Il dimetilnitrosamina indotta fibrosi epatica modello nel ratto

Riepilogo

We describe a method to produce an animal model of liver fibrosis in the rat, and assess the degree of fibrosis by histological examination of the liver. The model can be used to study the development of liver disease as well as to test the efficacy of potential anti-fibrotic agents.

Abstract

Da quattro a sei settimane di età, i ratti maschi Wistar sono stati usati per la produzione di modelli animali di fibrosi epatica. Il processo richiede quattro settimane di somministrazione di 10 mg / kg dimetilnitrosamina (DMN), dato per via intraperitoneale per tre giorni consecutivi a settimana. iniezioni intraperitoneali sono state eseguite nella cappa come DMN è un hepatoxin noto e cancerogena. Il modello presenta diversi vantaggi. In primo luogo, i cambiamenti del fegato possono essere studiati in sequenza o in particolari fasi di interesse. In secondo luogo, lo stadio della malattia epatica può essere monitorato attraverso la misurazione di aminotransferasi sierica aminotransferasi (ALT) e aspartato aminotransferasi (AST) enzimi. In terzo luogo, la gravità del danno epatico in diverse fasi può essere confermata dal sacrificio di animali in momenti designati, seguita da esame istologico dei tessuti del fegato Tricoma macchiate di Masson. Dopo quattro settimane di trattamento DMN, il tipico punteggio di fibrosi è da 5 a 6 sulla scala di Ishak. Il modello può essere riprodotto in modo coerente ed è stataampiamente utilizzato per valutare l'efficacia di potenziali agenti anti-fibrotiche.

Introduzione

DMN è una tossina specifica potente del fegato. Il suo metabolismo, distribuzione tissutale, e la capacità di causare lesioni a fegato di ratti è stato segnalato da Magee ^1, e il meccanismo di danno degli epatociti e la morte cellulare per apoptosi è stato descritto da Pritchard e Butler ^2. La somministrazione intermittente di questo composto è stato segnalato per indurre la fibrosi epatica nei cani e nei ratti ^3,4.

I meccanismi e le variazioni morfologiche della fibrosi epatica sono stati ampiamente studiati utilizzando questo modello. Nei primi studi con il topo, il trattamento di 3 settimane con DMN ha prodotto necrosi emorragica centrolobulare seguito da cirrosi micronodulare senza steatosi ^5. E 'stato dimostrato che nella fibrosi precoce, il collagene formato era più trasversale collegata con il tipo III di essere più prominente di tipo I ^6. In comune con altre cause, i cambiamenti fibrotici DMN-indotta sono stati associati con un aumento delle cellule di Kupffer; macrofagi epatici che risiedonon sinusoidi. Queste cellule si trasformano in miofibroblasti e producono quantità eccessive di matrice extracellulare, che è il problema principale nella fibrosi ^7.

In termini di segnalazione cellulare, Nakamura et al. Hanno dimostrato che il TGF-β gioca un ruolo critico nella progressione della fibrosi epatica ^8. Hanno usato un adenovirus che esprime un tronco di tipo II recettore TGF-β, di inibire specificamente la segnalazione del TGF-β. fibrosi epatica in questi ratti è stata spettacolare interrotta durante il trattamento DMN rispetto ai gruppi di controllo. Altri studi hanno confermato che la soppressione del TGF-β porta alla riduzione di fegato sviluppo della fibrosi ^9,10. Il modello è stato utilizzato anche in uno studio globale profilazione genetica per identificare altri marcatori di fibrosi e le proteine ​​che potrebbero essere utilizzati come bersagli farmacologici per la terapia anti-fibrotica ^11.

Altri agenti chimici usati per indurre la fibrosi epatica includere tioacetammide (TAA) e Ctetracloruro di arbon (CCL _4). TAA è stato usato per la prima nei ratti e poi nei topi ^12. I vantaggi di questo modello sono: facilità di somministrazione chimica nell'acqua, la riproducibilità del modello con caratteristiche cirrosi micronodulare e biochimici potabile. Gli svantaggi sono: il lungo periodo di tempo di 3 mesi per la fibrosi epatica per lo sviluppo e la mancanza di comprensione del meccanismo molecolare per l'induzione della fibrosi epatica. Per quanto riguarda CCl _4, il suo uso è diminuito per i seguenti motivi: non imitare malattie del fegato umano, hanno effetti nocivi per lo strato di ozono, provoca dolore e sofferenza agli animali, è molto tossico per l'uomo e non richiede ulteriori precauzioni nella sua manipolazione e lo smaltimento ^13,14.

