Automated Quantificação e análise dos procedimentos celular contagem utilizando ImageJ Plugins

Resumo

This paper describes the quantification of hemocytometer and migration/invasion micrographs through two new open-source ImageJ plugins Cell Concentration Calculator and migration assay Counter. Furthermore, it describes image acquisition and calibration protocols as well as discusses in detail the input requirements of the plugins.

Resumo

O Instituto Nacional de ImageJ da Saúde é um poderoso disponível gratuitamente suite de software, processamento de imagem. ImageJ tem algoritmos de análise de partículas completas que podem ser utilizadas eficazmente para contar várias partículas biológicas. Ao contar um grande número de amostras de células, o hemocitómetro apresenta um gargalo em relação ao tempo. Da mesma forma, contando membranas a partir de ensaios de migração / invasão com o contador celular ImageJ plugin, embora precisa, é um trabalho excepcionalmente intensa, subjetiva, e famoso por causar dor no pulso. Para atender a essa necessidade, desenvolvemos dois plugins dentro ImageJ para a única tarefa de hemocitômetro automatizado (ou volume conhecido) e contagem de células migração / invasão. Ambos os encaixes assentam na capacidade de adquirir micrografias de alta qualidade com o mínimo de fundo. Eles são fáceis de usar e otimizado para contagem rápida e análise de grandes tamanhos de amostra com ferramentas de análise de embutidas para ajudar a calibração de contagens. Ao combinar o princípio fundamentals de contador de células com uma análise de algoritmo de contagem e contagem de pós-automatizado, o que aumenta grandemente a facilidade com que os ensaios de migração podem ser processadas sem qualquer perda de precisão.

Introdução

Na contagem de células in vitro é uma técnica básica importante em uma ampla gama de experiências de cultura de tecido. Precisão da determinação do número de células numa cultura é essencial para a reprodutibilidade experimental e ^1,2 normalização. A contagem das células pode ser realizada manualmente utilizando um hemocitómetro, bem como utilizando uma variedade de métodos automatizados, cada um com as suas próprias vantagens e desvantagens ^3,4,5. A maioria dos métodos automatizados para contagem de células pertencer a uma das duas classes, os que utilizam o princípio de Coulter ou citometria de fluxo. contadores Coulter tirar vantagem das células de resistência elétrica para determinar o número e tamanho das células. Eles são rápidos, precisos e mais baratos do que citómetros de fluxo. No entanto, eles raramente são usados apenas para contagem de células devido ao seu custo considerável em comparação com a contagem manual ^3. Fluxo citómetros, por outro lado, são caros, mas eles têm muitas aplicações, tais como a contagem celular, análise da forma de células, rructure e célula de medição interna marcadores de ^4,5. As máquinas que utilizam qualquer um destes dois princípios estão disponíveis de vários fabricantes. Contagem manual é acessível, mas demorado e sujeito a polarização, enquanto os métodos automáticos vêm com uma fracção do tempo requerido para a contagem manual, mas utilizando máquinas caras ^6.

Outros procedimentos de cultura de células são comum em ensaios de motilidade das células in vitro, isto é, a migração celular e invasão ^7. Os ensaios de migração e invasão são comumente utilizados para investigar a mobilidade celular e capacidade invasiva, em resposta a uma resposta quimiotáctica. Além disso, eles são amplamente utilizado para estudar o desenvolvimento embrionário, a diferenciação, a resposta inflamatória, e a metástase de vários tipos de células ^7-11. As células que migraram ou invadem através da membrana porosa de um ensaio de migração pode ser quantificada de duas formas diferentes. Em primeiro lugar, por coloração das células com um corante fluorescente, de dissociação from a membrana, e a quantificação utilizando um leitor fluorescente ^12. Uma limitação deste método de quantificação é que nenhuma ficha pode ser retida de membranas e não há nenhuma possibilidade para análise posterior ^13. O segundo método de quantificação é de migraram / células a serem fixadas e coradas com corante fluorescente ou, mais comumente, com corantes citológicos como cristal violeta, toluidine corante azul ou hematoxilina invadidos; em seguida, as células são quantificados usando manualmente imagens microscópicas invertidos destas membranas que é uma tarefa demorada muito ^12,13.

