急性アルツハイマーなどの認知障害を誘発するために正常マウスにおけるアミロイドβペプチドの脳室内注射

要約

アミロイドβ（Aβ）は、動物モデルが定義された量とAβ断片の種の管理を可能にし、各研究グループ内の個人差を低減-injected。このプロトコルは、正常マウスにおけるアルツハイマー様の行動異常の製造を可能にする、定位楽器なしでAβの脳室内（ICV）注射を説明しています。

要約

Amyloid-β (Aβ) is a major pathological mediator of both familial and sporadic Alzheimer's disease (AD). In the brains of AD patients, progressive accumulation of Aβ oligomers and plaques is observed. Such Aβ abnormalities are believed to block long-term potentiation, impair synaptic function, and induce cognitive deficits. Clinical and experimental evidences have revealed that the acute increase of Aβ levels in the brain allows development of Alzheimer-like phenotypes. Hence, a detailed protocol describing how to acutely generate an AD mouse model via the intracerebroventricular (ICV) injection of Aβ is necessary in many cases. In this protocol, the steps of the experiment with an Aβ-injected mouse are included, from the preparation of peptides to the testing of behavioral abnormalities. The process of preparing the tools and animal subjects before the injection, of injecting the Aβ into the mouse brain via ICV injection, and of assessing the degree of cognitive impairment are easily explained throughout the protocol, with an emphasis on tips for effective ICV injection of Aβ. By mimicking certain aspects of AD with a designated injection of Aβ, researchers can bypass the aging process and focus on the downstream pathology of Aβ abnormalities.

概要

アミロイドβ（Aβ）は、アルツハイマー病（AD）の病理学的特徴であることを考慮すると、ADの動物モデルの開発は、Aβの神経の過剰発現に焦点を当ててきました。アミロイド前駆体タンパク質（APP）またはプレセニリン（PS）の変異はAβの平衡の乱れに、最終的に家族性AD ¹の病因につながるので、APPまたはPS遺伝子変異を伴うマウスモデルは、一般的に受け入れられています。 TG2576、PDAPP、APP / PS1とAPP23：トランスジェニックマウスの広い範囲の中で、原型のマウスモデルは、以下を含みます。脳では、これらのマウスは、一般的に、Aβ凝集し、最終的に老人斑を示します。プラーク形成は、彼らが学習と記憶の行動試験に劣った性能を示すように、かなりの認知障害が続いています。自然に人間のAD病理を模倣するトランスジェニックマウスを用いての生成は、このようにディの進行をモニターするために私達を可能にすることにより、ADの研究、社会に貢献してきましたsea​​se。それは、Aβ斑を発症するマウスについてヶ月かかり、より長いAβ誘発性シナプスまたは行動異常^2,3を表示するためしかし、トランスジェニックマウスを使用して不経済であり、時間がかかります。元々のトランスジェニックマウスモデルの欠点を克服するための代替手段として開発され、非トランスジェニックモデルはまた、一般的に、それらの明確な利点のために使用されています。 ADのような認知障害は、他の化学的および物理的手段、例えばかかるスコポラミン、病変の誘導のような神経毒性化合物の注射などによってトリガすることができる一方、病原体誘導性のADモデルは、脳内のAβの直接注入することにより製造することができますこのような海馬のような認知関連分野で、または皮質損傷⁴によります。しかし、認知障害の非病原性誘導は正確にADの根本的な病態生理を反映するものではありません。その代わりに、それだけで、その症候成果を模倣します。対照的に、病原体誘導性のADモデル、A46; -injectedマウスモデルは、AD様行動異常を示すことができるだけでなく、Aβ病理学、家族性および散発性ADによって共有される共通の特徴を示すことができます。

脳組織内のAβプラークを可視化する難しさにもかかわらず、ADの調査のために、それが魅力的Aβを注射したモデルの最大の利点は、その制御性です。研究者らは、薬物関連の研究に誤ったデータにつながる可能性マウスモデルにおける個人差を取り除くことができます。タイムリーな薬物治療は、候補薬物のメカニズムに応じて有効になっています。詳しく説明するように、Aβ凝集の阻害剤は、Aβの注入の前に適用することができます。さらに、研究者らは、他の要因が密接に個人差を含めて、制御されているため、Aβの注射後に生じる病原性形質転換は、Aβの暴露に由来することを想定することができます。

hのこのプロトコルでは、鮮やかな説明OWが提示され、定位楽器ずにAβの脳室内（ICV）注射を介して、正常なマウスにおけるAD様の表現型を誘導します。脳組織への挿入誘発損傷を最小化することは構造的損傷および病変誘発性炎症の可能性を防ぐために不可欠です。マウス操作でのスキルの不足が予想外の神経細胞損傷につながります。また、注入中に達成することが適切な角度と深さを可能にする技術は、頻繁なミスを回避することが特に重要です。 ICV注入の詳細、鮮明な説明に加えて、以下の手順により作成したモデルの信頼性は、以下のセクションに示されています。以下のプロトコルは、それによって最終的にADの社会のために意味のある発見につながる可能性が踏み台を提供し、ADの研究に貢献し信頼性の高い、容易に理解ツールである可能性があります。

プロトコル

全ての動物実験は、実験動物の管理と使用に関する健康ガイドの国立研究所に従って行う（NIH出版番号8023、1978年改訂）との制度的動物実験委員会の動物実験委員会としました。 KIST（ソウル、韓国）。

1.動物の準備

1. 7週齢の雄性ICRマウス（またはC57BL / 6）のグループを準備します。
2. マウスは恒常性を回復するために輸送した後、3-7日間順化過程を経て行きましょう。一般に、各ケージに4-5匹のマウスのグループを配置し、12月12日時間の明/暗サイクルで、22から23°Cと40％の湿度でそれらを維持します。水や食料を自由に提供します。
   注：順化プロセスは、新しい住宅、食料、水、および臭いだけでなく、新しいケージと光周期に出荷と適応のストレスからの回復を可能にすることが重要です。この実験では、マウスはのSpeに位置する個別換気ケージ（IVCS）に収容しましたcific病原体フリー（SPF）グレードの施設
3. 各マウスを秤量し、その重量平均から±10％を外れた被験者を除外します。
4. 二つのグループに被験者を分割：車両注射群（Aβを（ - ））およびAβ注射群（Aβ（+））。実験は、特定の薬物候補の有効性を試験する場合、4つのグループにマウスを分ける：（1）Aβ（ - ）/薬（ - ）、（2）Aβ（ - ）/薬（+）、（3） Aβ（+）/薬（ - ）、および（4）Aβ（+）/薬（+）。

2.Aβペプチドの準備

1. 任意の凝集体を溶解するために、 ^図6のペプチドが均質にするために予冷1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール（HFIP）を用いて、化学合成⁵を介して、または商業的供給源に由来するAβペプチドを、治療。
   1. （室温で）5分間水浴超音波処理中のAβ/ HFIP溶液を、穏やかに渦を超音波処理し、室温で30分間この溶液をインキュベートします。完全に窒素で蒸発によってHFIPを削除します使用するまで-80℃で均質なAβを格納します。
2. Aβモノマー調製：1mMのAβのジメチルスルホキシド（DMSO）ストックを作成し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で10倍に希釈し（100μMAβ、10％DMSO、90％PBS）。
3. Aβオリゴマーを準備します。
   1. それぞれ、3または7日間37℃で（ステップ2.2）（Aβ（1-42）またはAβ（1-40）を含む）、Aβのモノマー溶液をインキュベートします。
   2. インキュベーション期間中の水の蒸発を防ぐために加湿環境を提供するために、湿った紙タオルを含有するジッパーバッグに封管中Aβ溶液を置き。
4. 未修飾タンパク質⁶の光誘導架橋とドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により調製Aβオリゴマーを確認します。
5. 車両ICV注入のための10％のDMSOを含む対照PBS溶液を準備します。

3.シリンジの準備

1. ICV注入のための26のGステンレス鋼針でマイクロシリンジを準備します。
2. 外科的処置のために使用されるすべての他の装置とオートクレーブ中で注射器を滅菌します。オートクレーブした後、20分間UV光の下で装置を配置します。
3. 脳（ 図1A）への注入の深さで最大の精度を可能にするために3.8ミリメートルにその長さを調整するためにパラフィルムでマイクロシリンジの針を包みます。 （B6マウスの場合は、3.6ミリメートルに注射針を調整します）。
   注：パラフィルムの圧縮は、3.6ミリメートルの腹を超える注入の深さにつながります。針の挿入中に圧縮されることからパラフィルムを防止するために、密に針を複数回折り返します。
4. 二回、70％エタノールで注射器の内部空間を洗います。
5. RTで30分間水浴超音波処理中に注射器と針を超音波処理します。
6. 二回、70％エタノールで注射器の内部空間を洗います。
7. シリンジをすすぎます蒸留水でかつより長い30分間ヒュームフード内で完全に乾燥させてください。 Aβの注入を開始する前に20分間、UV光の下でクリーンなシリンジを残します。

