Desarrollo de un protocolo de refinado para Trans-escleral transplante Subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano humano a ojos de rata

Resumen

Inyección subretinal se ha aplicado extensamente en estudios preclínicos de terapia de reemplazo de la célula de vástago para la degeneración macular relacionada con la edad. En este artículo visualizado, describimos una técnica de inyección subretinal menos riesgoso, reproducible y exacto modificado vía trans-escleral para entregar las células en los ojos de rata.

Resumen

Enfermedades degenerativas retinianas como la degeneración macular senil (DMS) son la principal causa de pérdida de visión irreversible en todo el mundo. AMD se caracteriza por la degeneración del pigmento retiniano epitelial (RPE) las células, que son una monocapa de células apoyar funcionalmente y anatómicamente envolver alrededor de la retina neural. Tratamientos farmacológicos actuales para la no-neovascular AMD (AMD seco) sólo retrasar la progresión de la enfermedad pero no pueden restaurar la visión, que requiere estudios dirigidos a identificar nuevas estrategias terapéuticas. Reemplazar las células RPE degenerativas con las células sanas tiene promesa para el tratamiento de AMD seco en el futuro. Extensos estudios preclínicos de terapias de reemplazo de la célula de vástago para AMD implican el trasplante de las células RPE derivadas de células madre en el espacio subretinal de modelos animales, en la que se aplica la técnica de inyección subretinal. El enfoque más utilizado en estos estudios preclínicos con animales es a través de la ruta trans-escleral, que es hecha difícil por la falta de visualización directa de la extremo de la aguja y a menudo puede resultar en daño retiniano. Un enfoque alternativo a través del vítreo permite la observación directa de la posición del extremo de la aguja, pero lleva un alto riesgo de traumas quirúrgicos como son disturbados más tejidos del ojo. Hemos desarrollado un método de inyección trans-escleral modificada menos arriesgado y reproducibles que utiliza aguja definidos ángulos y profundidades con éxito y siempre entregar las células RPE en el espacio subretinal de rata y evitar excesivo daño retiniano. Las células entregadas de esta manera se han demostrado previamente ser eficaz en la rata del Royal College of Surgeons (RCS) por al menos 2 meses. Esta técnica puede utilizarse no sólo para la célula, sino también para la entrega de pequeñas moléculas o terapias genéticas.

Introducción

La retina humana situada en la parte posterior de las funciones del ojo como un tejido sensorial ligero y juega un papel fundamental en la percepción de la visión. Disfunción de las células retinianas o muerte de la célula por lo tanto causa problemas de visión o ceguera permanente. Enfermedades que implican degeneración o disfunción de las células en distintas capas de la retina se conocen como enfermedades retinianas degenerativas, entre las que AMD es el tipo más común y la principal causa de ceguera irreversible en los ancianos en los países desarrollados ^1,2. El proceso patológico de AMD está asociado con la acumulación de "drusen" entre la capa del EPR y membrana de Bruch subyacente, lo que deteriora a su vez apoyo RPE de la fisiología del fotorreceptor, llevando a la atrofia de retina neural y de pérdida de visión^{3, 4,5}. Hasta el momento, no existe cura para secar (no-neovascular) AMD. La aparición de la terapia de la célula de vástago como un nuevo paradigma en medicina regenerativa trae la esperanza de reemplazar las células RPE disfuncionales o muertas con células madre derivadas de células sanas. De hecho, estudios preclínicos de trasplante células (p. ej., células madre embrionarias) madre-derivado las células RPE en modelos animales RPE-degenerativas han sido realizados^6,7, algunas de las cuales han progresado a ensayos clínicos^8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). Recientemente, una fuente alternativa de células madre residentes en la capa de EPR humana, las células RPE humanas (hRPESCs), fue identificada por nuestro laboratorio y en la actualidad se está utilizando en estudios preclínicos de terapia de trasplante de células (hRPESC-RPE) de RPE derivadas de hRPESC para AMD ^{10 , 11 , 12 , 13}.

