Murin Koroner Damar düz kas hücrelerinin izolasyonu

Özet

Bu protokolün amacı, koroner dolaşımdan fare primer vasküler düz kas hücrelerinin izolasyonu ve kültür teknikleri (VSMC) göstermektir. VSMC'Ier izole edildikten sonra, pek çok standart kültür teknikleri için kullanılabilir.

Özet

yalıtım ve büyük gemilerden vasküler düz kas hücreleri (VSMC'Ier) kültürü iyi bilinmektedir birlikte, koroner dolaşımdan izole Kültür VSMC'Ier çalışmıştır. Sağlam aort kemerli Kalpler çıkarılır ve sindirim çözeltisi kolajenaz tip II, 0.1 mg / ml soya fasulyesi tripsin inhibitörü ve 1 M _CaCI2 300 birim / ml içeren retrograd Langendorff ile perfüze edildi. guruplarına kaplama ortamı içinde yeniden süspansiyon haline, santrifüjle topaklar haline 90 dakika boyunca 15 dakika aralıklarla toplanmış ve doku kültür tabaklarında kaplandı. VSMC'Ier SM22α varlığında α-SMA ve vimentin ile karakterize edilmiştir. Bu tekniği kullanarak ana avantajlarından biri, farelerin koroner dolaşımdan VSMC'lerde izole etmek yeteneğidir. Hücreler kullanılabilir uygulamalar için bazı sınırlar elde edilen hücrelerin küçük bir sayı, izole koroner VSMC köklü hücre kültürü teknikleri ve Assa çeşitli kullanılabilir, ancakys. genetiği değiştirilmiş farelerin VSMC'lerde araştıran çalışmalar yapı-fonksiyon ve vasküler patolojiler ile ilişkili sinyal süreçleri hakkında ayrıntılı bilgi verebilir.

Giriş

Bu yöntemin amacı, hücre kültürü ve standart hücre kültürü deneylerinde kullanım için murin koroner dolaşım vasküler düz kas hücreleri (VSMC'Ier) izole etmektir. Biz Diyabette vasküler yeniden moleküler mekanizmaları değerlendirmek için bu tekniği geliştirdi. Biz daha önce diyabet ¹ db / db fare modelinde septal koroner arteriyollerde hipertrofik yeniden içe bildirdi. Bağlı murin septum koroner bulunan doku miktarının sınırlı, db / db ve kontrol farelerinde protein değişiklikleri (örneğin, Western blot) araştıran standart deneysel teknikler, en iyi zordur. Buna ek olarak, daha önce anjiyotensin reseptör blokerleri (ARB), losartan, db / db farelerinde ² gözlenen yenileme azalttığını göstermiştir. Bu nedenle, koroner dolaşımdan başlıca VSMC'lerde izolasyonu bize daha fazla katk olabilir diyabetik farelerde VSMC fenotip değişiklikleri veya sinyal aktive yolları, araştırmak için izin verirolumsuz koroner arteriole yeniden için ting.

Çeşitli çalışmalar değil, her belirli vasküler yatakta daha kemirgen aorta, izole VSMC kullanarak kanonik sinyal yollarını aydınlatmıştır. Bununla birlikte, farklı olabilir, her vasküler yatakta VSMC'Ierin öne vasküler yatak koroner aort belirli yenileme ve db / db farelerinde ¹ mezenterik sirkülasyonu göstermiştir. Nedenle, daha iyi bir VSMC'Ierin her set meydana gelen patolojik değişiklikleri anlamak için her vasküler yatakta VSMC'Ierin izole etmek için gereklidir. izole edilmesi ve aort VSMC'Ierin kültürlenmesi için farklı yöntemler bir bolluk vardır. Ancak şu anda, fare koroner dolaşım ^3'ten VSMC'Ierin izolasyonu yayımlandı sadece bir çalışma var. Teng ve ark. Fare koroner dolaşım VSMC'lerde izole etmek için bir yöntem bildirmek için ilk oldu; Ancak, önemli ölçüde protokolü değiştirdik onlar da endotel cel izole olarakls. Diğer laboratuarları da Teng ve ark gelen protokolü kullandık. Koroner arter miyositleri ve havayolu düz kas hücreleri ^4,5 izole etmek. Biz dahil olan değişiklikler yüksek koroner dolaşım VSMC'Ierin zenginleştirilmiş hücrelerin bir popülasyonu verecektir.