4.Aβを注射したマウスモデルの準備

注：無菌状態を維持し、70％エタノールおよびUV露光を使用して、ICV注入のためのすべての手術器具を滅菌するために消毒剤で術野を清掃してください。

1. キシラジン（20ミリグラム/ kg）およびチレタミンの混合物の腹腔内注射によってマウスを麻酔・塩酸/ゾラゼパム・ICV注入前のHCl（80ミリグラム/キログラム）。麻酔をかけながら、その体温を維持し、足ピンチ応答を評価することにより、十分な麻酔を確認するために暖かいマットの上にマウスを置きます。
2. 滅菌PBSは、手順（ 図1B）の間に角膜の乾燥を防ぐために、両眼に低下し適用します。
3. difficuの場合には、それらの表面上の複数のまっすぐな垂直線を描画することにより、2つのミラーを準備しますLTY垂直に注射器を注入します。
4. 右隣のマウスの体と他の（M2）に頭の前で1ミラー（M1）を配置します。マウスの2つの眼の間の架空の正中線にM1を平行に保ち、2面が90°の角度（ 図1C）を形成するように、M1に対して垂直にM2を手配。研究者が右利きの場合は、マウスの左側にM1を配置します。研究者が左利きされている場合は、マウスの右側にM1を配置します。
5. マウスの額の真ん中に70％エタノールをスプレーし、乾いた綿棒でそれをこします。アルコールの蒸発に体温を下げる回避するために、額の面積が大きすぎる濡らさないでください。
6. きれいな綿棒を使用して、2％クロルヘキシジン溶液で額に同じ領域を拭いてください。 3回ずつの合計のためのアルコールとクロルヘキシジンとscrubbingsを繰り返します。
   注：必要に応じて、possiを最小限にするために、マウスの額の毛を剃ります汚染の性
7. ブレグマの位置を確認します。
   1. 親指と人​​差し指を使用して、しっかりと、額の皮膚を押したまま直接両眼が突出する程度には2つの目の上。ピンと張った額を作り、皮膚の下の頭蓋骨の動きを最小限に抑えるために背中の皮膚をドラッグします。
   2. マウスの両目とポイント親指と人差し指の大会、ブレグマ：3つの頂点を割り当てることによって、目に見えない三角形を形成します。 （ 図 1B、赤矢印：ブレグマ）
8. テープを測定して注入ポイントを見つけます。-1.0±0.06ブレグマへミリメートルの後方、矢状縫合に横1.8±0.1ミリメートル、深さが2.4ミリメートル（ 図1D、青い星：各半球内注入ポイント）。 （：-0.9ミリメートルの後方、横1.7ミリメートル、深さが2.2ミリメートルB6マウスの場合）
9. 偶発的空気注入を回避するために、過剰な溶液を用いて10μlのAβ溶液または車両で注射器を埋めます。
10. 目で注射器を配置電子注入ポイント（プロトコル4.7を参照）。注入点の平面に対して垂直に注射器を作ります。位置合わせは、固定された視点（ 図1C）からミラーに描かれた線との両方のミラーでの注射器のイメージを反映しています。
11. パラフィルムラッピングが皮膚に到達するまで針を挿入し始めます。
12. 着実に手保持注射器を保持し、一時停止することなく、ゆっくりと5秒かけて、Aβの溶液または車両の5μLを注入するためにもう一方の手を使用しています。注射器は、全体に垂直なままでいることを確認します。注入が完了した後、拡散のために注射器を取り外す前に、3〜5秒待ってください。
13. 元の三角形の位置を仮定すると、不要な動きから頭蓋骨を保護するために適度な圧力をかけます。傾くことなく、注射器を取り外します。
14. 回復のために暖かいパッド上にAβを注入したマウスを置き、その胸骨横臥位を維持。それが意識を取り戻すまで、無人、マウスを放置しないでください、そしてmを返しませんそれは完全に回復するまで非外科的マウスを含むケージにウーズ。
15. ステップ3.3から3.6に従った注射器を洗います。
16. 術後のマウスの移動を監視し、5〜7日間、マウスにおける感染症や病気の兆候を確認してください。

