Sitokrom Kapsüllenen<em&gt; C</em&gt; Metal Nanopartiküller olmadan Silika Aerojel Nanoarchitectures Gaz faz biyoaktivitesinin İstinat ederken

Özet

Bu prosedür bioaerogels oluşturulması için _(SiO2), sol-jel, işlemi, bu jelleri silis sitokrom c (cyt. C) kapsül haline getirilmesi ve hızlı bir şekilde bir gaz-fazlı reaksiyon ile nitrik oksit (NO) tanımak için bu bioaerogels kullanımı açıklamaktadır. protokol Bu tip biyosensörlerde veya diğer biyoanalitik cihazlar gelecekteki gelişimi yardımcı olabilir.

Özet

fonksiyonel bileşikler aerojel içinde kapsüllü zaman bu tür sensörler, piller ve yakıt hücreleri gibi uygulamalar çok gözenekli aerojel kullanımı yoluyla geliştirilmiştir. Bununla birlikte, aerojel oluşturmak için işlenir, sol-jel içindeki proteinler kapsüllenmesi ile ilgili çok az sayıda rapor vardır. Silika sitokrom c (cyt c.) Sarmalamak için bir prosedürü _(SiO2) süperkritik olarak nitrik oksit gaz fazı aktiviteli bioaerogels oluşturmak için işlenir, sol-j eller (NO) sunulmuştur. Sit. C kontrollü protein konsantrasyonu altında karışık bir silika solüsyonu ilave edildi ve mukavemet koşullarını tampondur. Sol karışımı daha sonra jel haline ve bu jel, gözeneklerin doldurulmasında sıvı, sıvı karbon dioksit ile solvent değişim bir dizi değiştirilir. Karbondioksit kritik noktaya getirdi ve CYT kuru aerojel oluşturmak için kapalı boşaltılır. Içeride kapsüllü c. Bu bioaerogels UV-görünür Spektroskopisi ile karakterizedirD dairesel dikroizm spektroskopi ve gaz fazı nitrik oksit varlığını tespit etmek için kullanılabilir. Bu işlemin başarısı Cyt. C konsantrasyonu ve tampon konsantrasyonunun düzenlenmesi bağlıdır ve metal nanopartiküller gibi diğer bileşenleri gerektirmez. Potansiyel gelecek biyoanalitik cihaz gelişimi için bu yordamı önemli hale benzer bir yaklaşım kullanarak diğer proteinleri saklanması mümkün olabilir.

Giriş

Sitokrom c (cyt. C) vücudun hücresel solunum reaksiyonlarında yer alan bir anahtar elektron transfer proteindir. Apoptoz, hücre ölümü, bir kontrol şeklinde dahil olmak gösterilmiştir, ve nitrik oksit ve karbon monoksit ^1-3 gibi küçük bir toksik molekülleri tespit edebilir. Nitrik oksit (NO), kardiyovasküler sinir sistemi ve bağışıklık sistemi meydana gelen fizyolojik süreçlerin çeşitli önemli bir rol oynar. Cyt. C tipik yapısal olarak sağlam ve aktif kalmasını pH nötr değerlere tamponlu sulu ortam gerektirir ederken, araştırmalar CYT göstermiştir. C, belirli koşullar altında ^4-9 aerojel olarak bilinen katı maddelerin kendi yapısını ve fonksiyonunu muhafaza edebilirsiniz.

Aerojeller, genellikle metal oksit aerojeller yaygın olsa da, karbon ve aerojel diğer türleri sentezlenmiştir (sol-jel metal oksitler sentezlenmesiyle oluşan oldukça gözenekli bir malzemedir. Bir örnek InP AERogels), ¹⁰ ve bu şekilde, bu sol-jel kurutma gözenekli katı matris ^11-14 değişmeden kalmasıdır. Katı aerojel gözeneklerin tüm yüzey reaksiyonları önemli olan tüm uygulamalar için son derece yararlı kadar kullanılabilir yüzey alanı yapım aerojel sonuçlanır. Kimyasal veya biyokimyasal özelliklerin aerojel nanoarchitecture içinde monte edildiğinde, fiziksel gözeneklilik ve aerojellerin geliştirilmiş yüzey alanı sensörleri, hem de pilin elektrotlar, yakıt hücresi, ve süperkapasitör uygulamaları ^11,15-23 geliştirmek için yardımcı olduğu gösterilmiştir . değişmeden gözenekli katı matris bırakan bir şekilde aerojel kurutmak için, süper kritik çözücü ekstraksiyonu yoluyla sol-jel sentezden sonra gözenekler içinde kalır çözücünün çıkması için tipiktir. jelinden bir çözücü buharlaştıktan yüzey gerilimi kuvvetlerinin neden olabilir herhangi bir gözenek çökmesi için süper kritik kurutma, bir sıvı-buhar arayüzü hiçbir formları en aza indirilmiştir.

gibi CYT olarak heme proteinleri birçok rapor vardır. Islak tutuldu ya da ambiently ^24-30 kurutulduktan sol-jellerin kapsüllü olmak c. daha sonra süperkritik kurutulur Sol-jel kapsül oluşturan biyomoleküllerin raporlar aerojeller nedeniyle birçok protein yapısına zararlı olabilir, gerekli işleme nadirdir oluşturulur. Cyt. C durumunda, belirli koşullar mümkün tespit etmek ve aerojel içindeki gaz fazlı nitrik oksit yanıt arasında Cyt. C yeteneğini korumak için tercih. Bir kez aerojel stabilize, aerojel yüksek kaliteli gözenek yapısı cyt. C ve nitrik oksit ^4,8,9 arasındaki reaksiyonu kolaylaştırır. Sit. C birinci çözelti ^4-8 altın veya gümüş nanopartiküller çevresinde en çok katmanlı ilişkilendirerek aerojel içinde kapsüllenebilir. Bu çok katmanlı üstyapılar aerojel matris içinde protein korumak için hizmet vermektedir. En son approac içindeProtein konsantrasyonu ve tampon gücü diğer sentetik koşulları ile birlikte kontrol edilir geliştirdiğimiz h, cyt. c hatta metal nanoparçacık ilk dernek ⁹ olmadan aerojel içinde bütünlüğünü korur.

