre cargas opuestas para facilitar la adherencia de las secciones cortadas a la diapositiva.
5. Identificar las secciones mediados de vientre mediante la medición de área de sección transversal (CSA) de las secciones. Para ello, el software de imágenes usando en el equipo que está conectado al microscopio.
   NOTA: Las imágenes de contraste de fase se toman y la circunferencia de todo el músculo se mide a través de una función de seguimiento del programa de software. Esto producirá tanto CSA así como hurón diámetro mínimo (medida de la fibra de tamaño de sección transversal que se expresa como la distancia más pequeña entre dos tangentes paralelas en lados opuestos de una partícula) mediciones. Nota: Cuando las mediciones CSA y diámetro mínimo hurón comienzan a estabilizarse, se ha llegado a mediados del vientre.
6. Inventario y archivar las diapositivas a -80 ° C para la tinción futuro.
   NOTA: octubre no tiene que ser eliminado antes de staininprocedimientos g. Una vez portaobjetos se cubrieron, que están listos para ser manchado inmediatamente.

4. La tinción

NOTA: Si bien los procedimientos detallados paso a paso se pueden encontrar en la hoja de datos del producto y se deben seguir los procedimientos de tinción, la optimización del personal puede ser requerido para obtener la tinción óptima.

1. Debido a que los medios de montaje (véase la tabla) no es miscible con agua, deshidratar diapositivas a través crecientes grados de alcohol (2 min cada uno en 70%, 95%, y 100% de etanol) y claro ellos con xileno (100% durante 5 min) para asegurar diapositivas no se vuelven opacas en el tiempo.
2. Cubreobjetos secciones y déjelos secar. Imagen con microscopio equipado con software de imágenes.

Resultados

La puesta a punto para la cosecha y la congelación de los tejidos se puede ver en la Figura 1. Tejidos extirpados se deben almacenar en una gasa empapada en PBS para evitar el secado (Figura 1A). Cuando se seleccionan los tejidos a ser utilizado para el análisis histológico deben ser sumergidos en OCT y se presentarán en molde crio en la orientación adecuada y lo más cerca a la longitud fisiológica como sea posible para asegurar la morfología exacta (Figura 1B)....

Discusión

Histología e inmunohistoquímica se han utilizado como herramientas clave en la comprensión de la manifestación y la progresión de la patología en diversos trastornos neuromusculares. Clásicamente, las biopsias musculares se fijaron por primera vez en formaldehído y luego incrustados con cera de parafina. Si bien la fijación de formaldehído conserva la arquitectura del tejido y permite el almacenamiento y transporte del tejido a temperatura ambiente, también inactiva las enzimas y los entrecruzamientos proteí...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryostat	Leica CM 1850	Leica Microsystems Inc.	Buffalo Grove, IL 60089 U.S.A., office phone 1-800-248-0123 Alternative: Richard Allen Scientific
Microscope	Nikon Eclipse 50i	Nikon Instruments Inc.	1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternative: Olympus
Image analysis software	Nikon Imaging Software Basic Research	Nikon Instruments Inc.	1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternatives: Image J, Metamorph
Isoflurane	14043-220-05	JD Medical Dist. Co., Inc.	1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 U.S.A.
OCT	4583	Sakura Inc.	Torrence, CA 90501 U.S.A. Alternative source: Leica Microsystem
Freeze It	23-022524	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Disposable tissue mold	22-363-554	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Colorfrost plus slides	9991001	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Acetone	650501-4L	Sigma-Aldrich	3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Ethyl alcohol	HC-1300-1GL	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
2-methyl butane	M 32631-SL	Sigma-Aldrich	3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Xylene	HC-7001GA	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Cytoseal 280	8311-4	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Hematoxylin Gill #3	CS402-1D	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Eosin	6766007	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific