Élaboration d’un protocole raffiné pour Trans-sclérale Transplantation sous-rétinienne des cellules épithéliales humaines pigmentaire dans les yeux de Rat

Résumé

Injection sous-rétinienne a été largement appliquée dans les études précliniques de thérapie de remplacement de cellules souches pour la dégénérescence maculaire liée à l’âge. Dans cet article visualisé, nous décrivons une technique d’injection sous-rétinienne moins risqués, reproductibles et précisément modifiés via l’approche trans-sclérale pour livrer des cellules dans les yeux de rat.

Résumé

Maladies dégénératives de la rétine comme la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) sont la principale cause de cécité irréversible dans le monde entier. AMD se caractérise par la dégénérescence des cellules épithéliales pigmentaire rétinien (RPE), qui sont une monocouche de cellules supportant fonctionnellement et anatomiquement enroule autour de la rétine neuronale. Les traitements pharmacologiques actuels pour la DMLA néovasculaire-non (DMLA sèche) seulement ralentissent la progression de la maladie mais ne peut pas restaurer la vision, ce qui nécessite des études visant à identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques. Remplacer les cellules dégénératives de la RPE avec promesse de cales de cellules saines pour traiter la DMLA sèche à l’avenir. Des études précliniques approfondies des thérapies de remplacement de cellules souches pour AMD impliquent la transplantation de cellules souches dérivées de cellules RPE dans l’espace sous-rétinienne des modèles animaux, dans lesquels la technique d’injection sous-rétinienne est appliquée. L’approche plus fréquemment utilisé dans les études précliniques de ces animaux est la voie trans-sclérale, qui est rendue difficile par le manque de visualisation directe de l’extrémité de l’aiguille et souvent causer des lésions rétiniennes. Une approche alternative à travers le corps vitré permet une observation directe de la position de fin de l’aiguille, mais il comporte un risque élevé de traumatismes chirurgicaux comme plus tissus oculaires sont perturbés. Nous avons développé une méthode d’injection scléral trans mis à jour le moins risqué et reproductible qui utilise les angles définis aiguille et profondeurs pour avec succès et toujours livrer cellules RPE dans l’espace sous-rétinienne rat et éviter les dommages rétiniens excessifs. Les cellules envoyées de cette manière ont été démontrées précédemment pour être efficace chez le rat du Royal College of Surgeons (RCS) pendant au moins 2 mois. Cette technique peut être utilisée non seulement pour la transplantation de cellules, mais aussi pour la livraison de petites molécules ou des thérapies géniques.

Introduction

La rétine humaine situé à l’arrière les fonctions de l’oeil comme un léger tissu sensoriel et joue un rôle essentiel dans la perception de la vision. Dysfonction des cellules rétiniennes ou la mort cellulaire par conséquent provoque des problèmes de vision ou cécité permanente. Troubles impliquant la dégénérescence ou la dysfonction des cellules dans les différentes couches de la rétine sont connus comme des maladies dégénératives rétiniennes, parmi lesquels AMD est le type le plus commun et la principale cause de cécité irréversible chez les personnes âgées dans les pays développés ^1,2. Le processus pathologique de la DMLA est associé à l’accumulation « drusen » entre la couche RPE et membrane de Bruch le sous-jacent, qui à son tour affecte soutien RPE de la physiologie des photorécepteurs, conduisant à l’atrophie neuronale de la rétine et perte de vision^{3, 4,5}. Jusqu’ici, il n’existe aucun remède pour avancés (non-néovasculaire) DMLA sèche. L’émergence de la thérapie de cellules souches comme un nouveau paradigme en médecine régénérative apporte l’espoir de remplacer les cellules mortes ou dysfonctionnelles RPE avec cellules souches dérivées de cellules saines. En effet, des études précliniques de repiquage des cellules (par exemple, les cellules souches embryonnaires humaines) souches-dérivées des cellules RPE dans des modèles animaux pre-dégénératives ont été effectué^6,7, dont certains ont progressé au essais cliniques^8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). Récemment, une autre source de cellules souches résidents dans la couche RPE humaine, les RPE des cellules souches humaines (hRPESCs), a été identifiée par notre laboratoire et est actuellement utilisée dans les études précliniques de la thérapie de transplantation cellulaire (hRPESC-pre) de dérivés-RPE de hRPESC pour AMD ^{10 , 11 , 12 , 13}.

La technique d’injection sous-rétinienne est appliquée dans les études précliniques mentionnés ci-dessus en plusieurs groupes, dont notre groupe. Il existe deux approches générales pour injection sous-rétinienne chez les animaux : trans-vitréennes et trans-sclérale. L’approche trans-vitréennes a l’avantage du chirurgien est de pouvoir observer directement l’extrémité de l’aiguille pénètre l’antérieur de le œil, traverse la cavité entière vitréennes adjacente à la lentille, et pénètre la rétine à l’arrière de le œil pour atteindre le subretinal espace^14,15,16. Cependant, il faut perturber la rétine à deux endroits (antérieures et postérieures), comporte le risque d’endommager la lentille et peut provoquer reflux des cellules dans le corps vitré lorsque l’aiguille est retirée. En revanche, l’approche trans-sclérotique, en principe, évite la participation de la rétine et le vitré et reflux quitte l’oeil. Chez les rongeurs pigmentées, le chirurgien peut observer au départ de la pénétration de la sclère, mais après passage dans la choroïde pigmentée, l’extrémité de l’aiguille n’est plus visible. Sans l’observation directe, atteinte de la rétine est courante et peut se traduire par une dissection rétinienne et livraison de cellules et/ou de sang dans le corps vitré. En outre, parce que la surface de le œil est courbée, il est très difficile de savoir quels angles de l’aiguille et les profondeurs sont plus efficaces pour les injections trans-sclérale.