Para ultrapassar os inconvenientes da contagem manual de células, foram desenvolvidos dois contadores de células automatizado fiáveis ​​e precisos para a concentração de células e para o ensaio de migração. Estes contra algoritmos celulares automatizados foram desenvolvidos para ImageJ como um plug-in utilizando a linguagem de programação Java da Oracle. ImageJ é uma ferramenta de processamento de imagem pública e amplamente utilizado, desenvolvido pelo Instituto Nacional de HeaLTH (NIH) ^14,15; Assim, escrever esses plugins para ImageJ facilita a fácil integração com a comunidade biológica.

Automatização de contagem de células garante alto rendimento e reprodutibilidade em relação à contagem manual. Embora outro software disponível e encaixes podem ser utilizados para calcular a concentração de células por meio de análise de imagem ^5,16,17, celular Concentração de encaixe calculadora é rápido e pode também lidar com diluições de células e tratamentos. Além disso, todos os resultados e cálculos destes dois contadores podem ser salvos e exportados. Os dois encaixes descritos no presente documento são optimizados para o uso de um microscópio de contraste de fase para imagens de células vivas e grande campo de visão (toda a captura de membrana) de imagiologia para membranas ensaio de migração através do uso de um escopo de dissecação. Os plugins estão disponíveis gratuitamente para download com instruções de instalação a partir de: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

Protocolo

1. Composto Microscópio e Configurar (Calculadora Concentração celular)

1. Aumentar o brilho da lâmpada ao pleno com o botão de ajuste de luz, mudar para a lente objetiva de 4X e garantir filtros de contraste de fase são selecionadas.
   NOTA: Qualquer microscópio de contraste de fase invertida para cultura de tecidos com um fundo escuro, por exemplo, contraste de fase PHP, pode ser usado de acordo com procedimentos de microscópio e câmera padrão.
2. Dentro de software do microscópio, definir configurações de captura de imagem para os valores padrão.
   NOTA: Consulte o manual do usuário do microscópio para encontrar a localização dessas configurações.
   1. Definir 'brilho', 'contraste', e 'saturação' a ​​100% e 'gamma' e 'ganho' para 1.0.
      NOTA: Dependendo do software, "brilho" e "contraste" pode padrão para um valor de 0% em vez de 100%.
   2. Definir imagens sejam capturadas em preto e branco usando o availabl mais alta resoluçãoe (1.600 x 1.200 pixels (px) ou mais).
      NOTA: A 'saturação' de 0% é suficiente se um cenário preto e branco não está disponível.
3. Coloque um hemocitómetro padrão sobre a platina do microscópio e capturar uma imagem conforme representado na (Figura 1A); esta é a "imagem de Calibração Volume '. Ajustar o tempo de exposição, conforme necessário.

Calibração Volume 2. Imagem

1. Abrir ImageJ e, no menu Plugins, iniciar a Calculadora celular Concentração (CCC) plugin, por exemplo, Plugins> Analisador> 'Calculadora celular Concentração'.
   1. Se o painel do lado direito 'imagem de volume de calibração' não estiver visível, clique em 'Calibrar' para mostrá-lo.
2. No ImageJ, abra a "imagem Volume Calibration 'a partir do passo 1.3 (' Arquivo '>' Abrir ') e CCC, clique no botão" Obter Imagem Dimensão ".
   NOTA: Este irá preencher tanto Largura da imagem ecaixas de texto altura, com a resolução da imagem em pixels automaticamente.
3. No ImageJ, selecione a 'Ferramenta Linha Reta "ao lado de ferramentas de seleção e desenhar uma linha reta ao longo de todo o comprimento do hemocitômetro primário (P) quadr demonstrado em (Figura 1B), clicando e arrastando o cursor.
   1. Pressione a tecla 'M' para exibir a janela de resultados contendo as medições de linha reta. Digite o valor da coluna Comprimento na caixa de texto 'P-Quadrado De Corpo' em CCC (Figura 1B).
   2. Clique no botão 'calcular o volume de imagens "para a saída do volume de imagem na caixa de texto imagem de volume. Como alternativa, se o volume da imagem já é conhecido, digite o volume em NL na caixa de texto imagem de volume.
4. Clique no botão "Salvar".
   NOTA: O plugin está calibrado.

