ImageJのプラグインを使用して細胞の計数手順の自動定量化と分析

要約

This paper describes the quantification of hemocytometer and migration/invasion micrographs through two new open-source ImageJ plugins Cell Concentration Calculator and migration assay Counter. Furthermore, it describes image acquisition and calibration protocols as well as discusses in detail the input requirements of the plugins.

要約

健康のImageJの国立研究所は、強力な、自由利用可能な画像処理ソフトウェアスイートです。 ImageJのは、様々な生物学的粒子をカウントするために有効に利用することができる総合的な粒子解析アルゴリズムを有します。セルの多数のサンプルをカウントすると、血球計数器は、時間に関してボトルネックを提示します。同様に、ImageJのプラグインセルカウンターで移行/浸潤アッセイからの膜を数え、正確なものの、非常に労働集約的主観、および手首の痛みを引き起こすための悪名高いです。このニーズに応えるために、我々は、自動血球計数器（または知られているボリューム）と移行/浸潤細胞計数の唯一のタスクのためのImageJ内の2つのプラグインを開発しました。どちらのプラグインは、最小限の背景に高品質の顕微鏡写真を取得する能力に依存します。彼らは、使いやすいとカウントのキャリブレーションを支援する組み込みの分析ツールを持つ大規模なサンプルサイズの迅速な計数および分析のために最適化されています。コア原理を組み合わせることにより自動化された計数アルゴリズムおよびポスト計数分析による細胞カウンタのsが、これは非常に遊走アッセイ精度を失うことなく処理することができる容易さを増大させます。

概要

インビトロでの細胞計数では、組織培養実験の広い範囲の重要な基本的な技術です。正確に培養物中の細胞の数を決定する実験の再現性および標準化の^1,2のために不可欠です。細胞計数は、血球計を用いて、ならびに自動化された方法の様々な独自の利点と欠点^3,4,5でそれぞれを使用して手動で行うことができます。細胞計数のための自動化された方法のほとんどは、2つのクラス、コールター原理を使用するか、フローサイトメトリーもののいずれかに属しています。コールターカウンターは、細胞数およびサイズを決定するために、セルの電気抵抗を利用します。彼らは、高速で正確かつフローサイトメーターよりも安くなっています。しかし、彼らはほとんどマニュアルカウント³に比べて、それらのかなりのコストにのみ細胞計数のために使用されていません。フローサイトメーターは、一方で、高価であるが、それらは、細胞計数、細胞形状の解析、STのような多くの用途を有しますructureと内部細胞マーカーに^4,5を測定^します 。これら2つの原則のいずれかを使用するマシンは、多くのメーカーから入手可能です。自動化された方法は、手動計数のために必要な時間の一部が付属していますが、高価なマシン^6を使用しながら手動カウントが手頃な価格が、時間がかかり、バイアスの対象となります。

他の一般的な細胞培養手順は、細胞遊走および浸潤^7、すなわち、 インビトロ細胞運動性アッセイです 。遊走および浸潤アッセイは、一般的走化性応答に応答して細胞運動性および侵襲性を調査するために使用されます。さらに、それらは、広く多様な細胞型^7-11の胚発生、分化、炎症反応、および転移を研究するために使用されます。遊走アッセイの多孔質膜を通って遊走または浸潤した細胞は、2つの異なる方法で定量することができます。あちこちまず、蛍​​光色素で細胞を染色することにより、解離蛍光リーダ^12を用いて膜、および定量化をメートル。定量化のこの方法の制限は、レコードが膜を保持することができない、さらなる分析¹³のための可能性がないということです。第二の定量法は、クリスタルバイオレット、トルイジンブルー染料またはヘマトキシリンなどの細胞学的染料で、より一般的に蛍光色素またはで固定し、染色する浸潤/遊走した細胞のためのものです。次いで、細胞を、手動で、非常に時間のかかる作業^12,13でこれらの膜を倒立顕微鏡画像を使用して定量します。