Prolungata ostruzione biliare (mediante intervento chirurgico) come modello sperimentale per la cirrosi epatica è stato riportato da Kountouras et al. ^15. Questo metodo non è tossico per l'uomo e gli animali. HTuttavia, il punto tempo richiesto per la fibrosi epatica sviluppare varia. Una revisione di 30 rapporti di Marques et al. ^16, ha scoperto che ci sono voluti da sette giorni a quattro settimane dopo l'intervento chirurgico per la fibrosi epatica a svilupparsi. I cambiamenti patologici descritti imitano quelli di fibrosi biliare cronica umana e il modello sarebbe più adatto per i ricercatori interessati a questo settore.

In sintesi, la somministrazione intermittente di una dose costante di DMN nel ratto per 4 settimane produce fibrosi epatica che imita la malattia umana. Ratti Dosed mostrano lo sviluppo progressivo di danni al fegato e parenchimale la fibrosi ^4,17. Progressione e la gravità della malattia possono essere monitorati tramite campioni di sangue o sacrificio degli animali in punti temporali specifici e l'effetto è altamente riproducibile ^18. Così il modello è stato ampiamente utilizzato per studiare i meccanismi della fibrosi epatica e cirrosi nonché per lo screening per potenziali agenti anti-fibrotica ^10,19,20.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato di cura degli animali e l'uso della School of Applied Science, Temasek Politecnico.

1. Preparazione di DMN

1. Pipettare 200 ml di DMN (1 g / ml di soluzione) e aggiungere 19,8 ml di PBS per preparare la soluzione DMN 10 mg / ml per l'iniezione.
   Nota: DMN è cancerogeno. Utilizzare una cappa aspirante per preparare il DMN ed eseguire le iniezioni di animali.

2. iniezione intraperitoneale di DMN

1. Utilizzare ratti maschi Wistar con un peso medio di 150 - 200 g. Ambientarsi ratti per 4 - 7 giorni prima dell'inizio dell'esperimento.
2. Mantenere i ratti a temperatura ambiente di 22 ± 1 ° C, con 12 ore di luce e 12 ore cicli scuri. Fornire ratto chow e acqua ad libitum.
3. Misurare cibo e acqua assunzioni giornaliere. Misurare il peso corporeo a settimana.
4. Calcolare la quantità di DMN per ogni ratto base a una dose di 10 mg / kg di peso corporeo. Utilizzare una siringa da 1 ml con un calibro 25 ago to disegnare il volume calcolato di soluzione DMN nella siringa.
5. Trattenere il ratto per l'iniezione intraperitoneale ^21.
6. Con il ratto adeguatamente trattenuto, introdurre l'ago nel quadrante inferiore destro dell'addome, disegnare indietro lo stantuffo della siringa (non deve essere aspirato) per verificare il corretto posizionamento dell'ago all'interno dello spazio addominale e iniettare lentamente soluzione DMN.
7. Quando la dose di DMN è stato somministrato, ritirare lentamente l'ago e smaltire nel bidone taglienti.
8. Eseguire le iniezioni intraperitoneali di DMN per 3 giorni consecutivi a settimana per 4 settimane. Amministrare le iniezioni alla stessa ora ogni giorno. Re-calcolare il dosaggio in base al peso corporeo all'inizio di ogni settimana di iniezioni.
9. Prelevare il sangue dalla vena della coda settimanale per misurare i parametri biochimici: alanina aminotransferasi (ALT) e aspartato aminotransferasi (AST) ^22.
10. Misura siero ALT e AST utilizzando un Vet commercialeProva analizzatore chimico.

3. Esame Gross e Harvest di fegato

1. Euthanize i ratti mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital alla dose di 100 mg / kg di peso corporeo. Assicurare morte controllando la mancanza del battito cardiaco.
2. Preparati per il post mortem e valutare le condizioni dell'animale come descritto da Parkinson et al. ²³ Place topi morti sulla dissezione bordo in decubito dorsale con l'addome rivolto verso l'alto.
3. Disinfettare e inumidire la pelle con il 70% di etanolo.
4. Utilizzando le forbici, incidere la pelle della lunghezza del ventre dall'ano al mento, e riflettono la pelle. Con le forbici, incidere la parete addominale dall'ano alla cartilagine xifoide, per esporre visceri addominali.
5. Esaminare gli organi addominali in situ per verificare la presenza di eventuali anomalie. Prendere nota di eventuali cambiamenti di colore, le dimensioni, la posizione di organi e la presenza di liquido nella cavità peritoneale. Esaminarela consistenza di organi e notare la presenza di eventuali odori.
6. Utilizzando forbici e pinze, sezionare l'intero libera fegato dei suoi legamenti e allegati.
   1. Iniziare a ilo dove è attaccato al diaframma e lavorare per liberare tutti i lobi del fegato di allegati. Asportare accuratamente tutti i legamenti e vasi sanguigni.
7. Trasferire il fegato su una capsula di Petri e pesare il fegato.
8. Usando un bisturi, tagliare 2 - 5 mm di spessore sezioni dei lobi del fegato. Per coerenza, sempre prelevare campioni dello stesso lobo epatico. Prendere un cuneo di circa 5 mm di diametro di spessore, dal lobo laterale destro ²⁴ a circa 1 cm dal bordo del luogo lobe.Immediately in 10% formalina tamponata per il fissaggio. Assicurarsi che il tessuto del volume di formalina è di 1:10 o più.
9. Raccolta e immediatamente congelare porzioni (usando azoto liquido) di lobi epatici a questo punto se richiesto per altri studi. Per quanto riguarda la (3.8), campione della stessa lobo epatico di coerenza.