Calibração de Exposição 3. Câmara

1. Na sequência de colheita de células paracontando via hemocitômetro, carga de 10 ml de células em uma câmara do hemocitômetro e colocá-lo para o palco microscópio.
2. Usando as mesmas configurações da etapa 1.2, ajustar o tempo de exposição de modo que as linhas de fundo do hemocitómetro desaparecer.
   1. Ajustar o foco de modo que o interior das células é mais escura do que a membrana celular, indicando o foco dentro da secção transversal central da célula e não os pólos.
   2. Além disso ajustar a exposição de modo que as células não são sobrexposta e assemelham-se aos representados na (Figura 1C).
      NOTA: As linhas hemocit�etro ligeiramente visíveis são aceitáveis. Recomenda-se para salvar ou gravar essas configurações para manter a precisão e reprodutibilidade.

4. Aquisição de Imagem

1. Para cada amostra de células, carga de 10 mL em ambas as câmaras do hemocitômetro para aumentar o poder inferência estatística ^2. Coloque a hemocitómetro na platina do microscópiopara imagiologia.
   Nota: A resolução e ampliação de cada imagem deve ser a mesma que a "imagem de Calibração Volume '. O plugin conta todas as imagens de qualquer pasta selecionada; manter as imagens a serem contados em conjunto na mesma pasta.
   1. Se uma função de nome de arquivo de incremento automático está disponível, ligá-lo e certificar-se de cada imagem não é mostrada após a captura para aumentar o rendimento.
      NOTA: salvar manualmente e fechar cada imagem irá diminuir dramaticamente o processo. Consulte o manual do usuário do microscópio para obter informações sobre a disponibilidade de uma função de auto-incremento.
   2. Capturar pelo menos três imagens não sobrepostas da região central do hemocitômetro embora mais (5-10) é recomendada para aumentar a precisão.
      NOTA: a evitar tanto áreas superior e inferior das câmaras, como as células tendem a aumentar em densidade em ambos os locais. Tome o mesmo número de imagens para cada câmara. Isto é necessário para o funcionamento adequado do encaixe durante a contagem.

5. Contagem imagem e diluições

1. No CCC, clique em "contagem de células 'e observe a caixa de diálogo Escolher Directory. Selecione uma pasta para ser contado.
2. Observe a caixa de entrada o número da amostra depois de selecionar uma pasta. Digite o número de imagens captadas por câmaras, ou seja, 4.1.2 e clique em 'Ok'. O plug-in agora contar todas as jpg, tiff, e imagens PNG na pasta selecionada em ordem alfabética.
   NOTA: Ao clicar no botão 'Visualizador Sample' abrirá a janela do Visualizador de exemplo exibindo informações sobre as amostras contadas. concentração da amostra é a concentração média de todas as imagens captadas por câmaras. As amostras com concentrações sem unidade pode ser adicionado a esta lista, tal como a adição de uma droga ou um pequeno tratamento molécula.
   1. Contar as amostras de células se as concentrações variam significativamente dentro contagens das mesmas amostras (Seção 4).
      NOTA: Para calcular diluições para todo tele contou-amostras, CCC utiliza automaticamente a fórmula C ₁ V ₁ = C ₂ V _2.
3. Utilizar o cenário de semeadura de 15.000 células por 200 uL em 30 cavidades de uma placa de 96 poços + 1 adicional:
   1. Defina a caixa de texto à direita do rótulo C2 a 15.000 eo volume caixa de texto concentração para 200, a alteração da unidade de caixa de combinação ao lado 'ul'.
      NOTA: O plugin acabará por calcular a concentração em células / mL.
   2. Marca (volume final) se a caixa de combinação o volume tenha V2 selecionado e na caixa de texto à direita entra 6200 (200 mL x (30 + 1)), seleccionando 'ul' na caixa de combinação da unidade de volume.
4. Clique em "Calcular Diluição 'para adicionar a diluição entrou atualmente para a caixa de listagem inferior esquerdo.
   NOTA: Para cada diluição acrescentou, será resolvido para cada amostra e exibido no diagrama de árvore para a direita. Dê um duplo clique em cada entrada para expandir.
5. Clicando tele 'Save' botão abaixo do botão 'Visualizador de Amostra' para escrever para arquivar todos os dados de amostras e diluições.
6. NOTA: Estes dados podem ser recuperados a qualquer momento, clicando em 'Load' e selecionando o arquivo salvo.