手動細胞計数の欠点を克服するために、細胞濃度および移動アッセイのための2つの信頼できる正確な自動細胞カウンターを開発しました。これらの自動化されたセルカウンタアルゴリズムは、OracleのJavaコンピュータ言語を使用してプラグインとしてImageJのために開発されました。 ImageJがょんの国立研究所によって開発された公開と広く使用されている画像処理ツールです。^{LTH（NIH）14,15;}このように、ImageJのためにこれらのプラグインを書くこと生物群集への容易な統合を容易にします。

細胞計数の自動化は、手動カウントに比べて高いスループットと再現性を保証します。他の利用可能なソフトウェアやプラグインは、画像解析^5,16,17、細胞濃度計算プラグインを介して細胞濃度を計算するために使用することができるが、高速であり、また、細胞および治療の希釈物を処理することができます。また、これら2つのカウンタからのすべての結果と計算が保存され、エクスポートすることができます。このホワイトペーパーで説明する2つのプラグインは、解剖スコープを使用することにより、生細胞イメージングおよび遊走アッセイ膜のための大きな視野（膜全体のキャプチャ）イメージング用の位相差顕微鏡の使用に最適化されています。 http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins：プラグインはからのインストール手順とダウンロードのために自由に利用できます。

プロトコル

1.複合顕微鏡とカメラ設定（細胞濃度計算）

1. 、調光つまみで完全に電球の明るさを増やし4X対物レンズに切り替え、位相コントラストフィルタが選択されていることを確認します。
   注：暗い背景と組織培養のための任意の倒立位相差顕微鏡、 例えば、PHPの位相差は、標準的な顕微鏡及びカメラ手順に従って使用することができます。
2. 顕微鏡のソフトウェアの中では、デフォルト値に画像キャプチャ設定を行います。
   注：これらの設定の場所を見つけるために、顕微鏡のユーザーマニュアルを参照してください。
   1. 「明るさ」、「コントラスト」、および100％の「彩度」と「ガンマ」と1.0への「ゲイン」を設定します。
      注：ソフトウェアによっては、「明るさ」と「コントラスト」は0パーセントの値の代わりに、100％をデフォルトにすることができます。
   2. セットの画像は黒と白のは、最高解像度のご利用できますを使用して捕捉されます電子（1600 X 1200ピクセル（px）以上）。
      注：黒と白の設定が利用できない場合、0％の「飽和」は十分です。
3. 顕微鏡ステージ上に標準血球計数器を配置し（ 図1A）に示されるように画像を取り込みます。これは、「ボリュームキャリブレーション画像」です。必要に応じて露光タイミングを調整します。

2.画像​​ボリュームキャリブレーション

1. オープンImageJのとプラグイン]メニューから、細胞濃度の計算を開始（CCC）、プラグイン、 例えば 、プラグイン>アナライザ> '細胞濃度電卓」。
   1. 右側の「画像ボリュームキャリブレーション」パネルが表示されていない場合は、それを表示するには「キャリブレーション」をクリックします。
2. ImageJのでは、「取得画像ディメンション」ボタンをステップ1.3（「ファイル」>「開く」）とCCCのクリックでから「ボリュームキャリブレーション画像」を開きます。
   注：これは、両方の画像の幅を記入し、自動的にピクセル単位で画像の解像度を持つ高さテキストボックス。
3. ImageJのでは、「直線ツール」の選択ツールの隣を選択し、血球計数器の一次（P）の全長に亘って直線を引くカーソルをクリックしてドラッグすることで（ 図1B）で実証-square。
   1. 直線寸法を含む結果]ウィンドウを表示するには、「M」キーを押してください。 CCCの「P-平方長」テキストボックス（ 図1B）に長さの列の値を入力します。
   2. 画像ボリュームのテキストボックスに画像ボリュームを出力する「計算画像ボリューム」ボタンをクリックしてください。画像のボリュームが既に知られている場合、交互に、画像ボリュームのテキストボックスにnLのボリュームを入力します。
4. 「保存」ボタンをクリックします。
   注：このプラグインは現在、キャリブレーションされています。

