Разработка изысканный протокола для транс склеры субретинальное трансплантации эпителиальных клеток человека пигмента сетчатки глаза крыс

Резюме

Субретинальное инъекции широко применяется в доклинических исследованиях стволовых клеток заместительной терапии для age-related macular вырождения. В этой статье визуализировать мы описываем техника менее рискованным, воспроизводимые и именно изменение субретинальное инъекции через транс склеры подход к доставить клетки крыс глаза.

Аннотация

Дегенеративные заболевания сетчатки, например возрастной макулярной дегенерации (AMD) являются основной причиной потери необратимых зрения во всем мире. AMD характеризуется дегенерации сетчатки пигментного эпителия (ПЭС) клеток, которые являются монослоя клеток функционально поддержки и анатомически обтекание нейронных сетчатки. Текущий фармакологических препаратов для не неоваскулярной AMD (сухой AMD) только замедлить прогрессирование болезни, но не может восстановить зрение, требующих исследования, направленные на выявление новых терапевтических стратегий. Замена дегенеративных клеток ПЭС с обещанием держит здоровые клетки для лечения сухой AMD в будущем. Обширные доклинические исследования терапии стволовой клетки для AMD включать трансплантация стволовых клеток НПП клеток в пространство субретинальное животных моделей, в которых применяется техника субретинальное инъекции. Подход, наиболее часто используемых в этих преклинических исследований на животных, через транс склеры маршрут, который затрудняется отсутствием прямого визуализации конца иглы и часто может привести к повреждению сетчатки. Альтернативный подход через стекловидное тело позволяет непосредственное наблюдение за конечное положение иглы, но она сопряжена с высоким риском хирургической травмы как обеспокоены больше тканей глаза. Мы разработали менее рискованным и воспроизводимые модифицированных транс склеры инъекции метод, который использует определенные иглы углах и глубинах успешно и последовательно доставить НПП клетки в пространство субретинальное крыс и избежать чрезмерного повреждения сетчатки. Клетки, доставлен таким образом ранее доказали быть эффективным в Королевском колледже хирургов (RCS) крысы по крайней мере 2 месяца. Этот метод может использоваться не только для трансплантации клеток, но и для доставки небольших молекул или генов терапии.

Введение

Сетчатки расположен на задней части глаз функции как легкие сенсорные ткани и человека играет решающую роль в восприятии видение. Сетчатки клетки дисфункции или смерть клетки поэтому вызывает проблемы со зрением или причинения постоянной слепоты. Расстройств, связанных с дегенерацией или дисфункции клеток в разных слоях сетчатки известны как дегенеративные заболевания сетчатки, среди которых AMD является наиболее распространенным типом и ведущей причиной необратимой слепоте в пожилых людей в развитых странах ^1,2. Патологический процесс AMD связан с накоплением «друз» между слоем ПЭС и мембраны Бруха-основной, который в свою очередь ухудшает НПП поддержку фоторецепторных физиологии, ведущих к нейронных атрофии сетчатки и зрение потери^{3, 4,5}. До сих пор, нет никакого лечения для продвинутых сухие AMD (не неоваскулярной). Появление терапия стволовой клетки как новой парадигмы в регенеративной медицине приносит надежду замены неблагополучных или мертвые клетки НПП стволовых клеток здоровые клетки. Действительно, обширные доклинические исследования пересадки стволовых клеток (например, эмбриональных стволовых клеток человека)-производных НПП клетки в ПЭС дегенеративных Животные модели были выполненных^6,7, некоторые из которых достигли Клинические испытания^8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). Недавно альтернативный источник стволовых клеток-резидентов в слое человека ПЭС, стволовые клетки человека ПЭС (hRPESCs), была выявлена нашей лаборатории и в настоящее время используется в доклинических исследованиях hRPESC производные НПП клеток (hRPESC ПЭС) трансплантации терапии для AMD ^{10 , 11 , 12 , 13}.