ICV領域への図1.Aβインジェクション （A）未修正の注射針と比較して、パラフィルムでラップされた注射針。 （B）PBSは乾燥を防ぐために、目に落下します。親指、人差し指でマウスの額に形成される三角形、およびマウスの両眼だけでなく、それぞれの眼から等距離虚正中。注射針の垂直注入を補助するために表面上に描かれた複数の縦線との（C）は、2つのミラー（M1及びM2）。 （D）注入点を持つ三角形、インド系マウスの各半球上（矢状ブレグマから-1.0±0.06ミリメートルと1.8±0.1ミリメートル）青い星のようにated。緑の矢印：パラフィルム、赤矢印：ブレグマこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Y迷路と脳の分析によって、Aβの注射の5確認

1. Y迷路試験^3,7,8によってAβを注射したマウスのワーキングメモリを評価します
   1. 記憶障害の発症のための注射後3日待ってください。
   2. 3つの同一の腕を持つ黒いプラスチックの迷路を使用して、Y迷路テストを実行し、標識、B、およびC、それぞれの迷路の中心から120°の角度で分岐するうち（幅×長さ×高さ10cmの×40 ×12センチセンチ）。
   3. スタートアーム（アームA）でマウスを置き、被験者が自由に8分間迷路を探索することができます。
   4. 各アームにエントリの数を測定し、alternを計算各被験者^3,9のエーション率。
2. 直接注入​​が適切にICV地域をターゲットにかどうかをチェックするために死後脳を調べます。
   1. 4.1節で概説したのと同じ手順により、マウスを麻酔。その後、頸椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げます。
   2. マウスを刎ねると手術用はさみを使用して頭蓋骨を露出するように皮膚を除去。頭蓋から組織や筋肉を削除します。
   3. 脳に損傷を与えることなく（頭頂と壁間の骨の間）ラムダ縫合の切り傷を作ります。頭頂と前頭骨、その後、後頭部と壁間の骨を削除します。鉗子を使用して頭蓋骨を削除し、髄膜を持ち上げて頭蓋骨から脳を隔離します。
   4. チルド滅菌生理食塩水で脳を洗うとメス（ 図2）と冠状方向に脳のICV域をカット。
   5. 上の針挿入の軌跡に基づいて注入領域を確認脳組織（ 図2）。針跡が心室の1に達しているかどうかを確認してください。針跡が満たす、または心室を通過しない場合は、実験結果の解析から、その被験者のデータを除外します。

結果

このセクションでは、Aβ凝集および記憶障害のY迷路評価を確認することによって得られる結果の例を示します。使用して42個のアミノ酸、Aβ単量体の混合物、オリゴマーおよび原線維（ 図3）の完全長のAβ（1-42）ペプチドを作製しました。 HFIP誘発性モノマー化工程を経て、比較的均一な単量体（レーンB）が得られました。 7日間のインキュベーション後...

ディスカッション

このプロトコルの中で最も重要なステップは、AβのICV注射です。このプロトコルは、定位固定器具^11,12なしマウスのICV領域にAβを注入するように設計されています。実験を開始する前に、代わりにAβの青色染料との練習注射の準備期間は十分な器用さを達成するために行われるべきです。注射直後には、顔料噴射が正常に行われたか否かを確認する必要があります。慎重に脳を取り出...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ICR mouse	Orientbio		male, 6~8 weeks, 27~29 g of body weight
C57BL/6 mouse	Orientbio		male, 6~8 weeks, 21~23 g of body weight
Amyloid-beta1-42	in house synthesis	n.a.	stock concentration: 1 mM/DMSO, injected concentration: 100 μM/10% DMSO and 90% PBS
ICV injection syringe (26s gauge)	Hamilton	80308
Evans blue dye (EBD)	abcamBIochemicals	ab120869	1 % EBD in PBS
DMSO	Sigma	D2650
PBS	gibco	10010-023
Gradi-GelTM II Gradient PAGE Analysis Kit	ELPiS Biotech	EBS-1056	15% Gel
Precision Plus ProteinTM Dual Xtra Standards	Bio-Rad	161-0377
Silver-Staining Kit	GE-Healthcare	17-1150-01