3.カメラの露出キャリブレーション

1. 以下のための以下の細胞収穫血球計数器のチャンバ内に血球計数器、負荷細胞の10μLを経由してカウントし、顕微鏡ステージ上に置きます。
2. 血球計数器の背景線が消えるように、ステップ1.2から同じ設定を使用して、露光時間を調整します。
   1. 細胞の内部には、セルの中央断面ではなく、極内でフォーカスを示す、細胞膜よりも暗くなるようにフォーカスを調整します。
   2. さらに、細胞が露出オーバーにならないように露出を調整します （ 図1C）に示されたものに似ています。
      注：わずかに見える血球計数器ラインが許容されます。精度と再現性を維持するために、これらの設定を保存するか、または記録することをお勧めします。

4.画像取得

1. 各細胞試料について、血球計数器の両方のチャンバへの負荷10μLは、統計的推論のパワー^2を増加させます。顕微鏡ステージ上に血球計数器を置きますイメージングのため。
   注：各画像の解像度や倍率は「ボリュームキャリブレーション画像 'と同じでなければなりません。プラグインは、任意の選択したフォルダのすべての画像をカウントします。同じフォルダにまとめてカウントする画像を続けます。
   1. ファイル名のオートインクリメント機能が利用可能な場合、それをオンにし、各画像は、スループットを向上させるために捕獲した後に表示されていないことを確認してください。
      注：手動で各画像を保存して閉じるには、大幅に処理が遅くなります。自動インクリメント機能の可用性について、顕微鏡のユーザーマニュアルを参照してください。
   2. （5-10）以上であるが、血球計数器の中央領域の少なくとも3つの非重複画像をキャプチャ精度を高めることをお勧めします。
      注：細胞が両方の場所での密度が増加する傾向があるとして、チャンバーの上部と下部の両方の領域を避けてください。すべての室のための画像の同じ数を取ります。これは、カウント中にプラグインが正しく機能するために必要とされます。

5.イメージカウントと希釈

1. CCCでは、「セルのカウント」をクリックし、ディレクトリを選択してダイアログボックスを観察します。カウントするフォルダを選択します。
2. フォルダを選択した後、検体番号入力ボックスを確認します。室ごとに撮影した画像、 すなわち、4.1.2の番号を入力し、「OK」をクリックします。プラグインは現在、アルファベット順で選択したフォルダ内のすべてのjpg、TIFF、およびPNG画像をカウントします。
   注：「サンプル・ビューア」ボタンをクリックすると、カウントサンプルについての情報を表示するサンプル・ビューア・ウィンドウが表示されます。サンプル濃度は、チャンバごとに撮影したすべての画像の平均濃度です。単位のない濃度を有する試料は、薬物または小分子治療の追加として、このリストに追加することができます。
   1. 濃度が同じ試料（セクション4）のカウント以内大きく変わる場合細胞サンプルを物語ります。
      注：すべてのtについての希釈を計算するには彼は、カウント・サンプルを、CCCは、自動的に式C ₁ V ₁ = C ₂ V _2を使用し_ています。
3. 余分な96ウェルプレート+ 1の30ウェルに播種の200μLあたり15,000細胞を、シナリオを使用します。
   1. 「μL」に隣接するコンボボックスユニットを変更し、200に15,000 C2ラベルの右側と濃度のボリュームテキストボックスにテキストボックスを設定します。
      注：このプラグインは、最終的に細胞/ mLの濃度を算出します。
   2. ボリューム単位コンボボックスで「μL」を選択、6200（200μLのX（30 + 1））を入力し、ボリュームコンボボックスが選択されたV2（最終体積）を持っていることを確認し、右側のテキストボックスにしてください。
4. 左下のリストボックスに、現在入力された希釈を追加するには、「計算希釈]をクリックします。
   注：追加されたそれぞれの希釈について、各サンプルについて解決されると、右のツリー図に表示されました。各エントリをダブルクリックして展開します。
5. トンをクリックします彼は、「サンプル・ビューア」ボタンの下の「保存」ボタンをクリックすると、すべてのサンプルデータおよび希釈液をファイルに書き込みます。
6. 注：これらのデータは、「読み込み」をクリックし、保存したファイルを選択することによって、いつでも回収することができます。