Birçok aerojel sentezler zaman belirli bir süre için silis sol-jel öncülerini karıştırılarak başlar gibi sentez başlar. Bu, C karışımı bir tamponlu çözelti olarak ilave edilmesidir Cyt. Karıştırma süresi bir dizi sonradır. Jelleşme sonra gözenekler, su, metanol, diğer reaktanlann ve yan ürünler ile dolu olan bir gözenekli silika sağlam bir yapı oluşturmak üzere ortaya çıkar. gözenekleri doldurur Bu sıvı çözücü değişim, bir dizi çeşitli çözücülerle durulanarak atılabilen, sıvı karbon dioksit, bir kritik nokta kurutma cihazının içinde yer alan son Değiş düşük sıcaklıkta tutulması. Karbon dioksit kritik sıcaklığının (31.1 ° C) üzerinde jel getiren şekilde oluşmasını kolaylaştırırKuru, çok gözenekli aerojel oluşturmak için Bacalı edilebilir basınçlı aparatın içinde upercritical sıvı. o denatüre hangi bir sıcaklığın altında proteini tutan için bir süper kritik akışkanın oluşturmak üzere karbon dioksit için gerekli olan nispeten düşük sıcaklık diğer çözgenlere kıyasla avantajlıdır.

Bunun yanı sıra diğer proteinleri kapsülleme için daha genel olarak uygulanabilir protokol gelişmesine neden olabilir basit bir işlemdir, çünkü aerojel içinde cyt. C kapsülleme Bizim metal nanoparçacık içermeyen bir yaklaşım avantajlıdır. Çoğu protein CYT aynı şekilde metal nanopartiküller ile etkileşime olmayabilir. C yapar ve metal nanoparçacık sentezi ya da satın alma prosedürüne ek zaman ve masraf ekler. aerojel proteinleri kapsülleme ilgili az sayıda çalışma i yardımcı olabilir aerojel diğer proteinleri kapsülleme için daha genel bir prosedür bulma önemli bir adım ileriye bu prosedürün geliştirme yapmakn gelecekteki potansiyel biyoanalitik cihazlar.

Bu yazının protokol bölümü, silis sol-jel sentez, bu sol-jel halinde Cyt. C kapsülleyen, aerojel oluşturmak için bu kompozit sol-jel kuru, UV-görünür ve dairesel dikroizm spektroskopisi kullanılarak bu bioaerogels karakterize etmek ve varlığını tespit etmek için nasıl özetlenmektedir bu bioaerogels ile gaz-fazlı nitrik oksit. İlk fosfat tampon maddesi 4.4 mM ila 70, sulu çözeltilerinde eritildiklerinde çok Cyt. C başarılı aerojel içinde kapsüllenmiş edilmiştir. Bununla birlikte, aerojel optimize protein yapı Cyt 40 mM fosfat tamponlu çözeltiler kapsül olduğunda ortaya bulunmuştur. Yüklenen aerojel CYT üretiminde ° C. 5 ila C konsantrasyonları 15 uM ^9. Bu nedenle, aşağıdaki protokol yüklü Cyt elde Cyt. C 40 mM fosfat tamponlu çözeltiler kullanılarak aerojel sentezlenmesidir. 15 uM aerojel c konsantrasyonu.

Protokol

Özel güvenlik gözlükleri, laboratuar ceket ve laboratuvar eldiven işlem sırasında her zaman giyilmelidir. koruyucu gözlük veya gözlük olmadan kritik nokta kurutma cihazı kesinlikle çalıştırmayın. tetrametoksisilan, metanol, etanol, aseton ve amonyak içeren Bütün çözeltiler, bir çeker ocak içinde işleme tabi tutulmalıdır.

1. Buffer ve CYT olun. C Çözümleri

1. ilk önce, potasyum fosfat monobazik ve 2.72 gr ağırlığında ve 500 mL'lik volumetrik bir şişeye kullanılarak su içinde eritilmesi ile 0.04 M potasyum fosfat monobazik, 500 ml hazırlamak pH 7, 40 mM potasyum fosfat tampon yaklaşık 750 ml yapmak için.
2. potasyum fosfat dibazik ve 3.48 g tartılması ve 500 mL'lik volumetrik bir şişeye kullanılarak su içinde eritilmesi ile 0.04 M potasyum fosfat dibazik, 500 ml hazırlayın.
3. Bir karıştırma çubuğu ile büyük behere çift bazlı tuz solüsyonu dökün ve bir karıştırma plakası üzerinde çözeltisi karıştırma başlatıldı.
4. Yavaş yavaş monobazik tuz s bölümlerini eklemekpH 7.00 olana kadar bir pH elektrodu ve metre ile pH'ı izlerken dibazik tuz çözeltisine Ç ÖZÜM. monobazik bir tuz çözeltisi yaklaşık 250-300 mi kullanılacaktır.
5. Cam sintilasyon flakon cyt. C ve yerin yaklaşık 0.023 gr tartılır. Bir mikropipet kullanarak hazırlanan potasyum fosfat tampon maddesi, 2.000 ul ekleyin ve sonra yavaşça katı madde kırmızı Cyt tüm kadar karıştırın çözüm girdap. C çözeltisi içine çözündürüldü ve parçacıklı madde olmaya devam etmektedir.
6. Elde Cyt. C çözeltisine 20 ul alın ve bir 1 cm yol uzunluğu plastik küvete ilave edin. Hazırlanan tampon 3 ml ekleyin.
7. Referans hücrede tampon kullanarak 300-700 nm UV-vis spektrum atın. CYT kullanın. Cı absorbans (A) 106.100 ^{M-1 cm-1} 409 nm, yok olma katsayısı ³¹ (ε) olarak, küvet yol uzunluğu (I) ve Beer-Lambert kuralına konsantrasyonunu tespit etmek için (c) çözeltisi (A = εlc).
8. Geri orijinal hazırlanan çözeltinin konsantrasyonunu hesaplamak. 2 ml hazırlanmış cyt. C çözümü mM 0,9-0,7 arasında konsantrasyon genellikle.
9. Bir sintilasyon şişenin içine 0.72 mM hazırlanan cyt. C çözümü 117 ul pipetleme 0,105 mM 800 ul orijinal hazırlanan cyt. C çözümü sulandırmak. Sonra hazırlanan tampon 800 ul (bu durumda 683 ul) dengesini ekleyin. karıştırmak için girdap. Kesin hacimleri, orijinal hazırlanan Cyt tam konsantrasyonuna bağlı olarak değişecektir. Cyt hacmi c çözeltisi. Pipeti (800 ul * 0,105 mm) olarak hesaplanır C / (orijinal Cyt. MM C konsantrasyonu).
10. Orijinal hazırlanmış ve sulandırılmış CYT saklayın. C çözümleri 2-8 ° C'de buzdolabında en fazla iki hafta boyunca Kullanıma hazır olana kadar.