La técnica de inyección subretinal es aplicada en los estudios preclínicos mencionados por varios grupos, incluyendo nuestro grupo. Hay dos enfoques generales para la inyección subretinal en animales: trans-vitreal y trans-escleral. El enfoque trans-vitreal tiene la ventaja del cirujano pudiendo observar directamente el extremo de la aguja penetra el ojo anterior, cruza la cavidad vitreal todo junto a la lente y penetra en la retina en la parte posterior del ojo para llegar a la subretinal espacio^14,15,16. Sin embargo, requiere interrumpir la retina en dos ubicaciones (anteriores y posteriores), conlleva el riesgo de dañar la lente y puede resultar en reflujo de células en el vítreo cuando la aguja se retrae. En contraste, el enfoque trans-esclerótica, en principio, evita la participación de la retina y vítreo y reflujo sale del ojo. En roedores pigmentados, el cirujano puede observar inicialmente penetración de la esclerótica, pero después paso a la coroides pigmentada, el extremo de la aguja ya no es visible. Sin observación directa, rompiendo la retina es común y puede producir disección retiniana y entrega de las células o sangre en el vítreo. Por otra parte, porque se curva la superficie del ojo, es muy difícil saber que aguja ángulos y profundidades son más eficaces para las inyecciones de trans-escleral.

En este artículo visualizado, presentamos un método de inyección subretinal trans-escleral por el uso de las evaluaciones post-quirúrgicos con tomografía de coherencia óptica (OCT), que permite un examen detallado del sitio de inyección. Nuestra técnica de inyección trans-escleral utiliza ubicaciones definidas, ángulos y profundidades de agujas de inyección producir trauma quirúrgico muy bajo y alta confiabilidad. Aquí, demostramos específicamente la inyección de las células de RPE hRPESC en el espacio subretinal de la rata RCS, un modelo preclínico de AMD humana. Con este método de inyección, con éxito y siempre entregamos las células RPE hRPESC en el espacio subretinal de ojos de ratas RCS con una tasa de éxito muy alta. Inyección de células fue encontrada para resultar en la preservación de los fotorreceptores RCS por lo menos 2 meses después de la inyección¹³. Este procedimiento se realiza con el microscopio de disección y es fácil de aprender. Se requieren dos personas (un cirujano y un ayudante) para realizar la inyección y el tiempo promedio de inyección para cada animal es menos de 5 minutos. Los ángulos definidos y profundidad para agujas de inyección hace posible para los laboratorios, donde el OCT está disponible, para lograr éxito inyección subretinal. Permite acceso subretinal altamente reproducible y puede ser utilizado no sólo para la célula, sino también de drogas entrega y gene terapias.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran animales han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) en la Universidad del estado de Nueva York en Albany.