İzole memeli kalp veya Langendorff tekniği retrograd perfüzyon Oscar Langendorff'a tarafından 1897 ⁶ yılında kurulmuş ve hala yaygın kardiyovasküler hücrelerin izolasyonu için kullanılmaktadır bugün. Modern fare genetik modifikasyon ilerlemesi ile birleştiğinde Burada sunulan teknik, koroner dolaşımdan VSMC'Ierin moleküler davranış yakın soruşturma için değerli bir araç sağlar.

Protokol

Etik Beyanı: Bu çalışma Sağlık Rehberinin National Institutes göre gerçekleştirilmiştir ve Nationwide Çocuk Hastanesi Kurum Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı.

1. Hazırlık / ayarlayın

Not: Bu izolasyon tekniği bir halka standında yan yana yerleştirilmiş iki Langendorff ısıtma bobinleri gerektirir ve bir dolaşan su banyosu paralel bağlanmış.

1. su banyosu dolaşım açın ve Langendorff kanülün ucunda 33-34 ° C'lik bir nihai sıcaklığa ulaşmak için sıcaklığı ayarlamak (bu, kullanılan su banyosu nedeniyle 6-7 ° C kaybı 40 ° C olarak ayarlanır ayarlamak boru boyunca sıcaklık). perfüzyon pompaları açmak ve 0.5 ml / dak perfüzyon hızını ayarlamak.
   1. otoklavlanmış ultra saf su ve 100 ml% 70 etanol, 50 ml, her yıkama su ceketli ısıtma bobinleri iki ekli boru ve 25 gauge kanül temizleyin.
   2. ısıtma bobinlerini temizleyinve bir şırınga ile hava basma fenol kırmızısı olmadan Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS), 10 ml ile yıkanır. ısıtma bobinleri ve tüp HBSS bırakın.
   3. boru kırmızı fenol olmadan oda sıcaklığında HBSS ile dolu bir steril 10 mi Luer-kilit şırınga takın. Bu olumsuz VSMC izolasyonu etkisi sindirim sırasında hava emboli neden olabileceğinden HBSS dolu bir şırınga takarken herhangi bir hava kabarcığı boru ve ısıtma bobinleri içinde sıkışıp emin olun.
2. fenol kırmızısı olmadan buz HBSS ile dolu başka bir steril 10 ml şırınga ısıtma bobinleri ve yerden 25 gauge kanül çıkarın. Kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde bu tutun. Diğer kanül için tekrarlayın.
3. Enzim sindirimi çözeltisi hazırlayın.
   1. Dijestiyon çözeltisi, 75 ml 300 U / ml bir nihai konsantrasyon elde etmek için spesifik pek çok sayıda uygun kolajenaz tip 2 tartılır.
   2. fenol kırmızısı ile HBSS, 75 ml kolajenaz çözülür. Daha sonra, 0, 1.5 ml ilave.1 Mg / ml soya fasulyesi tripsin inhibitörü ve karışım, 1 M _CaCI2 75 ul.
4. Hemen sindirim çözeltisi kullanılarak halinde, 37 ° C'ye ısıtınız. Aksi takdirde, en fazla 6 saat süre ile 4 ° C'de yerleştirin. Bu çözelti, her gün taze yapılmalıdır.
5. durak çözüm / kaplama ortamını hazırlayın.
   1. 100 mi, yüksek glikoz (4.5 g / L), DMEM 500 ml FBS, primocin L-glutamin, 5 ml, esansiyel olmayan amino asitler 5 ml HEPES 5 mi, 1 ml ısı ile inaktive edilmiş ekleyin. Filtre sterilizasyonu önerilir.
   2. Kısım 4 ° C'de, A1-A6 sayılı on iki 15 ml konik tüpün her birine durdurma çözeltisi, B1-B6, ve yer 6 mi. Kısım 37 ° C inkübatör içinde 50 ml konik ve yerine durdurma çözeltisi 50 mi.
      Not: Gerekirse bu adım ayrıca önceki izolasyon gün hazırlanabilirler. Bu durdurma çözeltisi hücre izolasyonu, aşağıdaki kaplama ortamı olarak kullanılır.
6. 30 G iğne ile donatılmış iki adet 1 ml'lik şırınga hazırlayınheparin, 100 ul (1.000 birim / ml).
7. 5-0 cerrahi ipek bir 5 cm parça kesin. Diğer iki kat daha uzun bir ucu ile cerrahi ipek gevşek bir yukarıdan aşağı düğüm. 25-gauge kanül üzerine yerleştirin, fakat sıkmayın. Diğer 25 G kanül için tekrarlayın.
8. Steril, buzla soğutulmuş, HBSS olmayan fenol kırmızısı, 2 ml olan dört adet 35 mm steril Petri kapları (# 1-4) doldurun. buz üzerinde tutun.

