Un método no invasivo y técnicamente no intensivos para la inducción y Fenotipificación Experimental de neumonía bacteriana en ratones

Resumen

Varios métodos han sido descritos en la literatura para el modelado de la neumonía bacteriana en ratones. En este documento, se describe un método no invasivo, de bajo costo, rápida para inducir neumonía a través de aspiración (es decir, inhalación) de un inóculo bacteriano pipeteó en la orofaringe. métodos aguas abajo para la evaluación de la respuesta inmune innata pulmonar también se detallan.

Resumen

Aunque la neumonía adquirida en la comunidad sigue siendo un problema importante de salud pública, los modelos murinos de neumonía bacteriana han facilitado recientemente importantes avances preclínicos en nuestra comprensión de la patogénesis molecular y celular subyacente. En vivo modelos de ratón capturan la fisiología integrada y capacidad de recuperación de la respuesta de defensa del huésped en de una manera no reveló por enfoques alternativos, simplificados ex vivo. Varios métodos han sido descritos en la literatura para la inoculación intrapulmonar de bacterias en ratones, incluyendo la aerosolización, la administración intranasal, la canulación endotraqueal peroral en condiciones "ciego" y visualizados, y la canulación endotraqueal transcutánea. Todos los métodos tienen ventajas relativas y limitaciones. En este documento, se describe en detalle un método no invasivo, técnicamente no intensiva, barato y rápido para la entrega intratraqueal de bacterias que consiste en la aspiración (es decir, inhalación) por el ratónde un inóculo infeccioso pipeteó en la orofaringe, mientras que bajo anestesia general. Este método se puede utilizar para la administración pulmonar de una amplia variedad de agentes biológicos y químicos no cáusticos, y es relativamente fácil de aprender, incluso para los laboratorios con experiencia previa mínima con procedimientos pulmonares. Además de describir el método de la neumonía por aspiración, también ofrecemos procedimientos paso a paso para ensayar la posterior in vivo la respuesta inmune innata pulmonar del ratón, en particular, los métodos para cuantificar la eliminación de bacterias y la respuesta inmune celular de las vías respiratorias infectadas. Este enfoque integrado y sencillo de evaluación neumonía permite la evaluación rápida y robusta de los efectos de las manipulaciones genéticas y ambientales en la inmunidad innata pulmonar.

Introducción

Neumonía adquirida en la comunidad sigue siendo la causa principal de muerte por infección en los EE.UU., con poco cambio en las tasas de mortalidad en los últimos 40 años a pesar de las mejoras en la vacunación y estrategias de antibióticos ^1,2. A pesar de la falta de progresos importantes en el ámbito de la salud pública, en los últimos años dramáticos avances se han hecho en nuestra comprensión de la patogénesis molecular y celular de la neumonía, con muchos de estos avances hechos posibles por el uso de modelos de ratón de infección pulmonar. La trazabilidad genética del ratón, la similitud de la murina y el sistema inmunológico humano, y la gran variedad de reactivos inmunológicos murinos-dirigida que se han convertido en disponible en el mercado en su conjunto han facilitado el rápido progreso del campo.

Los modelos de ratón de la neumonía bacteriana descrita en la literatura en general, se han basado en una de las cuatro rutas técnicas para la inoculación de patógenos: i) aerosolización; ii) intrAnasal entrega; iii) la entrega por vía oral; y iv) la inyección intratraqueal quirúrgico (es decir, traqueotomía) ^3. Todas las vías de infección tienen ventajas y desventajas ^3. En particular, la exposición, relativa de la vía aérea superior, el potencial para la mezcla de la flora oronasales, los requisitos para la anestesia general, la variabilidad del inóculo entregado al pulmón distal, distribución lobular de los patógenos entregados, los requisitos de pericia técnica, y la morbilidad de procedimiento varían ampliamente entre éstos enfoques.