1. preparación de la inyección de

1. Preparación de una suspensión de células RPE hRPESC
   Nota: Los siguientes pasos se realizan en campana de cultivo estériles para tejidos y familiaridad con técnica estéril básica se requiere.
   1. Aislar células hRPE primaria de donante humano ojos de 50-90 años y células en cultivo en placas de 24 pocillos¹². Criopreservar las células en el paso 1, deshielo según sea necesario y la cultura del paso 2 (P2) las células para 4-5 semanas (figura 1A) para inyección.
   2. Retire el medio de cultivo¹² y suavemente pozos enjuague dos veces con 500 μl pre calentado 1 X fosfato tampón salino de Dulbecco sin calcio y magnesio (1 x DPBS-CMF) añadiendo 1 X DPBS-CMF en pozos con una pipeta de 1000 μl y sacándola con un vacío.
   3. Añadir 300 μL de tripsina/DNasa a cada pocillo. Incube las células RPE hRPESC en tripsina/DNasa (4 kU DNasa por 1 mL de tripsina-EDTA 0,25%) durante 4 minutos a 37 ° C para disociar las células.
   4. Compruebe las células bajo el microscopio para ver si han redondeado para arriba. Seguir a incubar las células en tripsina/DNasa por un adicional 2 min si no han detenido a todavía.
   5. Una vez que las células se redondean hacia arriba, utilice una pipeta de 1000 μl triturate las células separadas del pozo y transferir la tripsina/DNasa que contiene las células separadas en un tubo cónico de 15 mL con un volumen igual de medio de cultivo precalentada, para inactivar la tripsina/DNasa.
   6. Enjuague pozos con 1 con DPBS X-CMF transfiriendo suavemente hacia arriba y hacia abajo, especialmente alrededor de los bordes del pozo; luego añadir estas células al anterior tubo cónico.
   7. Centrifugar el tubo cónico a 286 x g durante 5 min a 4 ° C para que sedimenten las células.
   8. Quite el sobrenadante y resuspender las células con 1 mL medio de cultivo.
   9. Contar las células usando un hemocitómetro.
   10. Centrifugue a 286 x g durante 5 min a 4 ° C para que sedimenten las células.
   11. Quite el sobrenadante y resuspender las células en estéril equilibrio sal solución (BSS) en 50.000 células/μl (para entregar 50.000 células en el 1 volumen de μl durante la inyección subretinal).
   12. Transferir la suspensión de células final (CS) en un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL y en una mezcla de hielo y agua hasta el uso de la inyección.
2. Preparación del inyector del celular
   1. Inserte una aguja biselada calibre 33 estéril en la jeringa de inyección y atorníllela firmemente a montar el inyector.
   2. Limpie el inyector con etanol al 100% 5 - 6 veces.
   3. Limpie el inyector con etanol al 70% 5 - 6 veces.
   4. Limpie el inyector con BSS 5 - 6 veces.
   5. Marca la aguja del inyector con un rotulador negro estéril en una posición de 600 μm de la punta de la aguja con el microscopio de disección (figura 1B).
   6. Coloque el inyector en un micromanipulador para inyección.