4. Processing, inclusione e sezionamento del Fegato

1. Fissare i campioni di fegato nel 10% formalina tamponata per un minimo di 24 ore.
2. Dopo la fissazione, tagliare il fegato, riporre in cassette e caricarli nel cesto del processore tessuti automatizzato.
3. Posizionare il cestino con le cassette in la prima stazione, che contiene il 10% formalina tamponata. Assicurarsi che le cassette sono interamente sommerse. Essi possono rimanere in questa camera per un massimo di 12 ore fino a quando inizia il ciclo.
4. Programmare il processore tessuti per ruotare le cassette per 1 ora ciascuno, attraverso successive stazioni contenenti le seguenti soluzioni: etanolo a concentrazioni di 50%, 70%, 90%, 100% (2 stazioni), xilene (2 stazioni) e paraffina liquida ( 2 stazioni).
5. Trasferire i campioni di fegato nel bagno di cera della stazione incorporamento. Assicurarsi che la macchina incorporamento è inserita almeno un'ora prima.
6. Uso di pinze pre-riscaldato (65 ° C), rimuovere ogni cassetta dal wvasca ax e posto sulla piastra calda (65 ° C) della macchina incorporamento. Versare quantità sufficiente di paraffina liquida nello stampo base in acciaio inox (preriscaldata a 65 ° C) fino a metà piena. Trasferire la sezione del fegato dalla cassetta nello stampo. Assicurarsi che il campione sia posizionato con la superficie di taglio (da esaminare al microscopio) piatta sul fondo dello stampo.
7. Riempire lo stampo completamente con paraffina liquida, montare la cassetta vuota sulla parte superiore e posizionare lo stampo sul piatto C 4 ° della macchina incorporamento raffreddare per almeno 30 minuti.
8. Controllare che la cera si è raffreddato e solidificato, e rimuovere il blocco di paraffina dallo stampo. Il blocco dovrebbe saltar fuori facilmente e non attaccare o crack. In questo caso, sciogliere il blocco e ripetere questo passaggio. Il blocco di paraffina può essere sezionato una volta si solidifica. I blocchi possono essere conservati a temperatura ambiente per molti anni.
9. Posizionare il blocco di paraffina nel microtomo e la sezione a 10 micron di spessore fino a quando lo strato di ceraviene rimosso sufficientemente per il tessuto epatico incorporato sia visibile.
10. Modificare l'impostazione sul microtomo per tagliare a 5 micron di spessore. Utilizzando pinze, prendere una sezione ben tagliato tenendolo sul bordo e galleggiare attentamente la sezione nel bagnomaria alla temperatura di 40 ° C.
11. Posizionare delicatamente un vetrino pulito nella sezione galleggiante e sollevarlo sulla superficie del vetrino. Posizionare il vetrino su un vetrino più caldo a 37 ° C durante la notte.