Comúnmente usadas técnicas de infección perorales incluyen endotraqueal canulación (translaríngea), ya sea a través de un enfoque "a ciegas" (no visualizado), o bajo visualización directa de la laringe ^3-5. Ambos métodos, mientras robusto, requieren una formación sustancial y también conllevan un riesgo de traumatismo en la vía aérea superior. En el presente informe se describe un método técnicamente no intensiva, no invasiva, barata y rápida de la infección por vía oral, wdeclara bacterias (Klebsiella pneumoniae en el ejemplo proporcionado) pipetearon en la orofaringe de un ratón anestesiado se entregan a los pulmones a través de aspiración (es decir, la inhalación). Nosotros y otros han utilizado la técnica de la neumonía por aspiración con éxito ^6-9. Este método de pulmón de entrega versátil y fácil de aprender puede extenderse a la entrega de muchos agentes no cáusticos adicionales a los pulmones, incluyendo citoquinas y otras proteínas, moléculas asociados a patógenos (por ejemplo, lipopolisacáridos), células (es decir, la transferencia adoptiva), y toxinas (por ejemplo, bleomicina). Además de discutir las consideraciones técnicas importantes, como la descripción de un enfoque integrado, cuantitativo para evaluar la respuesta del huésped después de la neumonía, incluyendo la medición aguas abajo de la eliminación de bacterias (es decir, unidades formadoras de colonias [UFC] cuantificación de los órganos pulmonares y periféricos) y leucocitos acumulación en el espacio aéreo.

Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con la Ley de Bienestar Animal y la Política de Servicio de Salud Pública de Estados Unidos sobre la Integridad Personal Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio después de la revisión por el Cuidado de Animales y el empleo del NIEHS.

1. Preparación de K. pneumoniae Cultura

Precaución: Realizar todos los pasos del 2 campana (BSL2) nivel de bioseguridad u otra área designada BSL2 y desechar los residuos según las pautas BSL2 instituto.

1. Para el crecimiento suspensión de K. pneumoniae, descongelar un stock de glicerol de bacterias y inocular un cultivo de trabajo mediante la transferencia de 1 ml de K. pneumoniae acciones a 50 ml de caldo de soja tríptico (TSB) en un 500 ml o más grande matraz.
2. Hacer reservas de glicerina mediante la adición de 900 l de registro de la fase cultivaron K. pneumoniae a 100 l de glicerol estéril y congelar a -20 ° C o -80 ° C. Para el almacenamiento a largo plazo, se recomienda -80 ° C.
3. bacterias del cultivo de sTEP 1.1 por matraz de agitación durante la noche (14 - 18 horas) a 37 ° C a 200-225 rpm.In fin de promover el crecimiento de fase logarítmica, diluir 1-5 ml de este cultivo durante la noche en un matraz que contenía 50 ml de TSB por la mañana y el lugar de nuevo a 37 ° C con agitación durante ~ 2,5 h.
4. Transferir 1 ml de K. cultura pneumoniae de la última etapa en un tubo de 1,5 ml y centrifugado a 7500 xg durante 2 min. Una pastilla blanca debe ser visible. Extraer el sobrenadante sin perturbar el sedimento, resuspender suavemente las bacterias con la pipeta en 1 ml de solución salina estéril, y girar de nuevo a 7500 x g durante 2 min.
   1. Realice este paso de lavado 2x, con lo que el sedimento final, se lavaron en 1 ml de solución salina estéril.
5. Realizar diluciones seriadas log-sabia de este inóculo ordenada. Por ejemplo, añadir 400 l de inóculo en 3,6 ml de solución salina estéril en serie para hacer una serie 10 ^-1 -10 ^-9 dilución.
6. Determinar la densidad óptica de ₆₀₀ K. lavada pneumoniae mediante la colocación de 1 ml de la01:10 y 1: 100 diluciones en cubetas desechables y midiendo la OD _600, blanking primero con solución salina estéril. Medir duplicados para garantizar la precisión. Un OD ₆₀₀ de 1,0 es aproximadamente equivalente a 4-7 x 10 ⁸ UFC / ml. Tenga en cuenta que la relación entre OD y CFU / ml puede no ser lineal.
   1. Utilice el OD ₆₀₀ de las diluciones para calcular la concentración de K. pneumoniae, la aplicación de la OD: conversión de UFC / ml de arriba, y el factoring en la dilución.
7. Utilice la K. concentración pneumoniae para preparar la dosis de inóculo CFU deseado en un <100 l de volumen para la entrega a los ratones (véase más adelante).
8. También la placa 100 l de 10 ^-6 -10 ^-9 diluciones y 100 l de solución salina estéril en placas de agar individuales de soja tríptico (TSA) a TA. Incubar a 37 ° C durante la noche y enumerar las colonias de bacterias con el fin de calcular la concentración exacta que se utilizó en el experimento y para controlar la contaminación.
   NOTA: concentración bacteriana real de inóculo final puede ser de ± 500 UFC / ml que se predijo por absorbancia. Los experimentadores deben confirmar idealmente el OD _600: / ml CFU relación en estudios piloto antes de su uso in vivo en ratones, empíricamente el reajuste de la DO _600: UFC conversión / ml en base a su experiencia personal.