6.遊走および浸潤（カウンター）

1. 標準Boydenチャンバー法^7-9を用いて、遊走および浸潤アッセイを行います。
2. 細胞が侵入し/移行した後は、慎重に反転し、穏やかにタップすることで、インサート内のメディアを削除します。ウィック離れたペーパータオルに端をタッチすることにより、膜の底に付着した余分なメディア。
   注：これは接着細胞を取り除くことがあり、タオルに膜自体には手を触れないでください。
3. 別のソリューションの〜500μlの、 例えば 、定着剤、ステイン1、ステイン2、および二重蒸留水（のddH ₂ O）を含む各行に設定し、24ウェルプレートに^7-9報告されたように細胞を固定し、染色します。 1×PBSトンと第二のプレートを埋めますO切断する前にインサートを配置します。
4. ddH ₂ Oを充填したウェルにそれらを配置することにより、インサートを洗浄し、反転により細胞を離れて拭き取り前に水を排水のddH ₂ Oでインサートを埋めます。
5. 膜を損傷しないように注意しながら、膜の上から非侵入/非遊走した細胞を除去するために、清潔な綿棒を使用してください。膜のエッジの周り徹底すること。
6. カミソリやメスを使用して膜をカットし、慎重にきれいなスライドガラス上に膜（ボトムサイドアップ）を転送。
7. 下に、膜の上にマウントソリューションの小滴を追加し、薄いカバースリップでカバーしています。
   注：カウントの精度を維持するためにマウントソリューション内の気泡をトラップすることは避けてください。

7.スコープとカメラのセットアップを解剖

1. 顕微鏡の光源とカメラの電源をオンにします。
   注：詳細な手順については、顕微鏡のユーザーズマニュアルを参照してください。
2. ウィット顕微鏡のソフトウェアをホアヒン、デフォルト値に画像キャプチャ設定を行います。
   注：平均化関数が存在する場合は、4の値を推奨します。これは、平均化し、画像取得時間の程度との間の良好な妥協です。同様に、鮮鋭度が小さい画像の忠実度を増加させることができます。
   1. 「明るさ」、「コントラスト」、および100％の「彩度」と「ガンマ」と1.0への「ゲイン」を設定します。
      注：ソフトウェアによっては、「明るさ」と「コントラスト」は0パーセントの値の代わりに、100％をデフォルトにすることができます。
   2. それらの最大値に設定表示（リアルタイム）とキャプチャ解像度（1600 X 1200 pxと2592 X 1944ピクセル、それぞれ）。
      注：リフレッシュレートが遅すぎる場合は、必要に応じてディスプレイの解像度を調整することができます。低解像度は、それがより困難に正確に焦点を合わせたものですが、リフレッシュレートを増加させることになります。
3. 解剖スコープのステージのために、白色固体backgroを使用ウント;黒またはガラス背景が不十分です。
4. 右に2つの可撓性のLEDライトから好ましくは、上記段の光源を使用して、ステージを去りました。
   注：A下の段の光源は、負その後のカウントの精度に影響を与える可能性遊走アッセイ膜内の細孔を点灯します。
5. ステージ上に完成した遊走アッセイ膜のスライドを置きます。単一の膜のエッジがちょうどカメラの視野内にあるように、ソフトウェアによって表示されるリアルタイム画像を見ると、ズーム調整つまみで倍率を調整します。
   注：ガラス板上にスライドを配置オーバートップ白地ステージは、簡単に画像化のためのスライドを操縦することができます。
6. できるだけ密接に図2Aに示された理想的な画像を再現するために、光源の位置（7.6.1）と露光時間を調整します。明るさに応じて、5から60ミリ秒の露光時間は十分であるべきです。
   注意：目的は、目に見える細胞の喪失につながる可能な限り少ない背景色と、すなわち画像の忠実度を低下させることなく均一に照明膜、露出オーバーの画像を生成することです。
   1. スライドに低い角度で左右の光源を配置します。これは、地汚れや色収差を除去するのに役立ちます。他に直接反対の各光源を保つようにしてください。
      注：所定の位置に各光源を操作しながら、他の電源をオフにします。これは、より簡単かつ正確に膜自体の上に照明の領域を中心に役立ちます。
7. スライドとホワイトバランス顕微鏡ソフトウェアの単一のボタンのクリックを使用して画像を削除します。
   注：顕微鏡は今較正されます。将来の使用のために、できるだけ多くの設定を保存して、光源の位置と強度のメモを取ります。