2. Ötenazi, Kalp İzolasyon ve kanülasyonu

1. Kalp izolasyondan önce, durdurma çözeltisi sindirim çözümü ve 50 ml konik sıcak olduğundan emin olun. bir halka standında bir büret kelepçe (ya da halka standı kelepçe) buz ve yerden ekli 25 G kanül ile HBSS dolu şırıngayı çıkartın.
2. % 3 isofluorane kullanarak fareler anestezi. Fare, her arka bacak üzerinde bir ayak dokunuşuyla anestezi onaylayın. bacak seyirmesi, fare henüz çok 1 dakika bekleyin ve ayak dokunmatik tekrar anestezi değildir.
3. kürk a çıkararak juguler ven Açığamakasla boyun anterior nd cilt. Sonra, dikkatle juguler ven çevreleyen herhangi bir yağ çıkarmak için forseps kullanabilir. yağ ayrılmasından sonra, yavaş yavaş, heparin, 100 ul (1.000 birim / ml) enjekte edilir. aşırı kanama önlemek için ven üzerinde bir cerrahi sünger yerleştirin.
4. 1 dakika sonra, açık göğüs ilk brakiyosefalik şubesi aracılığıyla sağlam çıkan aorta tutmak için emin olun, kavisli bir forseps ile kalbi, asansör kalp maruz ve makas kullanarak tüketim için. Hemen fenol olmadan 35 mm çanak içine kırmızı buz HBSS ile (# 1) kalbi yerleştirin ve durulayın.
   Not: Bir diseksiyon kapsamı kullanarak aşağıdaki 4 adımı uygulayın.
5. ucu çanak 2. sadece buz gibi soğuk HBSS yüzeyinin altında bulunan ve açıkça mikroskop aracılığıyla görülebilir, böylece halka üzerine monte edilmiştir 25 G kanül 45 ° açıyla durmak yerleştirin. çanak # 2 kalbini aktarın.
6. Dumont forseps kullanarak, hafifçe p künt diseksiyon ile aşırı adipoz kaldırarak aorta maruzRevent delme veya aort yırtılması. Sonraki 25 G kanül üzerinde aorta slayt forseps kullanabilir.
7. Bu nedenle retrograd perfüzyon vana bütünlüğünü tehlikeye olacak ve yakın değil, aort kapak ötesinde aort, aşağı doğru kanül Kılavuzu. kanül yerleştirildikten sonra, aorta üzerinde önceden bağlanmış ipek kaydırın ve sıkın. kalbi korumak için aort etrafında bir kare düğüm oluşturmak için ikinci bir düğüm.
8. Aort güvenli bağlı sonra, yavaşça 25 G kanül takılı şırınga buz HBSS ile koroner dolaşıma kalan kan yıkayın. Aşırı koroner basıncı önlemek için çok fazla itmek değil özen gösterin. Sadece çok yavaş ve nazik floş floş tamamlamak için gereklidir. Kaçak serbest aort kanülasyon de bu nazik temizleme sırasında görülebilir.
9. HBSS akışını başlatmak için perfüzyon pompası açın. dikkat ederek, HBSS dolu şırınga (ekli kalp ile) 25 G kanül kaldırHBSS ile dolu kanül göbeğini tutmak ve sıcak HBSS dolu ısıtma bobinleri bağlayın. 8 dakika boyunca 0.5 ml / dk'lık bir oranda perfüzyon pompası ile kalbin perfüzyon başlayın.
10. ilk kalp kanüle ve sistem üzerinde perfüze olan sonra tekrar ikinci kalp için 2,1-2,8 adımları. Bu izolasyonların nedenle dikkatli planlama ve zamanlama gereklidir her kalp için sendeleyerek edilecektir.