Субретинальное инъекций техника применяется в доклинических исследованиях, упомянутые выше, несколько групп, в том числе нашей группы. Существует два общих подхода для субретинальное инъекций в животных: Транс vitreal и транс склеры. Транс vitreal подход имеет то преимущество, хирурга, возможность непосредственно наблюдать за конец иглы он проникает передней глаз, пересекает всю vitreal полости, прилегающей к объективу и проникает сетчатки на спине для глаз, чтобы добраться до subretinal пространство^14,,1516. Однако это требует подрыва сетчатки в двух местах (передняя и задняя), несет риск повреждения объектива и может привести к обратным клеток в стекловидное тело при отзыве иглы. В противоположность этому транс склера подход, в принципе, избегает участия сетчатки и стекловидного тела, и обратный поток выходит из глаз. В пигментированных грызунов хирург может первоначально наблюдать проникновения склеры, но после прохождения в пигментированных хориоидея, больше не виден конец иглы. Без прямого наблюдения нарушение сетчатки является общим и может привести к сетчатки диссекции и доставки клеток и/или крови в стекловидное тело. Кроме того потому что изогнутые поверхности глаза, это очень трудно понять, какие иглы углах и глубинах являются наиболее эффективными для транс склеры инъекции.

В этой статье визуализировать мы представляем транс склеры субретинальное инъекционный метод сообщил использования послеоперационные оценки с оптическая когерентная томография (OCT), которая позволяет подробный анализ укола. Наша техника транс склеры инъекции использует определенные места, углов и глубины для инъекций иглами производить очень низкой хирургической травмы и высокой надежностью. Здесь мы конкретно продемонстрировать инъекции клеток hRPESC НПП в пространство субретинальное крыс RCS, доклинические модель человеческих драм. С этим методом инъекций мы успешно и последовательно доставлены hRPESC НПП клетки в субретинальное пространство глаза крыс RCS с очень высокий уровень успеха. Инъекции клеток ранее было установлено, приведет к сохранению RCS фоторецепторов по крайней мере 2 месяца после инъекции¹³. Эта процедура выполняется под микроскопом рассечения и легко учиться. Он требует двух человек (хирурга и ассистента) для выполнения инъекции и среднее время впрыска для каждого животного составляет менее чем за 5 минут. Определенных углах и глубинах для инъекций иглы позволяют для лабораторий, где OCT недоступна, для достижения успешного субретинальное инъекций. Он обеспечивает высокую воспроизводимость субретинальное доступа и может использоваться не только для трансплантации клеток, но и для доставки и генной терапии наркотиков.

протокол

Все процедуры с участием животных были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) на государственного университета Нью-Йорка в Олбани.