2. Sentez Silika _(SiO2) Sol

1. tek kullanımlık 50 ml'lik polipropilen beher Etiket 'Beaker A '. Bir analitik denge tava behere koyun ve beher içine 1.88 gr Tetrametoksilan eklemek için bir cam Pasteur pipet kullanın. Sıfır bakiye ve ardından 'Bardak A' içine metanol 2.88 g pipetle.
2. Parafilm ile kapağı 'Bardak A'.
3. tek kullanımlık 50 ml'lik polipropilen beher 'Bardak B' etiketleyin. bir analitik terazi tavaya bir manyetik karıştırma çubuğu ve yer ekleyin. 0.75 g su ve 3.00 g metanol eklemek için bir cam pipet kullanın.
4. Parafilm ile kapağı 'Bardak B'.
5. daha sonra karıştırılırken karışım içine kapak Parafilm ile 28,0-30,0% amonyum hidroksit çözeltisi 5 ul eklemek için bir şırınga kullanın davlumbaz içine bir karıştırma plakası üzerinde 'Bardak B' içeriğini karıştırmaya başlayın.
6. En kısa sürede adım 2.5 tamamlanır tamamlanmaz, 'Bardak B' için 'Bardak A' içeriğini ekleyin. Parafilm kaplı ise 20 dakika boyunca karıştırın.

3. Jel Kalıpları hazırlayın

Not: Oradasilis sol karışımı adım 2.6 karıştırma iken jel kalıp hazırlamak için zamanı.

1. ve ilgili kapaklar (dipleri kapalı dilimlenmiş ile 16 mm x 57 mm, birim boyutu 6.5 ml) 8-9 polipropilen sintilasyon şişeleri kazanır. jel üzerinde oluşturmak ve plastik ambalaj kapağı içinde bozulmadan kalır emin üzerine kapağı yerleştirmek için düz bir yüzey oluşturmak için şişenin kapağı ucuna plastik wrap koyun.
2. tezgah üstünde kap sonu şişeleri aşağı kadar satır ve yukarı bakacak şekilde dipleri açtı.

4. CYT hazırlayın. C -Silika Sol-jel

1. sol karıştırılması (aşama 2.6) tamamlanmasından sonra, temiz bir kağıt, 50 ml polipropilen deney şişesine sol karışımı 3 ml ekleyin.
2. Yavaş 0,105 mM seyreltildi Cyt. ~ 1 dakika boyunca 3 ml Sol karışımına C çözeltisi (aşama 1.9 yapılmış) 500 ul açılan bir cam Pasteur pipet kullanın. CYT eklenirken, karışımın hafifçe girdap emin olun. C, büyük oluşumunu önlemek içinkırmızı kümeleri. Teorik olarak 3500 ul, hemen sol mi Cyt. C konsantrasyonu, 15 uM 0.105 mM Cyt. C çözeltisi 500 ul seyreltilmesiyle, miktarlar katkı maddesi olduğunu varsayarsak.
3. Pipetleyin her Hazırlanan kalıbın içine çıkan cyt. C silis sol 0.5 ml. Ayrıca, süper kritik kurutma işlemi esnasında kontrol örnekleri olarak kullanmak için bir veya iki kalıplar içine geri kalan 'düz silika solüsyonunun 0.5 mL pipet.
4. Parafilm ile kalıpların yüzü yukarı deliklerin üstünü ve sol-jel üretmek için (~ 2-8 ° C) gece veya en az 12 saat buzdolabında koydu.
5. buzdolabından kalıpları atın. Bir CYT içeren bir kalıbın üst Parafilm çıkarın c sol-jel.; Ayrıca alttan kapağı ve plastik kaplamayı çıkarmaya.
6. kalıba bir yıkama şişesinden bazı etanol ilave edildikten sonra, dikkatlice kalıp dışarı ve temiz bir 20 ml'lik cam sintilasyon şişesi cont içine jel itmek için bir şırınga pistonu dairesel bir disk ucunu kullanınetanol, yaklaşık 5 ml Tahliye.
7. Cyt tüm kadar bu jel çıkarma işlemini (4.5 ve 4.6 adımları) tekrarlayın. C jeli şişeye ilave edilir ve silika jellerinin tümü ayrı bir şişeye ilave edilir. Cyt. C jel birden fazla konsantrasyon yapılmış ise, ayrı flakon içinde bir araya jeller gibi saklamak için emin olun. Sonra 2-8 ° C arasında etanol, şapka ve mağaza ile en üstüne şişeleri doldurun.
8. Gün boyunca her dört saatte bir, buzdolabından jeller kaldırmak jeller kapalı etanol süzün ve taze etanol ile değiştirin.
9. Ek üç gün boyunca, boşaltılması ve taze aseton günde üç kez ekleyerek, aseton ıslak sol jeller daldırın.