2. subretinal inyección

1. Área quirúrgica y preparación de animales
   1. Pesan una rata RCS de 4-5 semana de edad (60-100 g) y anestesiar mediante el sistema de suministro de vapor de isoflurano.
      Nota: Para inducir anestesia mantener la tasa de flujo de isoflurano en un 5%. Confirmar la profundidad de la anestesia con las patas y luego reducir el caudal a 2-3% para el mantenimiento de la anestesia durante la cirugía.
   2. Colocar un paño estéril de cirugía, con una almohada debajo, en la etapa del microscopio de disección para configurar una zona quirúrgica estéril.
   3. La rata de transferencia al área quirúrgico y la rata en un cono de nariz, conectado al sistema para mantener la anestesia isoflurano.
   4. Cubrir el cuerpo de la rata con una gasa. Pellizque el dedo de rata para confirmar la anestesia completa.
2. Trans-escleral inyección subretinal bajo el microscopio
   1. Aplique una gota de lubricante ocular en ojos no operados la rata.
   2. Posición de la rata en su lado derecho con su ojo izquierdo hacia el techo para la inyección, su cabeza hacia la derecha del cirujano y su espalda hacia el cirujano.
   3. Recorte cualquier bigotes que cubren el ojo con unas tijeras pequeñas.
   4. Gotear una pequeña cantidad de lavado de ojos desde el lado temporal del ojo izquierdo y recoger el exceso en el lado nasal con un aplicador de algodón para limpiar el ojo.
   5. Dilatar a la pupila con fenilefrina de tropicamida y 2.5% de 1% (recién hecha de fenilefrina 10% diluyendo en solución salina 0.9% estéril en el día de la cirugía) para un examen de OCT después de la inyección mediante la aplicación de una gota de cada uno.
   6. Tire suavemente de la piel que rodea el ojo 4 - 6 veces para abrir el párpado para que el ojo es ligeramente proptosed para facilitar el acceso a las regiones posteriores al limbus.
   7. Aplique una gota de la colada del ojo y mantener el ojo húmedo.
   8. Suavemente triturate CS (preparado en el paso 1.1.12) y carga el inyector con 1,2 μl CS. El extra 0,2 μl se utiliza para compensar la expulsión de inyección.
      Nota: Basado en nuestras mediciones, sobre 5.000-8.000 células se pierden en el reflujo con una inyección de 50.000 células/μl que equivale a cerca de 10-16% de pérdida de la célula y un extra de 0,2 μl CS se inyectó para compensar esta pérdida de la célula.
   9. Colocar el inyector llenado de CS en un micromanipulador (o asistente sotenga lo) verticalmente como RPE células tienden a hundirse fácilmente en suspensión.
   10. Aplique una gota de 0.5% proparacaine (anestésico tópico local) en el ojo y retirar el exceso con un aplicador de algodón.
       Nota: Este paso debe suprimir el reflejo corneal y evitar que el ojo parpadea durante los pasos posteriores.
   11. Use pinzas y agarre la conjuntiva posterior al limbus, gire el ojo por vía nasal, levante la conjuntiva para hacer una "tienda".
   12. Utilice tijeras para cortar la parte superior de la "tienda" para hacer una pequeña abertura en la conjuntiva y exponga la esclera subyacente.
   13. Utilice pinzas para agarrar el borde del margen restante de conjuntiva junto al limbus y gire el ojo por la nariz para que el eje pupilar está en un ángulo de unos 30 grados con respecto a la tapa de tabla (figura 1). Agarre constante del margen de conjuntiva es necesario para proporcionar una fuerza contra durante las inserciones de la aguja y mantener el ojo en un ángulo óptimo.
   14. Para hacer un agujero piloto para la inyección de células, coloque el extremo de una aguja de insulina estéril de calibre 31 biselado en 1.200-1.500 μm posterior al limbo con la abertura de la punta hacia arriba.
   15. Ajuste el ángulo de la aguja de insulina para que sea 10-15 grados por encima de la esclera (tangente a un plano imaginario en el sitio de inyección previsto). Poco a poco penetrar el complejo de la coroides de la esclera hasta una profundidad de aguja de unos 500 μm. En la rata pigmentada, el extremo de la aguja 'desaparecerán' debajo de la coroides pigmentada. Para la marca de la aguja de insulina utilizada aquí, la distancia entre la punta de la aguja y el bisel es 500 μm.
   16. Cuidadosamente retire la aguja de insulina (puede verse un muy pequeño derrame de sangre).
   17. Si se observa sangrado excesivo, una lanza de ojo se puede aplicar para limpiar el agujero, si es necesario. Sangrado persistente después de la aplicación lanza indica un buque puede haber sido dañado.
   18. Guiar la aguja de inyector cargado de células RPE en el orificio piloto, con la abertura hacia abajo y en un ángulo de unos 10-15 grados en relación con la superficie del local de la esclera.
   19. Inserte suavemente la aguja del inyector en el agujero piloto a una profundidad de alrededor de 500 μm al espacio subretinal. Debe existir sobre un margen de 100 μm entre el borde de la marca de lápiz negro y el punto donde la aguja está cubierta por la coroides pigmentada (figura 1C y 1D).
   20. Pregunte el asistente Presione suavemente el émbolo de la jeringa del inyector para inyectar el volumen adecuado de las células (aproximadamente 1,2 μL). Estar dispuestos a proporcionar algunos Counter-force como el ayudante presiona el émbolo.
       Nota: Previa práctica de simulacro con el asistente puede proporcionar el cirujano y el ayudante con la experiencia necesaria con este paso.
   21. Mientras visualmente enfocando la pluma marca de borde, mantenga el inyector en su lugar para 25-30 s y luego retraiga lentamente el inyector. Comúnmente se observa una pequeña cantidad de reflujo.
       Nota: Si se observa no hay reflujo, puede haber una inyección intravítrea. Si ves a contracorriente a través del sello o células de relleno debajo de la esclerótica, la inyección era demasiado poco.
   22. Enjuague la emanación celular desde el sitio de inyección con el lavado de ojo estéril 3 veces y recoger el exceso con un aplicador de algodón.
   23. Aplique una gota de lubricante ocular en el ojo operado y la rata de transferencia a la estación de OCT para examinar la situación de las células trasplantadas y el tamaño de la ampolla subretinal.