8.画像取得とフラットフィールド

1. ソフトウェアの中で、設定キャプチャフォルダの場所、および膜ごとに1つの画像をキャプチャします。ように001.tif、および- ###、 例えば 、コントロール- - 001.tif、コントロール- 002.tif、試験薬剤名：の一般的なテンプレート以下の画像に名前を付けます。
   注：最高の画像結果を得るには、JPEGなどの他の非可逆フォーマットを超えるTIFFなどの画像ファイルの種類を保存します。
   注：画像はまだカウントされる一般的なテンプレートを以下ませんが、自動化されたグループ化とフラットフィールディングの対象にはなりません。
   1. フラットフィールド補正を希望する場合は、各スライドの空の領域を見つけて、命名規則次の空白の画像を撮る：名前 - ブランク。
      注：ブランクは全く膜を含まず、背景照明を表し、スライド上の領域です。
   2. すぐに撮影する前に、カバーガラスの上に圧力を適用することにより、各膜を平坦化し、可能な限り多く捕獲された気泡を除去。
2. ImageJのでは、プラグインに移動し、TCプラグインを開きます。 例えば、プラグイン>分析>＆＃39;トランスウェルカウンター」。
3. TCの中で、「フラットフィールド」ボタンをクリックして、ディレクトリを選択してダイアログボックスを観察します。膜の画像が保存されたフォルダを選択します。
   注：上記の一般的なテンプレートに保存されたイメージのみが自動的に補正され、選択したフォルダ内のフラットフィールドと呼ばれる新しいフォルダに保存フラットフィールドされます。フラットフィールド補正画像の例については、 図2Bを参照してください。

9.構成の設定

1. ImageJの（「ファイル」>「開く」）に移動アッセイ膜の画像を開き、イメージを選択>>調整「色のしきい値を...」。画像からフィルタリングされるかを色調整する色Threshold]ウィンドウを確認します。
   1. ウィンドウの下部に、「RGB」（赤、緑、青）に設定しきい値処理法」Shanbhag」に、「ホワイト」にしきい値の色、および色空間で、選択された場合は暗い背景をオフにします。
   2. トップを調整します0〜255までのマーカーと下部のスライダーをクリックしてドラッグすることにより、スライダは（255で下部のスライダーを残します）。画像が完全に白であることを確認してください。
2. 核のみが表示されるまで、緑と赤の上部のスライダーを調整します。
   注：選択した設定が使用される細胞染色に完全に変化します。 図2Cを参照してください。
3. TCプラグインでは、関連する構成の設定」のRGBしきい値」テキストボックスに入力されたRGBトップスライダーの値を。 「追加/変更」ボタンをクリックし、設定を上書きします。
   1. 1でサイズレンジ下限と上限の値のままにしておきます - インフィニティ。
4. コンフィギュレーション設定]パネル内では、ハードドライブに設定を書き込むために[保存]をクリックします。