5. süperkritik Kuru Sit. C -Silika Sol-jeller

1. 8 ° C'ye bağlı bir sirkülatörün sıcaklığı ayarlanarak 10 ° C'ye kadar bir kritik nokta kurutma makinesinin (Şekil 1 e bakınız) soğutun.
2. Cihaz r var bir kere10 ° C eached, aseton ile bir transfer tekne doldurma ve aparatın içine mühürlenerek aygıtı üzerinde bir sızıntı testi gerçekleştirin.
   1. aparatın dolum vanasını açın ve cihaz yarım-dolana kadar karbondioksit ekleyin.
   2. dolum vanasını kapatın ve o-ringler veya mühürler bozulan olabilir kapı ve vanalar tıslama için dikkatle dinleyin.
   3. Bir sızıntı bulunursa herhangi bir O-halkalarını veya contaları değiştirin.
3. Kaçak testi tamamladıktan sonra, davlumbaz ve drenaj içine aseton ve karbondioksiti serbest bırakmak için tahliye vanasını açın. Sonra aparat transfer tekne kaldırın.
4. Cihaz kaçak ücretsiz emin olduktan sonra, dikkatlice aktarma teknenin üç uzun bölüme, aseton çoğu ile birlikte, sintilasyon şişeleri ıslak jeller dökün (örnek sepet ya da gazlı bez kapakları gerekli değildir). Delicately itin ve tüm jeller tamamen i sular altında olduğundan emin olmak için forseps ile tekne içinde jeller taşımakn, aseton. aparatın içine tekne sızdırmazlık önce gerekirse daha fazla aseton ekleyin.
5. Daha sonra, karbondioksit eklemek kısa sürede karbondioksit ile karıştırma aseton aparatı pencereden aparatın dibine batan oldukları gözlemlenmiştir olarak beş dakika aseton serbest bırakmak için boşaltma vanasını açmak için aparatın dolum vanasını açın. aparat, karbon dioksit ile doldurulur önce doldurma valfi boşaltma sırasında gerekli olduğu ölçüde, açık kalmalıdır aparat boşaltma açık bile doldurmaya devam etmesi için alt aseton Bu seeping, ortaya çıkar.
6. Tahliye vanasını kapatın. biraz açık kırık dolgu valfini tutun.
7. Beş dakika sonra, cihaz, tüm tahliye süre boyunca tam olarak kalacak şekilde yeterince açılabilir tekrar beş dakika için tahliye vanasını açın ve dolum valfı ayarlayın. , Tahliye vanasını kapatın doldurma vanası açık kırık tutmak, o zaman bu drenaj adımı bir kez daha tekrarlamak beşDaha sonra dakika.
8. Bu ilk üç boşaltma adımlarının ardından, yaklaşık en az altı saat süresi üzerinde her 40 dakika jeller içindeki sıvı karbon dioksit tarafından aseton tam değiştirilmesini sağlayan bir seferde 5 dakika boyunca drenaj açın. Her zaman aparatta sıvı seviyesi asla boşaltma sırasında teknenin üst altına düşerse, böylece her drenaj sırasında yeterince açık olmasını dolum vanasını ayarlayın.
9. Bir kez drenaj adımlar tamamlandıktan, dolgu vanasını kapatın ve seviye cihazı pencereden bakarak sadece teknede dişleri üzerinde görünür kalır, böylece sıvı karbon dioksiti boşaltın.
10. Sağlamak için 40 ° C'ye kadar bir aparat sirkülatörün sıcaklığını ayarlama bu kritik sıcaklık ve basıncının üstünde sıvı karbon dioksit, yükselir (T _C = 31 ° C; P _P = 7.4 MPa) arasındadır.
11. Yaklaşık 15 dakika sonra sıvı menisc cihaza uygun bir cihaz pencereden süper kritik akışkan, sıvı geçişi gözlemlemekTeknenin dişleri üzerinde bize kaybolur. dengeleme süresi, en az 15 dakika, daha sonra, süper kritik akışkanın serbest başlaması havalandırma vanası küçük bir miktar açık izin verin.
12. yaklaşık 45 dakikalık bir süre boyunca, serbest akışkan bir sabit, ama çok düşük bir tıslama duyulabilir şekilde aşamalı olarak boşaltım valfı daha geniş ve daha geniş açmaya devam ve basınç göstergesi yavaşça sıfıra düşeceği görülmektedir.
13. aparatın basınç sıfıra geçtikten sonra, cihaz kapıyı açmak tekne kaldırmak ve temiz bir cam sintilasyon şişeleri yeni kurutulmuş aerojel yerleştirmek için forseps kullanabilir.

6. karakterize Sit. C -Silika UV-görünür ve Dairesel Dikroizm (CD) ile Aerogels Spektroskopisi