6. Migração e Invasão (Contador)

1. Realizar os ensaios de migração e invasão usando o método de câmara de Boyden padrão ^7-9.
2. Depois de células migraram / invadido, remova cuidadosamente os meios de comunicação dentro do inserto, invertendo e gentilmente tocar. Wick fora qualquer excesso de materiais aderida à parte inferior da membrana por tocar a borda de uma toalha de papel.
   NOTA: Não toque na membrana-se à toalha, isso pode desalojar células aderidas.
3. Fix e manchar as células como relatado ^7-9 em uma placa de 24 poços configurado com cada linha contendo ~ 500 mL de uma solução diferente, por exemplo, fixador, uma mancha, mancha 2, e água bidestilada _(ddH2O). Encha uma segunda placa com 1x PBS to colocar as inserções em antes de cortar.
4. Lavam-se as inserções, colocando-os em poços cheios com _ddH2O e encher o inserto com ddH ₂ O. Drenar a água antes de esfregar distância células por inversão.
5. Use um aplicador de algodão limpo para remover as células un-migrou / un-invadiu a partir do topo da membrana tomando cuidado para não danificar a membrana. Ser completo em torno dos bordos da membrana.
6. Corte da membrana utilizando uma lâmina de barbear ou um bisturi e transferir cuidadosamente a membrana (do lado de baixo para cima) sobre uma lâmina de vidro limpa.
7. Adicionar uma pequena gota de solução de montagem por baixo e por cima da membrana e cobrir com uma lamela de cobertura fina.
   NOTA: Evite bolhas de interceptação dentro da solução de montagem para preservar a precisão das contagens.

7. Dissecando Âmbito e da Câmara Configuração

1. Ligue fonte de luz do microscópio e câmera.
   NOTA: Consulte o manual do usuário do microscópio para instruções detalhadas.
2. inteligênciahin de software, defina as configurações de captura a imagem do microscópio para os valores padrão.
   NOTA: Se uma função de média Existe, um valor de quatro é recomendado. Este é um bom compromisso entre o grau de compensação e de aquisição de imagem tempo. Da mesma forma, um pequeno grau de afiamento pode aumentar a fidelidade da imagem.
   1. Definir 'brilho', 'contraste', e 'saturação' a ​​100% e 'gamma' e 'ganho' para 1.0.
      NOTA: Dependendo do software, "brilho" e "contraste" pode padrão para um valor de 0% em vez de 100%.
   2. exibição definido (em tempo real) e resolução de captura para suas configurações máximas (1.600 x 1.200 px e 2.592 x 1.944 px, respectivamente).
      NOTA: Resolução do display pode ser ajustada conforme necessário, se a taxa de atualização é muito lento. resoluções mais baixas irá torná-lo mais difícil focar com precisão, mas aumentar a taxa de atualização.
3. Para a fase do escopo de dissecação, usar um sólido branco background; um fundo preto ou de vidro é insuficiente.
4. Use a fonte de luz do palco antes, de preferência a partir de duas luzes LED flexível à direita e à esquerda do palco.
   NOTA: A infra-stage fonte de luz vai iluminar os poros na membrana ensaio de migração que pode influenciar negativamente a precisão das contagens posteriores.
5. Coloque uma lâmina de membrana ensaio de migração concluída no palco. Olhando para a imagem em tempo real exibida pelo software, ajustar a ampliação com o botão de ajuste de zoom para que as bordas de uma única membrana são apenas dentro do campo de visão da câmera.
   NOTA: Colocar o slide em uma placa de vidro overtop o branco estágio fundo faz com que seja mais fácil de manobrar o slide para a imagem latente.
6. Ajustar as posições de luz de origem (7.6.1) e tempos de exposição para reproduzir o mais próximo possível a imagem ideal representado na Figura 2A. Dependendo do brilho, tempos de exposição de 5-60 ms deve ser suficiente.
   NOTA:O objectivo é o de produzir uma imagem com tão pouco quanto possível a cor do fundo e uma membrana iluminada uniformemente, sem reduzir a fidelidade da imagem, isto é, sobre-exposição que conduz a uma perda de células visíveis.
   1. Posicionar as fontes de luz esquerdo e direito a um baixo ângulo em relação ao slide. Isto ajudará a remover a mancha de fundo e as aberrações cromáticas. Tente manter cada fonte de luz em frente ao outro.
      NOTA: Durante a manobra de cada fonte de luz para a posição, a outra fora. Isto ajuda a centrar a área de iluminação para a membrana se mais facilmente e com precisão.
7. Remover o slide e balanço de branco a imagem usando um único clique de botão no software microscópio.
   NOTA: O microscópio está calibrado. Salvar tantas configurações possíveis para uso futuro e tomar nota das posições fonte de luz e intensidade.