2. murino intratraqueal (it) La aspiración de K. pneumoniae en Orofaringe

1. Asegurar que los ratones se identifica de forma exclusiva por la marca de cola, tatuaje, u otro identificador aprobado.
2. Elaborar dosificación inóculo de bacterias usando la pipeta P200 antes de retirar los ratones de isoflurano con el fin de agilizar el procedimiento. Para obtener los mejores resultados con ella aspiración, utilizar un volumen de 100 l K. pneumoniae.
3. Anestesiar los ratones en una cámara transparente con gas isoflurano (por ejemplo, 2% de isoflurano a un caudal de 1 L / min) o según Institdirectrices utional. El número de ratones para anestesiar juntos se determina por el nivel de comodidad del experimentador, típicamente 1 a 2 a la vez. Observar la respiración y el nivel de anestesia confirmar una vez respiraciones profundas son visibles y 2-3 seg pueden contarse entre las respiraciones.
   NOTA: Si existe la preocupación acerca de los posibles efectos de confusión de los anestésicos volátiles (inhalados), la anestesia puede lograrse en lugar de la inyección intraperitoneal de ketamina / xilazina. Con el método descrito anteriormente, la anestesia profundas sólo dura unos minutos. Si se induce la anestesia más prolongada, pomada para los ojos debe ser utilizado para prevenir la desecación ocular.
4. Una vez que se anestesia ratón, coloque en una posición supina semisentada, suspendido por los incisivos superiores de una banda de goma estirada entre las clavijas en un tablero inclinado plexiglás (Figura 1).
5. Tire suavemente de la lengüeta del ratón a un lado con un par de pinzas no camellones romos y la dosis de depósito en la cavidad oral con una pipetee P200mi. Tenga mucho cuidado para evitar la inducción de un trauma ya sea a la lengua o la orofaringe.
6. Mientras se mantiene la lengua retraída, ocluir suavemente la nariz con un dedo enguantado hasta que inhala el ratón. Continúe cubriendo la nariz hasta que el ratón ha tomado dos o más inhalaciones, y el líquido no es visible en la cavidad oral. Cubrir la nariz ayuda a asegurar que el ratón se inhalan las bacterias en los pulmones, ya que los ratones son respiradores nasales obligados.
7. Retire el ratón de la placa de la inoculación y volver a su jaula, colocando el puntero del ratón sobre su espalda para evitar que la ropa de cama o escombros bloqueen las fosas nasales mientras que el ratón se está recuperando de la anestesia.
8. Una vez que todos los ratones han sido dosificados y han despertado de la anestesia, los ratones domésticos en un cubículo / habitación que contienen sólo los ratones que han sido dosificados con K. pneumoniae. Monitorear los ratones diariamente, incluyendo los pesos corporales, si se va más allá de 48 horas después de la infección.
9. Use puré diario y / o calor suplementario si lo que permite a los ratones para ir más allá de 48hora