10カウント画像とキャリブレーション

1. TCプラグイン（8.2）を開き、「フォルダをカウント」をクリックし、ディレクトリを選択してダイアログボックスを観察します。 Aをカウントするフォルダを選択それが終了するのND待ちます。
2. 各カウント・サンプルが自動的にメインテーブルに追加されます。キー列は「カウント」、「品質」、および「キャリブレーション？」です。
   注：未校正さCountは列 'エリアの範囲」に表示された領域内膜当たりの粒子数です。
   注：品質は約-0.8〜1.7の範囲です。 Q≥0.5は許容可能です。
   1. チェックマークを守って「キャリブレーション？」列の画像は、理想的なメトリックに似ていることに基づいて、キャリブレーションのためのフラグが設定されている場合。
      注：品質とキャリブレーションの両方が現在の設定はおそらく不十分であることを示唆しているかもしれません。適切な「カラー閾値化」と「サイズが範囲 'の後に選択されており、キャリブレーションはまだ、元の検査を提案し、イメージが有効な数の最終的な決定要因であるべきでカウントされた場合。
3. キャリブレーションのためのフラグ付き表内のすべてのサンプルを選択します。
   1. トンで右クリック彼はテーブルを選択し再集計> '推奨サイズ」。これは、提案した最小粒子面積で画像を再集計します。
   2. もう一度右クリックして、「プロットの表示」を選択します。粒子領域の周波数散布図を確認します。理想的なイメージは、すなわち 、ベル曲線を長い右尾の正規分布に似たグラフを持つことになります。 図3Bを参照してください。
   3. サンプル、右クリックを選択し、再集計> '手動設定」を選択することで、必要に応じて、より低いサイズ範囲を調整します。手動設定ダイアログを確認します。必要な設定を入力し、新しい設定で画像を再集計するカウント]をクリックします。
4. 、手動でカウントを調整したサンプルを選択し、右の表をクリックし、「カウントを持つ画像を開く」を選択します。プラグインによってカウント各粒子を表す赤いマーカーを有する元の画像を観察します。
   注：再集計> '表示するバイナリイメージを数え「どれだけ私チェックすると便利ですndividual細胞は色のしきい値によって解決されています。
   1. カウントを追加するには、「Ctrlキー」と左クリックを押したままにします。サンプル総数に追加されるカーソル位置にマーカーを確認します。マーカーを削除するには、右の画像をクリックします。プラグインは、カーソルに最も近いマーカーを削除します。
   2. マーカーのグループを削除するには、関心領域（ROI）を選択するためのImageJの中の選択ツールを使用します。 「Ctrlキー」を押しながら、右の画像をクリックして、ROI内のすべてのマーカーが削除されます。 「カウント」列のセル数を確認します。

11.保存/結果を開き、CSVへのエクスポート

1. TCでは、メニューバーに移動し、「ファイル」>「保存結果」をクリックします。結果の保存]ダイアログボックスを確認します。名前と保存先を選択し、[保存]をクリックします。
   1. 「ファイル」を使用してください>メインテーブルに表示されているすべてのデータを含むファイルをロードするための「オープン結果」、includinグラムプロット。
      注：結果ファイルには、画像が保存されるディレクトリを保存し、元の画像が失敗し、関数のカウントを持つ画像を開く」、「オリジナルを開く画像 'とを保存した後に移動している場合。
   2. 、画像ディレクトリをリセットするサンプルを選択するには、右側のテーブルをクリックし、「イメージディレクトリをリセット」を選択します。ディレクトリの選択]ダイアログボックスを確認します。新しいフォルダを選択して、画像が存在する場合、ディレクトリがリセットされます。結果ファイルを再保存します。
2. カンマ区切り（CSV）ファイルを保存するには、メニューバーの「ファイル」>「.csvファイルにエクスポートする」を参照してください。これは、平均数と平均の標準誤差で統計的なグループに編成サンプルを使用してファイルを生成します。そのレイアウトは一般的なグラフ作成プログラムで迅速なグラフ作成のために設計されています。
   注：統計グループはTC内で作成されたグループに基づいています。
   1. サンプルは、一般的な命名テンプレートに従っている場合、サンプルはグラムであることを選択しますouped、右クリックして、「自動グループ化」を選択します。これは、同じグループに同じ「名前」でサンプルを追加します。両方のコントロールが「治療」にグループ「コントロール」および治療に追加されます：1、コントロール - - 2、トリートメント - - 1、処理2例のコントロールを使用しました。
   2. グループ名には、サンプルの「グループ」のセルとタイピングダブルクリックして、グループに手動でサンプルを追加します。このグループに追加するサンプルを選択し、右クリックし、[プロパティ]を選択 'グループに追加]。