3. después de la inyección tratamiento

1. Tratamiento para aliviar el dolor y antiinflamatorios
   1. Inyectar la buprenorfina en 0.1 mg/kg de peso corporal en solución salina por vía subcutánea para disminuir el dolor.
   2. Inyectar dexametasona a 1,6 mg/kg de peso corporal en solución salina por inyección intraperitoneal (I.P.) para el control de la inflamación.
2. Recuperación de animales
   1. Volver a la rata en la jaula de recuperación con una lámpara de calor para mantener la temperatura corporal.
   2. Observar el ojo operado para detectar signos de hemorragia.
   3. Observar la rata para que salga de la anestesia.
   4. Devolver el animal recuperado a una jaula nueva bandera la jaula con una tarjeta de la cirugía y monitorizar diariamente para detectar cualquier signo de peligro, hemorragia ocular o opacities córneos. Notificar inmediatamente al veterinario si hay preocupaciones.

Resultados

Usando la técnica descrita en este artículo, hemos ofrecido constantemente células RPE hRPESC en el espacio subretinal de ratas RCS controlando precisamente la ubicación, ángulo y profundidad de la inserción de la aguja del inyector en el tejido (figura 1B-D ). Inmediatamente siguiente trasplante, un examen de OCT fue realizado para observar el sitio de inyección y la ampolla subretinal creado por las células trasplantadas. Evaluación post quirú...

Discusión

La técnica de inyección subretinal en este artículo es a través de la vía trans-escleral, donde la aguja del inyector penetra en las capas externas (complejo de esclera-coroides-RPE) de la pared del ojo sin dañar la retina neural o molestar a la cavidad vítrea. Un enfoque alternativo trans-vitreal tiene un riesgo potencial de daño de la lente hacia la catarata, ya que el lente de los roedores ocupa la mayor parte de la cavidad vítrea. En comparación con este método, nuestra técnica es menos riesgoso y causa t...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Life Technologies	25200-072
DNAse I	Sigma	DN-25
1xDulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium & Magnesium (1xDPBS-CMF)	Corning Cellgro	431219
Sterile Balanced Salt Solution (BSS)	Alcon	00065079550
Sterile eye wash	Moore Medical	75519
Sterile 0.9% saline	Hospira	488810
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%)	Akorn	17478026312
Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%)	Bausch & Lomb	24208058559
Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) stock	Bausch & Lomb	42702010305	This is used to make 2.5% Phenylepherine
Buprenex	Patterson	433502
Dexamethasone	APP Pharmaceuticals	63323051610
100% Ethanol	Thermo Scientific	615090040
70% Ethanol	Ricca Chemical Company	2546.70-5
Sterile GenTeal Lubricant Eye Gel	Novartis	78042947
Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops	Alcon	00065143105
hRPESC-RPE cells	Not available commercially		Please refer to "Reference #12" for cell isolation and mainteinance.
24-well plates	Corning	3526
Conical tubes (15 ml)	Sarstedt	62554002
Microcentrifuge cap with o-ring	LPS inc	L233126
Capless Microcentrifuge tubes (1.7 ml)	LPS inc	L233041
Centrifuge	Eppendorf	5804R
Sterile alcohol wipe	McKesson	58-204
Sterile cotton tip applicators	McKesson	24-106-2S
Sterile Weck-Cel spears	Beaver-Visitec International	0008680
Sterile surgical drapes	McKesson	25-515
Gauze	McKesson	16-4242
Nanofil syringe (10 ul)	World Precision Instruments	Nanofil
Nanofil beveled 33-gauge needle	World Precision Instruments	NF33BV-2
Insulin syringe needles 31-gauge	Becton Dickinson	328418
Rat toothed forceps	World Precision Instruments	555041FT
Vannas Micro Dissecting Spring Scissors	Roboz	RS-5602
Circulating water T pump	Stryker	TP700
Heating pad	Kent Scientific	TPZ-814
Animal anesthesia system	World Precision Instruments	EZ-7000
Balance	Ohaus	PA1502
Stereo microscope	Zeiss	Stemi 2000
Microscope light source	Schott	ACE series
Bioptigen Envisu Spectral Domain Ophthalmic Imaging System	Bioptigen	R2210
Sterile black marker pen	Viscot Industries	1416S-100
Miniature measuring scale	Ted Pella Inc	13623
Infrared Basking Spot Lamp	EXO-TERRA	PT2144	This is used as a heating lamp for animals during the post-surgical recovery  phase