1. UV-Visible spektrofotometre veya CD spektrometresi ışın yolunda aerojel yekpare tutmak için bir karton platformu hazırlayın.
   1. Böyle labo bir kutudan karton (hafif karton 2.5 cm x 2.5 cm parça kesipratory doku), sonra tekrar kesme tarafından oluşturulan iki flep, kat, yarıya kadar kat kesmek, ikiye katlayın.
   2. ortada bir 1,5 cm x 1,5 cm kare delik ile, hafif karton 5 cm x 5 cm parça kesin. Sonra 0.5 cm x 0.5 cm beklemeye boyutunu azaltmak için siyah elektrik bandı kullanın.
   3. Küçük bükük yüzey bir aerojel monolit için oluşturulan böylece karton 5 cm x 5 cm parçasının karşı katlanmış ve kesim karton kanatlar 0,5 cm x 0,5 cm delik doğrudan önünde oturmak için bant (bakınız Şekil 2) . Delik ışın yolu ile uyumlu olacak şekilde daha sonra UV-görünür spektrofotometre ile karton geri parça bantlayın.
2. bir mikrometre ile, yol uzunlukları kullanılacak jeller, kalınlığı ölçülür.
3. karton platformunda bir jel yerleştirin ve UV-görünür spektrofotometre referans bölmesindeki hava ile 300-800 nm bir spektrumu ölçmek.
4. Polinom, A = a Fit λ ⁿ absorbans (A), arka saçılma kaynaklanmaktadır dalgaboyu (λ) bölgesinde, ~ 700-800 nm. Katsayısı arasında bir sayı, tipik olarak uygun olan yaklaşık 1 x 10 ⁸ x 10 ⁶ 1 ve n katsayısı 2 ve 3 ~ arasında bir sayı, tipik olarak uygundur.
5. Uyum elde edilen katsayılar, a ve n kullanarak, diğer dalga boylarında dağılım hesaplayın.
6. Bir dağılım düzeltilmiş spektrum elde etmek için ham spektrumun bu hesaplanan dağılım arka plan absorbans çıkarın.
7. aerojelin Soret tepe tepe yüksekliği, tepe merkezi ve tepe genişliğini belirlemek için uygun bir yazılım (gram / AI 8.0) kullanılarak 490 nm ila 370 aralığında bir Gauss eğrisi ile dağılım çıkarılır spektrumu takın.
8. Yol uzunluğu (l) 106100 M sönüm katsayısı ³¹ (ε) için jel ölçülen kalınlığı kullanılarak Beer-Lambert Kanunu uygulamak ^-1 cm ^-1 ve Soret tepe yükseklik (A), aerojel (A = εlc) 'de Cyt. C konsantrasyonu (c) hesaplamak için.
9. Hesaplanan CYT karşılaştırın. C konsantrasyonu konsantrasyonu teorik jel (15 uM) içinde aerojel dahilinde cyt. C canlılığı tespit etmek için. Tipik yüzde canlılıkları% 100'e yakın, ancak canlılıkları hesaplama CYT tükenme katsayısı biraz daha farklı olması tahmin edilmektedir solüsyon ³¹ cyt. C tükenme katsayısı dayanmaktadır çünkü sadece tahmin olduğu unutulmamalıdır. bilinmemektedir aerojel c.
10. Lambayı açmadan önce en az 5 dakika CD enstrüman çalıştırın azot.
11. Delik ışın yolu ile uyumlu olacak şekilde CD spektrometresi karton tutucu bantlayın.
12. Üç taramaların bir ortalamasını alarak 100 nm / dk'da 350-500 nm karton tutucu hiçbir şey ile sürekli dalga boyu boş spektrumu ölçmek.
13. karton platformunda bir jel (daha önce adım 6.2 ölçülen kalınlık) yerleştirin ve üç taramaların bir ortalamasını alarak, 100 nm / dk'da 350-500 nm bir spektrumu ölçmek.
14. ilgi tüm aerojel yekpare için UV-görünür ve CD ölçümleri tekrarlayın.

7. CYT ile Nitrik Oksit varlığı (NO) Gaz Algılama. C -Silika Aerogels

DİKKAT: NO çalışma tehlikelidir ve tüm YOK gaz davlumbaz içine davlumbaz ele veya bitkin alınmalıdır. NO sürekli maruz kalma YOK hava ile temas ettiğinde oluşturacak gibi son derece zehirli nitrojen dioksit ve / veya azot tetroksit dokulara toksiktir. HAYIR suyla temas ettiğinde ısı ve korozif gazlar da üretilmektedir.

1. iyi havalandırılan bir davlumbaz içinde 8 L nitrik oksit silindiri (% 10 nitrik oksit,% 90 azot) yerleştirin ve 4 psi basınç ayarlayın.
2. 6 ps ayarlanmış bir azot silindir (basınç hem nitrik oksit silindirine ve boru bağlayıni) ve T-valf boru uçlarını bağlamak () Şekil 3a bakın.
3. Deney için bir aerojel tek parça seçin ve bir mikrometre ile kalınlığı (veya yol uzunluğunu) ölçün.
4. plastik kapaklı bir tek kullanımlık küvet içinde aerojeli (~ 3 mm kalınlığında) yerleştirin ve spektrofotometre içine küvet koydu. küvete sığacak şekilde gerekirse hafifçe aerojeli kesin.
5. Küvetin plastik kap, T valf çıkışına bağlı bir, (Şekil 3B), davlumbaz içine egzos olarak hizmet etmek üzere bir tübe bağlı bir İki şırınga iğneleri yerleştirin. boru ve küvete kapağa iğneler mühür Parafilm kullanın.
6. Referans hücrede boş atılabilir küvete koyun.
7. aerojel önce deney başlamadan ışın yolunda yatıyor olmasını sağlamak için aerojel küvet konumunu ayarlayın.
8. 800 ile 300 nm arasında bir ilk spektrum al.
9. 4 absorbans arasındaki farkı izleme14 nm ve 408 nm 'de absorbans hiçbir zaman azot ya da nitrik oksit / azot karışımı o kadar yüksek akış hızı olduğundan emin olduktan belirlenen zaman aralıklarında, nitrojen ve nitrik oksit / azot karışımı arasında geçiş yapmak için, T-valf döndürerek aerojel küvet içinde dolaşır.
10. maruziyet çevrim tamamlandıktan kez, 800 ila 300 nm arasında bir son spektrumu al.
11. ortalama bir algılama yanıt almak için üç ila dört monolitten işlemi tekrarlayın.

Sonuçlar

Canlı cyt. C içeren aerojel açıklanan prosedür sonuçları. Ekleme işleminin sonunda, belirtilen zamanda, Cyt. C 4.4 ile 70 mM fosfat aralığında sulu tampon çözeltilerinden kapsüllenebilir. Cyt örnekler. Cı -Silika (cyt. Cı -SiO ₂₎ farklı tampon konsantrasyonları içeren çözeltilerden yapılan aerojeller, Şekil 4'te gösterilmiştir. 70 yapılmış jeller mM en opak tampon Tüm jeller, nispeten şeffaf olan.