結果

細胞濃度の計算

図1は、CCCのキャリブレーションと可算画像取得の全体的なプロセスを提示しています。 図1Aおよび1Bは 、ピクセル単位でP-正方形の長さのP-正方形のキャリブレーション画像や計算を示しています。 CCCは、式を使用して、指定されたボリューム内の細胞濃度を決定しま?...

ディスカッション

重要なステップ、トラブルシューティング、および制限

自動化された計算方法の性質上、粒子解析の特にそれらは、これらの粒子を定義するための数学的能力を必要とします。その結果、細胞濃度の計算および遊走アッセイカウンタの両方の精度が撮影した画像は、細胞試料または遊走アッセイ膜に似ているつまり、どのように密接に、画像の忠実度にすぎなかっ依存して...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 - With L-Glutamine	Fisher Scientific	SH3002702	Cell culturing media
Fetal bovian serum (FBS)	GIBCO BRL	P00015	Media suppliment
HTR8/SVneo trophoblast cell line	Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen’s University, Kingston, Canada)		Software is designed to work with any cell line.
Trypsin	GIBCO BRL	27250-018	Prepared as 0.20% (w/v) in 10uM EDTA  1X PBS
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
10 cm cell culture plates	SARSTEDT	833902	Any tissue culture treated plates will be suitable
Transwell Polyester Membrane Inserts - 8.0µm Pore size	Costar 3422 ordered from Fisher Scientific	7200150	For 24-well plates; Pore size: 8.0µm; 6.5mm diameter; 0.33cm2 growth area
HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 & 3	EMD Millipore and ordered from VWR	65044A, B, & C	Hemacolor stain set consists of three 500mL (16.9oz.) poly bottles & includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3)
Cotton Tipped Applicator	Puritan Medical	806-WC
Single-edge industrial razor blades	VWR	55411 - 055	Thickness: 0.30 mm (0.012")
Microscope Slides - Precleaned/Plain	Fisher Scientific	12550A3	Dimentions: 25 X 75 X 1.0 mm
Fisherbrand Cover Glasses - Rectangles no. 1	Fisher Scientific	12-545E	Thickness: 0.13 to 0.17mm; Size: 50 x 22mm
Fisher Chemical Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500
Leica Stereo dissecting microscope	Leica Microsystems		The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD & camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts:  LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90mm Model: MOB306 & Objective achromat 0.32X, WD=303mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293,
Hemacytometer	Assistant Germany		0.100 mm Depth - 0.0025 mm2
Olympus inverted light microscope	Olympus Corporation	CKX41SF	The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2   2.0 Megapixel CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2
Laminar flow cabinet 1300 Series A2	Thermo Scientific	Model: 1375	Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable
Cell culture incubator	Thermo Scientific	Model: 370	Any cell culture incubator will be suitable - Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 °C
ImageJ	NIH	Version 1.50e	Minimum version required
Java Runtime Environment	Oracle	Version 1.8.0_66	Minimum version required