3. Lavado broncoalveolar fluido (BALF) Recogida y análisis

1. La eutanasia a los ratones acuerdo con la normativa. Aquí, utilizar una inyección letal de 150 mg / kg de pentobarbital sódico o dosis equivalente de solución de eutanasia comercial seguido por desangramiento, ya que esto evita posibles complicaciones a los pulmones asociadas con inhalación de _CO2 y dislocación cervical.
2. Posición del ratón en la parte posterior del ratón y esterilizar mediante pulverización de piel con 70% de etanol sobre todo en la zona del pecho y el cuello.
3. Haga un corte longitudinal justo debajo del esternón, a continuación, sostiene el esternón con fórceps, mella del diafragma, lo que permite que el pulmón se vuelven a caer en la cavidad torácica. Cortar a través de la cavidad del pecho a cada lado de la vasculatura y luego hacia arriba a través del cuello, exponiendo la tráquea.
4. A medida que la tráquea está rodeada de músculos longitudinales a cada lado, cortar con cuidado por el medio y empujar el tejido hacia los lados, comoesto evita el corte de la vasculatura circundante, que podría introducir sangre en la tráquea. Si se mella la vasculatura, limpiar la zona de los alrededores con una gasa antes de acceder a la luz traqueal.
5. Use las tijeras quirúrgicas o una aguja para nick la tráquea alrededor de ¼ del camino hacia abajo desde la cabeza e insertar una cánula unida a una jeringa de 1 ml precargada con 1 ml de 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) caudalmente en la tráquea. Si utilizan ratones <8 semanas de edad o hembras, reducir el volumen lavaging a 600-800 l.
6. Empuje el volumen en el pulmón lentamente, permitiendo que todos los lóbulos para inflar y luego tirar el volumen de vuelta con la jeringa, repetir 3 veces. Si PBS está saliendo de las ventanas de la nariz de la cánula no se ha introducido lo suficiente en la tráquea o la inflación está ocurriendo demasiado rápido. Alternativamente, si los pulmones no están inflando así, la cánula ha sido empujado demasiado lejos, por lo que retirar ligeramente.
7. Recoger lavados combinados en un tubo de 15 ml en hielo.
8. Girarel líquido de lavado del espacio aéreo a 1200 xg durante 5 min, recoger el líquido sobrenadante en un tubo de 1,5 ml y se congela a -80 ° C. Posteriormente, utilizar el sobrenadante (es decir, BALF) para la medición de proteínas, citoquinas, y para varios otros ensayos bioquímicos. El sedimento representa las células de el espacio broncoalveolar.
9. Si los glóbulos rojos (GR) son evidentes en el sedimento de células basada en el color, se lisan con 1 ml de tampón de lisis ACK de 1 min seguido de la adición de 5 ml de PBS 1x para detener la reacción de lisis y diluir la memoria intermedia. Manipular todas las muestras de forma idéntica, ya sea tratada o no con tampón de lisis ACK.
10. Centrifugar las células a 1200 xg durante 5 minutos, decantar el sobrenadante, y traer las células en 1 ml de PBS 1x.
11. células de vórtice y cuentan con un hemocitómetro para el recuento de células totales del espacio aéreo.
12. Sobre la base de la densidad de las células de añadir aproximadamente 80-150 l (~ 80 l para un ratón infectado y ~ 150 para un ratón ingenuo) a una cámara de diapositivas en una centrífuga cytospin. celda de hilados en portaobjetos para la tinción posterior para determinar las poblaciones de células diferenciales.
13. Permiten que las células se sequen en las diapositivas durante la noche. Las células se tiñen con tri-manchas (por ejemplo, Hema 3 [ver tabla]) sumergiendo los portaobjetos 7 veces en fijador, 9 veces en la mancha 1, y 7 veces en la mancha 2 (sin enjuagues entre las manchas), y dejar secar. Después de mancha se ha secado, se desliza manualmente cubreobjetos y cuentan diferenciales por microscopio. En general, los neutrófilos y los monocitos / macrófagos se distinguen fácilmente por su tamaño y la morfología nuclear.