1. Предварительный впрыск подготовка

1. Приготовление суспензии клеток hRPESC НПП
   Примечание: Все следующие шаги выполняются в стерильных культуры ткани капот и требуется знакомство с основными стерилизации.
   1. Изолировать клетки первичной hRPE от человека доноров глаза в возрасте 50-90 годы и культуры клеток в 24-ну плиты¹². Криоконсервации клеток на проход 1, оттепель, при необходимости и культуры проход 2 клетки (P2) для 4-5 недель (Рисунок 1A) для инъекций.
   2. Удаление питательной среды¹² и осторожно промыть скважин дважды с 500 мкл предварительно нагревают 1 X Дульбекко фосфат буфер солевой без кальция и магния (1 x DPBS-CMF), добавив 1 X DPBS-CMF в скважины с помощью пипетки 1000 мкл и удаление его с помощью вакуума.
   3. Добавьте 300 мкл трипсина/DNAse каждой скважины. Инкубации клеток hRPESC НПП в трипсина/DNAse (4 ку DNase на 1 мл 0,25% трипсина ЭДТА) 4 мин при 37 ° C, чтобы разбить ячейки.
   4. Проверьте клетки под микроскопом, чтобы увидеть, если они имеют округлые. Далее для инкубации клеток в трипсина/DNase для дополнительных 2 мин, если они не округляются еще.
   5. После того, как клетки округляются, используйте пипетку 1000 мкл нарезанных отдельные клетки из скважины и передачи трипсина/DNase, содержащие отдельные клетки в 15 мл конические с равным объемом подогретым питательной среды, чтобы инактивировать DNase трипсина.
   6. Промыть скважин с подогретым 1 X DPBS-CMF, нежно закупорить вверх и вниз, особенно вокруг краев колодец; Затем добавьте эти клетки предыдущих Конические трубки.
   7. Центрифуга Конические трубки на 286 x g 5 мин при 4 ° C для пеллет клетки.
   8. Удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки с 1 мл питательной среды.
   9. Подсчет количества ячеек с помощью Горяева.
   10. Центрифуга на 286 x g 5 мин при 4 ° C для пеллет клетки.
   11. Удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в стерильных сбалансированный соли раствора (BSS) на 50 000 клеток/мкл (для доставки 50 000 клеток в 1 мкл тома во время субретинальное инъекции).
   12. Перевести окончательный ячейки подвеска (CS) в пробки microcentrifuge 1,7 мл и держать в ледяной воде смеси до использования инъекций.
2. Подготовка клетки инжектор
   1. Вставьте стерильную 33-иглы скошенный в шприц для инъекции и винт плотно, чтобы собрать инжектор.
   2. Очистка инжектора с 100% этанола 5 - 6 раз.
   3. Очистка инжектора с 70% этанол 5 - 6 раз.
   4. Очистка инжектора с BSS 5 - 6 раз.
   5. Марк инжектор иглу с стерильных черный маркер на позиции 600 мкм от кончика иглы под микроскопом рассечения (рис. 1B).
   6. Поместите форсунку на микроманипулятор для инъекций.