Ve Cyt., Farklı koşullar altında c spektroskopisi bir karşılaştırması. Tipik spektrumu (Şekil 5C) Cyt 408 nm civarında büyük Soret ucu göstermektedir. Şekil 5'te Cı -SiO ₂ aerojel gösterilmiş ve Cyt spektrumuna çok benzerdir olan . solüsyonu (Şekil 5A) c. Buna ek olarak, Cyt bir spektrum.Metal nanopartiküller ile aerojel içinde kapalı C de (Şekil 5B) ve CYT gösterilmektedir. C -SiO ₂ aerojel spektrumu da bu spektrumu benzer. Cyt. Cı -SiO ₂ aerojel nitrik oksit maruz kaldığında, Soret zirve tipik bir kaydırma (Şekil 5D) gözlenir.

Cyt yapılmış jeller için UV-vis spektrumları. Değişen tampon konsantrasyonlarının, c çözeltiler, Şekil 6'da gösterilmiştir. Bu jeller tüm karakteristik UV-görünür spektroskopi Cyt. C jeller içinde denatüre halde olmadığını gösteren özellikleri göstermektedir. Bununla birlikte, jellerin azalan geçirgenlik, bu spektrumları için daha düşük bir sinyal-gürültü oranı 70 mM tampon maddesi sonuçları yapılmıştır.

Sit CD spektrumları. C -SiO ₂ aerojeller CYT spektrumları benzemektedir. C aerojel spektrumları her iki tip tamponlu çözelti içinde Cyt. C arasında bir spektrum farklı ise, metal nanopartiküller ile aerojel içinde kapalı (Şekil 7).

Şekil 8, Cyt için tipik bir nitrik oksit izleme yanıtını gösterir. C -SiO ₂ aerojeller ve Cyt. C ek olarak, metal nano-tanecikleri içeren karşılık gelen aerojeller. 408 nm'de 414 nm absorbans ve arasındaki farkı artırmak ve jeller arda sırasıyla daha sonra azot nitrik oksit maruz kalmış ve zaman azalma görülür.

Süperkritik karbon dioksit yavaş yeterince oranı, CYT canlılığı tahliye değilse. C oluşan aerojel içinde tehlikeye olacak. Bu, farklı karbon dioksit serbest bırakarak jeller oluşturulmasından sonra elde edilen UV-görünür spektrumu karşılaştırılarak ortayaoranları (Şekil 9).

Şekil 1: Kritik nokta kurutma cihazı geri aparatının arkasına yanında gösterilen aktarma tekne ve cihaz kapı (A) ön ve (B) gösterilen kritik nokta kurutma cihazı..

Şekil 2: Karton platformu bir aracın kirişin yolunda bir aerojelin tutmak için bir araya karton platformu..

Şekil 3: Nitrik oksit algılama set-up nitrik oksit algılama set-up (A)% 10 nitrik oksit kapalı davlumbaz dahil gösterilir.% 90 azot silindir, boru ve T-valf ve (B) eklenen iğne ile küvet.

Şekil 4.:. Örnek Cyt Cı -SiO ₂ aerojeller 15 uM CYT kapsül aerojeller c 4.4 mM, 40 mM, 70 mM potasyum fosfat tamponu içinde soldan sağa doğru bir dime göre gösterilmiştir.. Bu aerojeller yaklaşık 0.2-0.5 cm yüksek. Izni ⁹ ile yayımlanmaktadır.

Şekil 5:. Cyt Cı -SiO ₂ aerojel Spektroskopisi (a) 50 mM fosfat tampon maddesi, sol içinde 15 uM sitokrom c Görünür spektrumları.Katkı; (B) Au _{(5 nm)} ~ cyt c -SiO ₂ aerojel.; (C) cyt (havaya maruz) c -SiO ₂ aerojel.; (D) Cyt. (3.5 dakika boyunca nitrik oksit maruz) Cı -SiO ₂ aerojel. Jel, her tür Bu Örnek spektrumları açıklık için ofset olup, burada kesikli çizgi tamponu içinde Cyt. C Soret tepe konumu belirtir. Her spektrum 15 uM Cyt. C iken, jel kalınlığı (ya da yükseklikler) daha yüksek bir çözelti, emme ile sonuçlanan 1 cm çözeltisi cuvet göre sadece 0.2-0.5-cm'dir. Izni ⁹ ile yayımlanmaktadır.

Şekil 6:. Kapsüllü tampon konsantrasyonu Aerojel spektroskopisi _ 15 encapsulating jeller için jel yol uzunluğuna bölünmesiyle aerojel UV-görünür spektral absorbans çeşitlidir Ortalamalı edilir6 M Cyt 70 mM (siyah) (kesik yeşil) (4 spektrumları ortalama), 40 mM (kırmızı, noktalı) (8 spektrumları ortalama) ve 4.4 mm (9 spektrumları ortalama) potasyum fosfat tamponu içinde C. . Izni ⁹ ile yayımlanmaktadır.

Şekil 7:... Aerojel dairesel dikroizm spektroskopisi (katı) sodyum fosfat tampon çözeltisi içinde Cyt C Dairesel çift taraflı spektra, Cyt iki Örnek spektrumları Cı -SiO ₂ aerojeller (kesik çizgili) ve Au iki Örnek spektrumları _(5-mil) ~ Cyt. C SIO ₂ aerojeller (noktalı). Izni ⁹ ile yayımlanmaktadır.