8. Aquisição de Imagem e Flatfield

1. Dentro do software, definidoa localização da pasta de captura e captura de uma imagem por membrana. Nomear as imagens seguindo o modelo geral: Nome - ###, por exemplo, Control - 001.tif, Control - 002.tif, droga Test - 001.tif, e assim por diante.
   NOTA: Para obter os melhores resultados de imagem, salvar o tipo de arquivo de imagem como tiff em relação a outros formatos com perdas, como jpeg.
   NOTA: As imagens não segue o modelo geral, ainda será contada, mas não estará sujeita a agrupamento automatizado e Fielding plana.
   1. Se a correção Flatfield é desejado, para cada slide encontrar uma área vazia e dar uma imagem em branco, seguindo a convenção de nomenclatura: Nome - em branco.
      NOTA: Um espaço em branco é uma área no slide que contém nenhuma membrana e representa a iluminação de fundo.
   2. Imediatamente antes de imagem, alise cada membrana, aplicando pressão sobre a lamela e remover o maior número de bolhas de ar possível.
2. No ImageJ, vá para Plugins e abra o plug-in TC; por exemplo, Plugins> Analisar> & #39; Transwell Contador '.
3. Dentro TC, clique no botão 'Flatfield' e observe a caixa de diálogo Escolher Directory. Selecione a pasta onde as imagens de membrana foram salvos.
   NOTA: Apenas as imagens guardadas com o modelo geral acima serão automaticamente Flatfield corrigida e guardada em uma nova pasta chamada Flatfield dentro da pasta escolhida. Ver Figura 2B para um exemplo de uma imagem Flatfield corrigido.

9. Definições de configuração

1. Abrir a imagem da membrana um ensaio de migração no ImageJ ( 'Arquivo'> 'Abrir') e selecione Image> Adjust> 'Limite de Cor ...'. Observe a janela Limiar de cores para ajustar as cores que serão filtrados da imagem.
   1. Na parte inferior da janela, defina o método Limiarização para 'Shanbhag', cor Limiar para 'White', e no espaço de cores para 'RGB' (vermelho verde azul); Fundo escuro desmarque se selecionado.
   2. Ajuste o toposliders, clicando e arrastando os marcadores a 0 e os controles deslizantes inferiores a 255 (deixar os controles deslizantes de fundo a 255). Certifique-se de que a imagem é totalmente branco.
2. Ajuste os controles deslizantes superiores verdes e vermelhas até que apenas os núcleos são visíveis.
   NOTA: As definições seleccionadas irão variar inteiramente sobre a mancha celular usado. Veja a Figura 2C.
3. No plug-in TC, introduzir os valores dos principais controles deslizantes RGB em "RGB limiar" caixas de texto As definições de configuração associados. Clique no botão "Adicionar / Modificar" e substituir a configuração.
   1. Deixe os valores Gama Inferior e Superior Tamanho a 1 - Infinito.
4. Dentro do painel de definições de configuração, clique em "Salvar" para gravar as configurações para o disco rígido.