5. Masson colorazione tricromica

1. Prima di applicare le macchie, trattare i vetrini per rimuovere la cera e reidratare i tessuti come segue:
   1. Immergere le sezioni in xilene per 5 min. Ripetere 2x.
   2. Immergere le sezioni in 100% di etanolo per 3 min. Ripetere 1x.
   3. Porre le sezioni per 1 min in ciascuna delle seguenti soluzioni di etanolo: 90%, 80% e 70%.
2. Sciacquare il vetrino sotto l'acqua del rubinetto per rimuovere ogni etanolo esistente sulla diapositiva.
3. Immergere i vetrini in ferro ematossilina per 10 min a macchiare il nucleo.
4. Risciacquare i vetrini con acqua per rimuovere l'eccesso di colorante dalla diapositiva.
5. Immergere i vetrini in Biebrich Scarlet-Fucsina acida per 2 minuti a macchiare il citoplasma.
6. Sciacquare i vetrini con acqua.
7. Porre i vetrini in fosfotungstico / fosfomolibdico soluzione di acido per 10 minuti a promuovere l'adozione di anilina blu. Cambiare la soluzione di acido fosfotungstico / fosfomolibdico dopo 2 giri di utilizzo.
8. Porre i vetrini in soluzione blu di anilina per 10 minuti per colorare le fibre di collagene.
9. Lavare la macchia in eccesso con acqua e posizionare i vetrini in soluzione all'1% di acido acetico per 1 min per consentire differenziazione avvenga per rendere il colore della diapositiva più delicato e trasparente.
10. Sciacquare i vetrini con acqua e procedere a disidratare le sezioni di tessuto. I passi disidratazione sono i seguenti:
11. Immergere i vetrini successivamente per 10 secondi ogni volta, nel seguente concentrations di etanolo: 70%, 80%, 95% e 100%.
12. Immergere i vetrini per 30 secondi in 100% di etanolo. Ripetere 1x.
13. Sciacquare i vetrini attraverso 3 stazioni di xilene per 5 minuti ciascuna per rimuovere l'etanolo.
14. Montare un vetrino di vetro sulle campione con mezzo di montaggio (ad esempio, DPX di montaggio) e lasciare asciugare.
    Nota: DPX è una resina sintetica che asciuga rapidamente, conserva macchia e protegge la sezione di tessuto.

6. Fibrosi punteggio su di Masson Tricoma macchiate Sezioni di fegato

1. Avere un patologo veterinario valutare la gravità della fibrosi secondo il punteggio di fibrosi ^25. Sarebbe ottimale se il punteggio di fibrosi è fatto da due o tre patologi indipendentemente in modo cieco. In un tale scenario, è necessario ottenere un punteggio finale dopo la discussione e la revisione di gruppo per risolvere eventuali differenze di punteggio.

Punto	Descrizione
0	No fibrosi
1	espansione fibrosa di alcune aree del portale, con o senza breve setti fibrosi
2	espansione fibrosa della maggior parte delle aree del portale, con o senza breve setti fibrosi
3	espansione fibrosa della maggior parte delle aree del portale, portale occasionale a portale (PP) bridging
4	espansione fibrosa aree del portale con marcata ponte (portale a portale (PP) e portale centrale (PC)
5	Contrassegnato bridging (PP e / o PC) con noduli occasionali (cirrosi incompleta)
6	Cirrosi, probabile o certa

Tabella 1: punteggio di fibrosi utilizzato per la lettura Sezioni Tricoma macchiato fegato del Masson ^25.

Risultati

DMN ratti trattati perdere peso e diventare meno vigorosa con il cappotto di capelli arruffati. Vi è una significativa perdita di peso corporeo medio di ratti trattati DMN; prima rilevabile dopo 2 settimane di trattamento DMN, e questa differenza rimane attraverso settimane 3 e 4 dopo il trattamento DMN (Figura 1a). Mentre i topi ricevono DMN over settimane successive, danni al fegato induce a diventare più piccolo. L'indice del fegato; che è la percentuale di pes...

Discussione

Abbiamo descritto un metodo per rendere un modello animale di fibrosi epatica e di valutare la gravità della fibrosi epatica. E 'importante per fornire la dose corretta di DMN e rispettare il calendario delle iniezioni intraperitoneali settimanali. Mentre il test procede, è fondamentale per pesare i ratti e ricalcolare la dose all'inizio di ogni settimana di iniezioni DMN. Tenete a mente che DMN è tossico e deve essere gestita nel quadro dei fumi. Eseguiamo le iniezioni intraperitoneali nell'armadio fumi ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dimethylnitrosamine	Wako	147-03781
Formalin	Sinopharm chemicals	F63257009
Ethanol	Sigma	64-17-5
Xylene	Fisher	1330-20-7
Masson trichome stains
Aniline Blue	Electron Microscopy Sciences	#42755
Acid Fuschin	Electron Microscopy Sciences	RT42685
Scarlet Red	Electron Microscopy Sciences	#26905
Phosphotungstic Acid Hydrate	ALFA AESAR	ALFA40116.4
Phosphomolybdic Acid Hydrate	Sigma SG	221856-25G
Weigert's Iron Hematoxilyn	Merck	1.15973.0002
DPX Mounting Medium	Merck	HX066873
Tissue processor	Leica	Leica TP 1020
Embedding machine	Sakura	Sakura Tissue Tek TEC5 Embedding System
Microtome	Leica	Leica RM 2235
Vet Test Analyzer	Idexx	Vet Test 8008