2. субретинальное инъекций

1. Хирургический площадь и животных подготовка
   1. Вес 4-5 неделя старый RCS крыса (60-100 g) и анестезировать его с помощью системы доставки паров изофлюрановая.
      Примечание: Чтобы побудить анестезии держать скорость потока изофлюрановая на 5%. Подтвердите, нажав лапы глубины анестезии, а затем уменьшить скорость потока до 2-3% для поддержания анестезии во время операции.
   2. Место стерильным хирургии драпировки, с грелку под, на сцене рассечения Микроскоп, чтобы создать стерильные хирургические области.
   3. Передача крыса в области хирургической и крыса в носовой конус, подключенный к системе изофлюрановая для поддержания анестезии.
   4. Покрывают тело крысы с марлей. Щепотка крыса ног для подтверждения полной анестезии.
2. Транс склеры субретинальное инъекции под микроскопом
   1. Примените капли глаз смазки на крыса unoperated глаз.
   2. Расположите крысы на его правой стороне с его левый глаз, сталкивается с потолка для инъекций, ее голову к правой руки хирурга и его обратно к хирургу.
   3. Обрежьте усы, которые покрывают маленькие ножницы глаз.
   4. Капать небольшое количество мыть глаз с височной стороны левого глаза и собрать излишки в носовой части с хлопка аппликатор для промывания глаз.
   5. Разбавить ученика с 1% Тропикамид и 2,5% фенилэфрина (свежеприготовленные из 10% фенилэфрина путем разбавления в стерильного 0,9% физиологического раствора в день хирургии) для экзамена OCT впрыск путем применения одной капли каждого.
   6. Осторожно потяните кожу вокруг глаз 4 - 6 раз открыть веко, чтобы глаз является слегка proptosed для облегчения доступа к регионам кзади лимба.
   7. Применить капли глаз мыть и держать глаза влажные.
   8. Аккуратно нарезанных CS (подготовленных на шаге 1.1.12) и загрузить инжектор с 1.2 мкл CS. Загородный 0.2 мкл используется для компенсации инъекций обратного потока.
      Примечание: Основываясь на наших измерениях, о 5000-8000 клетки теряются в обратный инъекции 50 000 клеток/мкл, что составляет около 10-16% ячейка потерь и дополнительную 0.2 мкл CS был введен для компенсации этой потери клеток.
   9. Поместите инжектор, заполнены с CS на микроманипулятор (или иметь держать его помощником) вертикально как НПП клетки, как правило, легко утонуть в суспензии.
   10. Применить капли 0,5% proparacaine (местные актуальные анестезии) на глаз и удалите избыток с хлопка аппликатор.
       Примечание: Этот шаг должен подавлять роговицы рефлекс и предотвратить глаз мигает во время последующих шагов.
   11. Используйте щипцы для захвата конъюнктивы кзади лимба, повернуть глаза нос и поднимите конъюнктивы сделать «палатку».
   12. Используйте ножницы, чтобы отрезать в верхней части «палатки» сделать небольшое отверстие в конъюнктиве и разоблачить базовой склеры.
   13. Используйте щипцы для захвата края остальных конъюнктивы поле рядом с лимба и повернуть глаза нос, так что зрачкового оси на угол около 30 градусов по отношению к столешнице (рис. 1 c). Продолжение захвата разницы в конъюнктиве необходима для обеспечения борьбы с силой во время вставки иглы и для поддержания глаз с оптимальным углом.
   14. Чтобы сделать отверстие для инъекции клеток, положение конца иглы стерильные скошенный 31-калибруйте инсулина на 1200-1500 мкм кзади лимба с открытием кончик вверх.
   15. Отрегулируйте угол инсулин иглы, так что это 10-15 градусов выше склеры (касательной к мнимой плоскости в месте предполагаемой инъекции). Медленно проникать склера Хориоидея комплекс иглы глубиной около 500 мкм. В пигментированных крыса конец иглы «исчезнет» под пигментированной сосудистое. Для бренда инсулин иглы, используемые здесь расстояние от кончика иглы для скоса — 500 мкм.
   16. Осторожно снять инсулин иглы (очень небольшой выпот в крови может быть замечен).
   17. Если отмечается чрезмерное кровотечение, копье глаз может применяться очистить отверстие, в случае необходимости. Продолжающееся кровотечение после того, как копье приложение указывает судно может быть повреждена.
   18. Руководство НПП клеток загруженных инжектор иглу в направляющее отверстие, с отверстием вниз, и на угол около 10-15 градусов по отношению к поверхности местных склеры.
   19. Аккуратно вставьте инжектор иглу в пилотной скважины на глубину около 500 мкм для доступа к субретинальное пространства. Там должно быть о 100 мкм разницы между краем знака черное перо и точкой, где игла покрыта пигментированной хориоидеи (Рисунок 1 c и 1 D).
   20. Попросите помощника Осторожно отпустите поршень шприца инжектор придать соответствующий объем клеток (около 1,2 мкл). Будьте готовы предоставить некоторые борьбе с силой как помощник давит на поршень.
       Примечание: Ранее макет практики с помощником может обеспечить как хирурга, так и помощник с необходимым опытом с этим шагом.
   21. Визуально сосредоточиваясь на перо Марк края, провести инжектора в место для 25-30 s и затем медленно втягивать инжектор. Часто наблюдается небольшое количество обратного потока.
       Примечание: Если наблюдается не противотока, возможно, были интравитреальные инъекции. Если вы видите обратного потока через печать или клетки, заполнение под склеры, инъекции был слишком мелкой.
   22. Прополоскать измеряем клетки от укола с стерильных глаза мыть 3 раза и собрать излишки с хлопка аппликатор.
   23. Применить капли глаз смазки на оперированный глаз и передачи крысы до станции октября для изучения расположения пересаженные клетки и размер субретинальное пузырь.