10. Contando Imagens e Calibração

1. Abra o plugin TC (8.2) e clique em "Contar Pasta 'e observe a caixa de diálogo Escolher Directory. Selecione a pasta a ser contado and esperar que ela termine.
2. Cada amostra contada é automaticamente adicionada à tabela principal. colunas de chave são 'Count', 'Qualidade' e 'Calibrar?'.
   NOTA: O Conde calibrado-un é o número de partículas por membrana dentro da área exibida na coluna 'gama Area'.
   Nota: A qualidade varia de aproximadamente -0,8 para 1,7; Q ≥ 0,5 é aceitável.
   1. Observar uma marca na 'Calibrar? coluna se uma imagem é apanhado em calibração com base na sua semelhança com as métricas ideais.
      NOTA: qualidade e calibração pode sugerir que as configurações atuais são possivelmente insuficiente. Se depois de adequada 'Color Limiarização' e 'Tamanho Ranges' foram selecionados e calibração ainda é sugerido, inspeção do original e contou imagens deve ser o determinante final de uma contagem válida.
3. Selecione todas as amostras na Tabela Marcado para a calibração.
   1. Botão direito do mouse em tEle tabela e selecione Recount> 'Tamanho sugerido'. Isto irá recontar as imagens com uma área de partícula mínimo sugerido.
   2. Botão direito do mouse novamente e selecione 'Show Plot'. Observe o gráfico de dispersão frequência das áreas de partículas. Uma imagem ideal terá um gráfico semelhante a uma distribuição de longo direito de cauda normal, ou seja, a curva do sino. Ver a Figura 3B.
   3. Ajuste o intervalo de tamanho menor, se necessário, selecionando a amostra, botão direito do mouse e selecionando Recount> 'Configurações Manual ". Observe a janela de configuração manual. Digite as configurações desejadas e clique em Contar para contar a imagem com as novas configurações.
4. Para ajustar a contagem manualmente, selecione as amostras, o botão direito na tabela e selecione "Abrir imagem com contagens". Observe a imagem original com os marcadores vermelhos que representam cada partícula contados pelo plugin.
   NOTA: Recount> 'Show contou imagem binária "pode ​​ser útil para verificar o quão bem eucélulas ndividual estão sendo resolvidos pelo limiar de cor.
   1. Para adicionar uma contagem, segure "Ctrl" e clique esquerdo. Observar um marcador na localização do cursor que será adicionada às amostras de contagem total. Para remover um marcador, clique direito da imagem. O plugin irá remover o marcador mais próximo do cursor.
   2. Para remover um grupo de marcadores, use uma ferramenta de seleção em ImageJ para selecionar uma região de interesse (ROI). Enquanto segura 'Ctrl', clique direito na imagem e todos os marcadores dentro do ROI serão removidos. Observe o número de células na coluna 'Count'.