3. Sindirim

1. HBSS ile yıkama işleminden sonra, önceden ısıtılmış sindirim çözeltisi, 10 ml ile doldurulmuş bir pompa şu anda 10 mi HBSS şırınga değiştirin. 0.5 ml / dak hızında 12 dakika boyunca sindirim çözeltisi, her bir kalp serpmek. Bu herhangi bir kalıntı kan ve endotel hücrelerini içerecek bu ilk sindirim kaynaklanan fraksiyonları toplamak etmeyin.
2. 12 dakika sonra, 0.4 ml / dk perfüzyon oranını değiştirmek, soğuk durdurma solut dolu (her sindirim için birinci ya da ikinci kalp karşılık gelen boru A1 ve B1), 15 ml'lik bir konik yerVSMC zenginleştirilmiş perfüzat toplamaya başlamak için kalbin altında bir buz kovası içine iyon.
3. 15 dakika sonra, şimdi her iki fraksiyonların toplanmasından sonra, 10 dakika boyunca 89 xg boru A2 ya da B2 ve döner konik tüp A1 ve B1 toplama konik olarak değiştirin. Pompa üzerinde sindirim çözeltisi ile doldurulmuş şırınga çözeltisinin en az 1 ml olduğunda, sindirim çözeltisi taze doldurulmuş 10 ml şırınga ile değiştirin.
4. Santrifüj işleminden sonra, her toplama tüpünden aspire süpernatant, yaklaşık 0,5 ml bırakarak. Sıcak durdurma çözeltisi (ya da kaplama ortam) 2 mL A1 süspanse pelet. gevşek kapaklı 37 ° C inkübatör B1 tüp ve yer tüp A1 tüpten tabanda ekleyin.
5. Tekrarlayın 90 dakika olmak üzere toplam tahsilat süre kullanılır (A6 ve B6 yoluyla) tüm tüplere kadar 3.3 ve 3.4 adımları tekrarlayın. sindirim 80 dakikada, tüp A6 ve B6, respe bu hücreleri ventrikül içinde sıkışıp olabilecek hücreleri temizlemek ve toplamak için kalp tepe kesip açmakctively.
   Not: Bazen kalp 90 dakika zaman noktası öncesinde kanül kapalı düşecek. Böyle bir durumda, sindirim çözeltisinin 2 ml'si ile doldurulur, steril bir 35 mm Petri kabı içine kalp ve yer almak. Kalbin tepe kesin ve hafifçe sindirim çözeltisi ile kalbi durulayın. Daha sonra, 50 ml'lik bir konik steril bir 100 um hücre süzgecinden sindirim çözeltisi 2 ml filtre ve tüp A6 ya B6 ekle.
6. sonraki tüpleri (A2 ve B2) her dönüşte sonra, (A1 ve B1 kombine) Önceki toplama tüpüne yeniden süspanse VSMC'lerde ekleyin. Ayrıca, pompa sindirim çözüm tükendi ve sindirim boyunca gerekli 10 ml şırınga geçiş izin özen gösterin.
7. Hortum birleştirildikten sonra, 10 dakika boyunca 89 xg VSMC zengin süspansiyon santrifüj.
8. mümkün olduğunca toplama tüpleri aspire kadar süpernatant. bir 35 mm kültür çanak medya ve plaka kaplama 2 ml kalan pelletini. Yeri kültür çanak i24 saat boyunca 37 ° C inkübatör n.