4. Determinación de la carga bacteriana en el pulmón y los tejidos periféricos

1. Antes de comenzar: preparar tubos de dilución con 900 l de PBS 1x para pulmón y el bazo y 90 l de PBS 1x para la sangre. Las placas de identificación para el cultivo de bacterias y fijados a temperatura ambiente; Por lo tanto, el tiempo una vez que el tejido que se ha recogido se reducirán al mínimo entre la homogeneización y de las planchas para el crecimiento bacteriano.
   Nota: Debido a la heterogeneidad deposición de bacterias en los pulmones que pueden ocurrir con la aspiración, se recomienda que los ratones individuales se utilizaron para el análisis de cualquiera de las vías respiratorias celularidad, total o la carga bacteriana (bilateral) pulmonar total.
2. La eutanasia el ratón como en el paso 3.1 y posteriormente recoger la sangre desde el ventrículo izquierdo, colocando en un tubo heparinizado para evitar la coagulación. Retirar todos los lóbulos pulmonares y lugar en un tubo de 15 ml que contiene 5 ml de 1 x PBS, seguido de la eliminación del bazo y la colocación en 2 ml de 1x PBS. Colocar los tubos en hielo. Tenga cuidado de limpiar los instrumentos con etanol entre cada tejido / ratón.
3. Homogeneizar el tejido en hielo, de preferencia con homogeneizadores desechables que se pueden cambiar entre cada muestra. consejos homogeneizador desechables pueden ser esterilizados en autoclave para su reutilización entre los experimentos.
4. Una vez que el tejido ha sido homogeneizada, realizar diluciones seriadas y placa. Las muestras de placa de un tejido / dilución dada por duplicado en una sola placa de TSA al trazar una línea divisoria en el plástico. Galvanoplastia y disugerencias Lution se muestran a continuación (en todos los casos, 10 l de muestra se extiende sobre la placa) y se basan en un 24 hr necropsia post-infección. Si el análisis de muestras de 48-72 hr, puede necesitar ser chapado debido al aumento de la carga bacteriana en puntos de tiempo posteriores a un mayor número de diluciones.
   1. Por Sangre - diluir 1:10 añadiendo 10 l de sangre en 90 l de PBS estéril 1x. Placa ordenada y 1:10 muestras diluidas por duplicado. Una vez que la sangre ha sido chapado, girar la sangre residual a 9.300 xg durante 10 min para extraer plasma para la medición de citocinas y quimiocinas.
   2. Para pulmón - diluir 1:10 - 1: 100 añadiendo 100 l de homogeneizado de pulmón en 900 l de PBS estéril 1x en serie. Placa ordenada homogeneizado y todas las diluciones por duplicado.
   3. Para Bazo - diluir 1: 10-1: 100 mediante la adición de 100 l de bazo homogeneizado en 900 l de PBS estéril 1x en serie. Placa ordenada homogeneizado y las dos diluciones por duplicado.
5. Dejar que las muestras se sequen propagación brevemente.
6. Invertir placas TSA y el lugar de forma estática a 37ºC durante la noche.
7. Determinar el número de bacterias que colonizan el promedio de las colonias bacterianas de ambos lados de la placa y de cada dilución. Factor en las diluciones iniciales de 5 ml para los pulmones y el bazo 2 ml para determinar las UFC total del tejido.

Resultados

C57BL / 6 ratones fueron infectados con 2000 UFC de K. pneumoniae 43816 (serotipo 2) a través de la aspiración orofaríngea en los pulmones. A esta dosis, los ratones normalmente comienzan a mostrar síntomas clínicos 12-24 horas después de la infección, incluyendo letargo, pelo erizado, y la pérdida de peso del 5-10% (Figura 2). Dentro de 48-72 horas después de la infección, muchos de los ratones muestran síntomas de la enfermedad y la morbilidad que p...

Discusión

Los modelos murinos de neumonía bacteriana, se asociaron con la orientación de genes y en las intervenciones biológicas y farmacológicas in vivo, han proporcionado una perspectiva crítica en la respuesta de defensa del huésped pulmonar. Grandes avances se han hecho en particular en nuestra comprensión de las quimiocinas y moléculas de adhesión que rigen el reclutamiento de neutrófilos al espacio aéreo infectada ^10,11. En modelos in vivo de neumonía, a diferencia...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Klebsiella pneumoniae, serotype 2	ATCC	43816
Tryptic soy broth	Becton Dickenson	211825
Excel Safelet IV Catheters, 18 G x 1 1/4"	Claflin Medical Equipment	MEDC-031122
Hema 3 Solution 1	Fisher	23-122-937
Hema 3 Solution 2	Fisher	23-122-952
Hema 3 Fixative	Fisher	23-122-929
27½ gauge tuberculin syringes	Fisher	14-826-87
Lithium heparin plasma collectors	Fisher	2675187
L-shaped disposable spreaders	Lab Scientific	DSC
1x PBS, pH 7.4	prepared in-house	n/a	Distilled water (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5.75 g), KH2PO4 (1 g)
ACK lysis buffer	prepared in-house	n/a	NH4Cl (4.145 g), KHCO3 (0.5 g), EDTA (18.6 mg), bring up to 500 ml with distilled water and pH to 7.4