Şekil 8: CYT ile Nitrik oksit tespiti c -SiO _2. . sub> aerojeller vardiya İzleme (ΔA A _{414 nm} = - A _{408 nm).} CYT ve Soret yoğunluğu gaz akışı olarak _SiO2 kompozit aerojel nanoarchitectures kapsüllü c (katı kırmızı) ve Au ~ cyt c (mavi kesik). azot arasında geçiş edilir (Soret zirve maksimum olduğu ~ 408 nm) ve (Soret zirve maksimum ~ 414 nm olan), nitrik oksit. Her eğri CYT iki ile 3-4 çalışmaların bir ortalama ΔA izlenir c -SiO ₂ denemeler A _{414 nm} = -. İlk Soret tepe maksimum bu çalışmalar için 407 nm'de beri A _{407 nm.} Izni ⁹ ile yayımlanmaktadır.

Şekil 9:. CYT için jel yol uzunluğuna bölünmesiyle süperkritik akışkan serbest zaman etkisi Ortalamalı UV-görünür spektral absorbans c -SiO ₂ aerojeller enca.50 mM süperkritik olarak kuru aerojeller 45 dakika (9 spektrumları katı, siyah (ortalama)) ya da 7 dakika (Toplam 4 kesik, kırmızı (ortalamasının üzerinde ya da serbest süperkritik karbon dioksit tarafından ifade edildiği fosfat tamponu içinde 10 uM CYT psulating. c spektrumlan)). Izni ⁹ ile yayımlanmaktadır.

Tartışmalar

Tarif edildiği gibi, bu işlem sürekli olarak uygulanabilir CYT üretti. Aerojel içinde kapsüllenmiş Cı. Aerojel içindeki Cyt. C konsantrasyonu, 5 ila 15 um ve 4.4 protein canlılığı üzerinde ciddi olumsuz etkiler olmadan 70 mM fosfat için değişik olabilir aerojel içinde kapalı tutulan başlangıç ​​Cyt. C çözeltisi tampon maddesi konsantrasyonu arasında değişebilir. Ancak, tepe merkezi ve karakteristik CYT zirve genişliği. Aerojel içinde Soret zirve c 40 mM tampon ⁹ çözümlerinden aerojel kapsüllü zaman cyt. Onlar çözelti içinde cyt. C ne en yakın c.

Cyt sentezi. C -SiO ₂ aerojeller başlangıç ​​tepkin maddelerinin bazı yaş etkilenir. Metanol, tetrametoksisilan, ve amonyum hidroksit çözeltisi higroskopik ve her bir-iki ayda bir değiştirilmelidir. kurar artan suzaman içinde bu reaktifler jel yapısal özelliklerini ve sol-to-jel geçiş süresini etkiler.

süperkritik kurutmayı yaparken, kritik nokta kurutma aygıtı transfer tekne kalın onsekiz 0.5 cm, 1 cm çapında jeller kadar tutabilir. protokol bölümünde belirtildiği gibi, belirli bir dolum ve boşaltma işlemi sol-jeller karbondioksit aktarmak için takip edilmelidir. Bu drenaj protokolünün başında dikkat etmek önemlidir, karbondioksit ve aseton boşaltılması karışım tahliye borusu nem dışarıdan buz yoğuşmalı ile sert donuyor bu kadar yüksek bir oranda akar. aseton susuz değildir ve bu su bazen tahliye borusu aslında takunya bir ölçüde donabilir beri boşaltma karışım biraz su içerir. Tür takunya izlemek için ve akış stopaj dinlemek için gereklidir. Bir yapışmasına neden tespit edilirse yapışmasına neden eriyecek, böylece tahliye vanası birkaç dakika kapalı olmalıdır. İçindeBoşaltma vanası kapalı değilse en kötü durum senaryosu, bir yapışmasına neden bu kadar baskı drenaj borusu zorla aparatı kapalı çıkması birikmesine neden olabilir. İlk birkaç drenaj dönemlerinden sonra, aseton çoğunluğu cihazının durulanır olacaktır ve ıslak buz parçaları oluşumu önemli ölçüde azalacaktır. Tahliye protokolü (örneğin kokusu gibi) aseton varlığının herhangi bir kalıntı delil devam ettikçe tahliye giderek drenaj işleminin sonuna kadar belirlenemeyen olma kuru buz benziyor.

Cihaz içinde, karbon dioksit, süper kritik akışkan, sıvı arasından geçişi ve havalandırma işlemi başladıktan sonra, prosedür ^9'da gösterildiği gibi en az 45 dakika boyunca yavaş bir hızda sıvı serbest bırakılması gerekir. (Şekil 9'da gösterildiği gibi) salınımı daha yüksek oranda aerojeller içinde. C CYT canlılığı azaltabilir ve aerojeller kendileri aslında inci gibi parçalayın olabilire sıvı jeller kaçmak için koşar. aerojeller aparat kapıyı açtıktan sonra bozulmadan kalır ne zaman kırılgan ve kolayca zarar verebilir genel olarak, hatta, dikkatli ve yavaşça bunları işlemek için önemlidir.

Sit yanında dökülür kontrol silika jelleri. C -SiO ₂ jeller jeller içine karbondioksit transferi başarılı olup olmadığını belirlemek için süperkritik kurutmadan sonra kullanılır. Bazen cyt. C -SiO ₂ jeller bulutlu görünebilir ve bu eksik çözücü transferi nedeniyle olup olmadığını belirlemek için önemlidir ya da cyt. C konsantrasyon ile yapmak veya jeller içinde kapsüllü tampon olabilir eğer. Sit olmadan silika jelleri. Boyunca homojen, saydam bir görünüme sahip görünüyor c Eğer çözücü transferi tamamen bile CYT meydana geldiğini, bu delil olarak alınabilir. C -SiO ₂ jeller onlara bazı bulutluluk var. silika jeller içindeki bulanıklıkolmadan cyt. c kuruduktan sonra bazı aseton havalandırma sırasında jeller içinde kaldığını göstermektedir.

protokol bölümünde belirtildiği gibi nitrik oksit (NO) ile çalışırken, önemli güvenlik önlemleri alınması gerekir. aerojel kullanarak NO algılamak için, çok iyi küvet mühür ve bir davlumbaz içine aerojel üzerinden akan gazın egzoz gereklidir. Alternatif olarak, bütün spektrofotometre YOK gaza maruz kalma sınırı için ek bir önlem olarak hiçbir gaz tüpü ile birlikte bir davlumbaz içine taşınmış olabilir. Hava NO ile temas anında son derece zehirli azot dioksit, azot tetroksit veya her ikisi üretecek üzerinde. HAYIR de ısı ve korozif dumanlar üretmek için su ile reaksiyona girebilir. Bu nedenle, NO sürekli maruz kalma doğrudan doku toksisitesi neden olabilir.