4. Hücre Kültürü

Not: biyogüvenlik kabini kalan adımları tamamlayın.

1. 24 saat sonra, yavaşça kaplama medya aspire. Kültür normalde enkaz büyük miktarda olacaktır. Hücreleri yıkamak için sıcak, steril PBS 2 ml ekleyin ve bir saat yönünde hareket dönerken hafifçe iki parmakla karşı çanak dokunun.
2. 360 ° döndürdükten sonra, PBS aspire ve ikinci kez tekrarlayın. PBS aspire ve steril, ılık PBS başka bir 2 ml ekleyin. plaka üzerinde hiçbir enkaz az olduğundan emin olmak için mikroskop altında kültür çanak kontrol edin. Hücre izdiham bu anda belirlenebilir.
3. enkaz kültür kaplarına kalırsa, adımı 4.2 tekrarlayın. kültür çanak enkaz açık ise, PBS aspire ve sıcak kaplama medya 2 ml ekleyin.
4. 24 saat sonra, kültür nihai kalıntıları veya ölü hücrelerin çıkarılması için sıcak, steril PBS ile tekrar yıkama hücreleri. PBS ve p aspirehücreler üzerinde sıcak kaplama medya başka bir 2 ml dantel.
5. Her gün hücreleri üzerinde kontrol edin ve taze ısınmış kaplama medya ile her 48 saat beslenirler. Bu noktada, hücreler standart hücre kültür deneyleri için de kullanılabilir. prosedür mükemmel kadar 7 gün sürebilir, ancak VSMC, kaplama sonrası yaklaşık% 80 birleşen 4-5 gün olmalıdır. sonraki pasajlar yarma, 1 maksimum kullanıyorsanız: 4 35 mm yemekleri (ya da kültür kaplarına karşılaştırılabilir bir alana).

Sonuçlar

Nedeniyle bizim koroner VSMC izolasyon tekniğinin yeni bir yönüne, hücre izolasyonu saflığını belirlemek için çalıştı. Fare koroner VSMC'Ier ilk yıkamadan sonra kültürdeki hücrelerin morfolojisi dayanarak geçit 2. kendi morfolojisi ve immünofloresan boyama kadar dayanan tespit edildi, izolasyon prosedürü etkili bir kalp miyositleri ve endotel hücrelerini ortadan kaldırır. VSMC'Ier geçit 2 (Şekil 1) kadar onların morfoloji korur. Ancak, ...

Tartışmalar

Bu çalışmanın amacı, fare kalplerinden pürüzsüz koroner damar verimini artırmak için mevcut hücre izolasyonu protokolleri adapte oldu. Vasküler düz kas biyoloji öncü çalışmaların çoğu kültürlenmiş sıçan aortik düz kas hücreleri ile gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmalar VSMC büyüme, göç ve hipertrofisi ⁷ kontrol moleküler mekanizmaları temel bilgi sağladı. Alan ilerledikçe Ancak, VSMC fenotip ve işlevini vasküler yatakta özel bir dizi faktöre göre kontrol edilmişt...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal bovine serum	Life Technologies	16140-071
HEPES 1M solution	Fisher	MT-25-060
Primocin - 20mL	Invivogen	ant-pm-2
DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine)	Life Technologies	11995-065
MEM NEAA 10 mM 100X	Life Technologies	11140-050
L-Glut 200 mM - Gibco	Life Technologies	25030-081
Sterile Cell Strainer 100um nylon mesh	Fisher	22363549
Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm	Fisher	12-565-91
Harvard Apparatus black silk suture 5-0	Fisher	14-516-124
Collagenase Type-2	Worthington Biochemical	LS004176
Soybean Trypsin Inhibitor 25mg	Sigma	T6522
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (clear)	Life Technologies	14175-103
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (phenol red)	Life Technologies	14170-161
5.0 ml heating coil with degassing bubble trap	Radnoti	158830
11 plus pump	Harvard Apparatus	70-2208
Circulating heated water pump			any brand will work