11. Saving / Abertura Resultados e exportar para CSV

1. Na TC, vá para a barra de menu e clique em "Arquivo"> ​​"Salvar resultados '. Observe a caixa de diálogo Resultados Save. Escolha um nome e destino e clique em "Salvar".
   1. Use 'Arquivo'> 'Abrir resultados' para carregar um arquivo contendo todos os dados exibidos na tabela principal, incluindg o enredo.
      NOTA: O arquivo de resultados salva os diretórios as imagens são guardadas em Se as imagens originais são movidos depois de salvar, a "imagem original Open 'e' Abrir imagem com contagens de" funções falhará..
   2. Para repor o diretório de imagem, selecione as amostras, clique direito na tabela e selecione 'Reset diretório de imagens'. Observe a caixa de diálogo Escolher Directory. Selecione a nova pasta e caso se verifiquem as imagens, os diretórios serão repostas. Re-salvar o arquivo de resultados.
2. Para salvar um arquivo Comma Separated Values ​​(CSV), na barra de menu ir para 'Arquivo'> 'Exportar para .csv'. Isso produz um arquivo com amostras organizados em grupos de estatística com a contagem média e erro padrão da média; seu layout foi concebido para a representação gráfica rápida em programas de gráficos comuns.
   NOTA: Os grupos de estatística baseiam-se nos grupos criados dentro do TC.
   1. Se as amostras seguir o modelo geral de nomenclatura, selecione as amostras a ser grouped, clique direito e selecione "agrupamento Auto '. Isto adiciona amostras com o mesmo "Nome" para o mesmo grupo. Usando o exemplo de Controle - 1, Control - 2, Tratamento - 1, Tratamento - 2: ambos os controles seria adicionado ao grupo 'Control' e tratamentos para 'tratamento'.
   2. Adicionar amostras manualmente para grupos com um duplo clique celular e tipagem da amostra 'Grupo' em nome do grupo. Selecione as amostras a serem adicionados a este grupo, clique direito e selecione "Adicionar ao grupo '.

Resultados

Calculadora celular Concentração

A Figura 1 apresenta o processo global de calibração CCC e aquisição de imagem contáveis. Figura 1A e 1B mostram a imagem de calibração P-quadrado e cálculo do comprimento P-quadrado em pixels. CCC determina a concentração de células num dado volume utilizando a fórmula:

Discussão

As etapas críticas, solução de problemas e limitações

A própria natureza de métodos computacionais automatizados, especificamente aqueles de análise de partículas, requer a habilidade matemática para definir essas partículas. Consequentemente, a precisão de ambos Calculator celular Concentração e contra ensaio de migração é majoritariamente dependente de fidelidade de imagem, ou seja, o quanto a imagem capturada se assemelha a membrana amostra celular ou ensaio de migração. P...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 - With L-Glutamine	Fisher Scientific	SH3002702	Cell culturing media
Fetal bovian serum (FBS)	GIBCO BRL	P00015	Media suppliment
HTR8/SVneo trophoblast cell line	Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen’s University, Kingston, Canada)		Software is designed to work with any cell line.
Trypsin	GIBCO BRL	27250-018	Prepared as 0.20% (w/v) in 10 µM EDTA 1x PBS
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
10 cm cell culture plates	SARSTEDT	833902	Any tissue culture treated plates will be suitable
Transwell Polyester Membrane Inserts - 8.0 µm Pore size	Costar 3422 ordered from Fisher Scientific	7200150	For 24-well plates; Pore size: 8.0 µm; 6.5 mm diameter; 0.33 cm2 growth area
HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 & 3	EMD Millipore and ordered from VWR	65044A, B, & C	Hemacolor stain set consists of three 500 ml (16.9 oz.) poly bottles & includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3)
Cotton Tipped Applicator	Puritan Medical	806-WC
Single-edge industrial razor blades	VWR	55411 - 055	Thickness: 0.30 mm (0.012")
Microscope Slides - Precleaned/Plain	Fisher Scientific	12550A3	Dimentions: 25 mm x 75 mm x 1.0 mm
Fisherbrand Cover Glasses - Rectangles no. 1	Fisher Scientific	12-545E	Thickness: 0.13 to 0.17 mm; Size: 50 mm x 22 mm
Fisher Chemical Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500
Leica Stereo dissecting microscope	Leica Microsystems		The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD & camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts:  LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90 mm Model: MOB306 & Objective achromat 0.32X, WD=303 mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293
Hemacytometer	Assistant Germany		0.100 mm Depth - 0.0025 mm2
Olympus inverted light microscope	Olympus Corporation	CKX41SF	The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2
Laminar flow cabinet 1300 Series A2	Thermo Scientific	Model: 1375	Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable
Cell culture incubator	Thermo Scientific	Model: 370	Any cell culture incubator will be suitable - Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 °C
ImageJ	NIH	Version 1.50e	Minimum version required
Java Runtime Environment	Oracle	Version 1.8.0_66	Minimum version required