CYT kullanırken. Cı -SiO ₂ aerojel nitrik oksit varlığını tespit etmek için, Soret bandı ilk ~ 408 nm'de olması ve kayacakNitrik oksit varlığında ~ 414 nm. geri azot geçtikten sonra, Soret bant ~ 408 nm merkezli olmak geri geri gerekir. Ayrıca CYT kullanmak mümkün olabilir. Cı -SiO ₂ aerojeller karbon monoksit ²⁷ gibi diğer ligandlar varlığını tespit etmek.

Farklı yayınlanan prosedürler öncesinde sol ile karıştırılması ve süperkritik aerojel ^4-8 oluşturmak için kurutma çözeltide cyt. C altın veya gümüş nanopartiküller birleştirerek bir ilave aşamasını kapsamaktadır. Sit UV-görünür spektroskopi karşılaştırılması. CYT o metal nanopartiküller ile aerojel kapsüllü c., Metal nanopartiküller olmadan aerojel kapsüllü c kapsülleme teknikleri bu iki tür aerojel içinde benzer canlılığının cyt. C üretmek olduğunu göstermektedir (Şekil 5) . Ancak, metal nanopartiküller ile kapsüllü cyt. C CYT biraz daha stabildir. Kapsüllemek caerojel ⁹ içinde metal nanopartiküller olmadan, d. Her ikisi de bazı aerojel içindeki Cyt. C açılımı gösteren tamponunda Cyt. C spektrumu (Şekil 7) farklı, ancak Cyt. C aerojellerin hem de tip CD spektrumları da benzerdir. Cyt üzerine önceki raporlar. Cı aerojel içinde kapsüllenmiş dairesel dikroizm Spektroskopisi muhtemelen metal nanoparçacık çekirdekli tabakalı Cyt da içinde, silika jel ile temas üzerine, katlanmış proteinin en dış tabaka değerlendirmektedir düşündürmektedir. C yapılar ya da oluşturan gevşek kristalimsi herhangi bir metal nanopartiküller aerojel ^4,9 mevcut olduğunda. Ama UV-görünür spektroskopi ile ölçülen aerojel içindeki kendinden düzenlenen yapı her iki türü içinde Cyt. C çoğunluğu katlanmış olarak kalır. Bu tarifnamede sans nano-tanecikleri tarif edilen protokol avantajı, pahalı satın alma ya da metalin zaman alıcı sentezinanopartiküller gerekli değildir. Proteinler çoğu zaman başarılı bir şekilde aerojel içinde kapalı değil, ve gelecekteki biyoanalitik cihazlar potansiyel önemi olan aerojel Diğer proteinler kapsülleme için daha genel bir yöntemin geliştirilmesine neden olabilir ki, bu prosedürün önemlidir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium phosphate, monobasic	Fisher Scientific	P285-500	Certified ACS (also possible to use sodium phosphate monobasic)
Potassium phosphate dibasic anhydrous	Fisher Scientific	P288-500	Certified ACS (also possible to use sodium phosphate dibasic)
Water	Millipore Direct-Q		18 MΩ cm
pH meter and electrode	Denver Instrument	UB-10
Cytochrome c from equine heart	Sigma Aldrich	C7752-100MG	≥95% based on Mol. Wt. 12,384, used as received and stored at -20°C
Glass scintillation vials	Wheaton	03-341-25J	20 mL, O.D. x height (with cap):  28 mm x 61 mm
Disposable cuvette	Fisher Scientific	14-955-126	methacrylate, 10 mm x 10 mm x 45 mm
Ultraviolet Visible Spectrophotometer	Shimadzu	UV-1800	Uses UVProbe v 2.33 software
Circular dichroism spectrometer (or spectropolarimeter)	JASCO	J-810
Isotemp Laboratory Refrigerator	Fisher Scientific
Polypropylene disposable beakers	Fisher Scientific	01-291-10	50 mL
Tetramethylorthosilicate (also known as tetramethoxysilane, TMOS)	Sigma Aldrich	218472-500G	98% purity
Methanol	Fisher Scientific	A457-4	GC Resolv grade
Ammonium hydroxide solution	Sigma Aldrich	221228-25ML-A	ACS reagent, 28.0-30.0%
General purpose polypropylene scintillation vials	Sigma Aldrich	Z376825-1PAK	16 mm x 57 mm, volume size 6.5 mL, slice off bottom with sharp knife or razor
generic plastic wrap	various
Parafilm M laboratory wrapping film	Fisher Scientific	S37440
Plastic syringe plunger	various		use syringe plunger from 3 mL syringe
Ethyl alcohol	Acros	61509-0040	Absolute, 200 proof, 99.5% A.C.S. reagent
Acetone	Fisher Scientific	A949-4	HPLC grade
Critical point drying apparatus	Quorum Technologies		E3000 Series
Circulator	Fisher Scientific	Isotemp 3016
Carbon dioxide cylinder	Tech Air		siphon tube
Micrometer	Central Tool Company
GRAMS/AI 8.0 software	Thermo Electron Corporation
Nitrogen cylinder	Tech Air		Another inert gas could be substituted
10% nitric oxide/90% nitrogen cylinder	Airgas
Tygon tubing	various
T-switch valve	various
syringe needles	various