3. впрыск лечение

1. Обезболивающее лечение противовоспалительными и боль
   1. Придать бупренорфина на 0,1 мг/кг веса тела в физиологического раствора подкожно, чтобы уменьшить боль.
   2. Придать дексаметазона в 1,6 мг/кг веса тела в солевых внутрибрюшинной инъекции (и.п.) для контроля воспаления.
2. Животных восстановления
   1. Возвращение крыса в клетке восстановления под лампой тепла для поддержания температуры тела.
   2. Соблюдайте оперированный глаз для признаков кровотечения.
   3. Наблюдать за крысу, чтобы убедиться, что он выходит из наркоза.
   4. Возвращение восстановленные животное в клетке свежие и флаг клетка с картой хирургии и ежедневно контролировать для каких-либо признаков бедствия, глазные кровоизлияния или помутнения роговицы. Немедленно уведомлять ветеринар, если есть проблемы.

Результаты

С помощью метода, описанного в этой статье, мы последовательно выступил hRPESC НПП клетки в пространство субретинальное крыс RCS точно контролировать расположение, угол и глубину инжектор вставки иглы в ткани (рис. 1B- D ). Сразу же следующие трансплантации,...

Обсуждение

Техника субретинальное инъекции, изображенные в этой статье осуществляется через транс склеры путь, где инжектор иглу проникает внешние слои (склера Хориоидея НПП комплекс) глаз стены без ущерба нейронных сетчатки или нарушая полости стекловидного тела. Альтернативные транс vitreal подх...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Life Technologies	25200-072
DNAse I	Sigma	DN-25
1xDulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium & Magnesium (1xDPBS-CMF)	Corning Cellgro	431219
Sterile Balanced Salt Solution (BSS)	Alcon	00065079550
Sterile eye wash	Moore Medical	75519
Sterile 0.9% saline	Hospira	488810
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%)	Akorn	17478026312
Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%)	Bausch & Lomb	24208058559
Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) stock	Bausch & Lomb	42702010305	This is used to make 2.5% Phenylepherine
Buprenex	Patterson	433502
Dexamethasone	APP Pharmaceuticals	63323051610
100% Ethanol	Thermo Scientific	615090040
70% Ethanol	Ricca Chemical Company	2546.70-5
Sterile GenTeal Lubricant Eye Gel	Novartis	78042947
Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops	Alcon	00065143105
hRPESC-RPE cells	Not available commercially		Please refer to "Reference #12" for cell isolation and mainteinance.
24-well plates	Corning	3526
Conical tubes (15 ml)	Sarstedt	62554002
Microcentrifuge cap with o-ring	LPS inc	L233126
Capless Microcentrifuge tubes (1.7 ml)	LPS inc	L233041
Centrifuge	Eppendorf	5804R
Sterile alcohol wipe	McKesson	58-204
Sterile cotton tip applicators	McKesson	24-106-2S
Sterile Weck-Cel spears	Beaver-Visitec International	0008680
Sterile surgical drapes	McKesson	25-515
Gauze	McKesson	16-4242
Nanofil syringe (10 ul)	World Precision Instruments	Nanofil
Nanofil beveled 33-gauge needle	World Precision Instruments	NF33BV-2
Insulin syringe needles 31-gauge	Becton Dickinson	328418
Rat toothed forceps	World Precision Instruments	555041FT
Vannas Micro Dissecting Spring Scissors	Roboz	RS-5602
Circulating water T pump	Stryker	TP700
Heating pad	Kent Scientific	TPZ-814
Animal anesthesia system	World Precision Instruments	EZ-7000
Balance	Ohaus	PA1502
Stereo microscope	Zeiss	Stemi 2000
Microscope light source	Schott	ACE series
Bioptigen Envisu Spectral Domain Ophthalmic Imaging System	Bioptigen	R2210
Sterile black marker pen	Viscot Industries	1416S-100
Miniature measuring scale	Ted Pella Inc	13623
Infrared Basking Spot Lamp	EXO-TERRA	PT2144	This is used as a heating lamp for animals during the post-surgical recovery  phase