Dans cet article visualisé, nous présentons une méthode de trans-scleral injection sous-rétinienne informée par l’utilisation des évaluations post-opératoire avec tomographie en cohérence optique (OCT), qui permet un examen détaillé du site d’injection. Notre technique d’injection trans-sclérale utilise des emplacements définis, des angles et des profondeurs pour les aiguilles à injection produire traumatisme chirurgical très faible et une grande fiabilité. Nous démontrons ici, plus précisément l’injection de cellules hRPESC-RPE dans l’espace sous-rétinienne du rat RCS, un modèle préclinique de la DMLA humaine. Avec cette méthode d’injection, nous avons systématiquement et avec succès livré cellules RPE-hRPESC dans l’espace sous-rétinienne d’yeux de rat RCS avec un taux de réussite très élevé. Injection de cellules a été précédemment jugée se pour traduire par la préservation des photorécepteurs RCS au moins 2 mois après l’injection,¹³. Cette procédure est réalisée sous le microscope à dissection et est facile à apprendre. Il faut deux personnes (un chirurgien et un assistant) pour effectuer l’injection et le temps moyen d’injection pour chaque animal est moins de 5 minutes. Les angles définis et les profondeurs pour les aiguilles à injection rendent possible pour les laboratoires, où OCT est indisponible, pour réaliser une injection sous-rétinienne réussie. Il permet un accès sous-rétinienne hautement reproductible et peut être utilisé non seulement pour la transplantation de cellules, mais aussi pour la livraison et gène pharmacothérapies.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) à la State University of New York à Albany.

1. préparation avant injection

1. Préparation d’une suspension de cellules hRPESC-RPE
   Remarque : Toutes les étapes suivantes sont effectuées dans la culture de tissus stériles capot et familiarité avec base technique stérile est nécessaire.
   1. Isoler les cellules primaires pers de donneur humain yeux âgés de 50 à 90 ans et des cellules de culture en plaques 24 puits¹². Cryopréserver des cellules au passage 1, dégel au besoin et la culture passage 2 (P2) cellules pendant 4-5 semaines (Figure 1 a) pour l’injection.
   2. Enlever le milieu de culture¹² et doucement les puits Rincer deux fois avec 500 µL préchauffée 1 X Phosphate Buffered Saline de Dulbecco sans Calcium & magnésium (1 x SPD-FCM) en ajoutant 1 X SPD-FCM dans les puits à l’aide d’une pipette 1 000 µL et extrayant à l’aide d’un aspirateur.
   3. Ajouter 300 µL trypsine/DNAse dans chaque puits. Incuber les cellules hRPESC-RPE en trypsine/DNAse (4 kU DNase pour 1 mL de 0,25 % de trypsine-EDTA) pendant 4 min à 37 ° C, de dissocier les cellules.
   4. Vérifier les cellules au microscope pour voir si ils ont arrondi. Continuer à incuber les cellules en trypsine/DNase pour un 2 min supplémentaire si elles n’ont pas arrondis vers le haut encore.
   5. Une fois que les cellules sont arrondies vers le haut, utiliser une pipette de 1 000 µL de triturer les cellules individuelles du puits et de transférer la trypsine/DNase contenant des cellules individuelles dans un tube conique de 15 mL avec un volume égal de milieu de culture pré chauffé, d’inactiver la trypsine/DNase.
   6. Rincer les puits avec préchauffé 1 X SPD-FCM en pipettant également doucement de haut en bas, en particulier sur les bords du puits ; puis ajoutez ces cellules au précédent tube conique.
   7. Centrifuger le tube conique à 286 x g pendant 5 min à 4 ° C pour granuler les cellules.
   8. Retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules avec 1 mL de milieu de culture.
   9. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
   10. Centrifuger à 286 x g pendant 5 min à 4 ° C pour granuler les cellules.
   11. Retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules en stérile équilibré sel Solution (BSS) à 50 000 cellules/µL (à fournir 50 000 cellules en 1 volume µL pendant l’injection sous-rétinienne).
   12. Transférer la suspension cellulaire finale (CS) dans un tube de microcentrifuge de 1,7 mL et garder dans un mélange de glace et d’eau jusqu'à l’utilisation de l’injection.
2. Préparation de l’injection de cellules
   1. Insérer une aiguille stérile de calibre 33 biseautée dans la seringue d’injection et le visser fermement pour assembler l’injecteur.
   2. Rincer l’injecteur avec 100 % d’éthanol, 5 - 6 fois.
   3. Rincer l’injecteur avec l’éthanol à 70 % de 5 - 6 fois.
   4. Rincer l’injecteur avec BSS 5 - 6 fois.
   5. Marquez l’aiguille de l’injecteur avec un stylo marqueur noir stérile à une position de 600 µm de la pointe de l’aiguille sous le microscope à dissection (Figure 1 b).
   6. Placer l’injecteur sur un micromanipulateur pour injection.

2. sous-rétinienne Injection

1. Zone chirurgicale et préparation animaux
   1. Peser un rat RCS de vieux de 4-5 semaines (60-100 g) et en utilisant le système de distribution de vapeur isoflurane anesthésier.
      Remarque : Pour induire l’anesthésie garder l’isoflurane débit à 5 %. Confirmer la profondeur de l’anesthésie en appuyant sur les pattes et puis réduire le débit à 2-3 % pour l’entretien de l’anesthésie au cours de la chirurgie.
   2. Placez un drap stérile de la chirurgie, avec un coussin chauffant situé en dessous, sur la scène du microscope à dissection de mettre en place une zone chirurgicale stérile.
   3. Transférer le rat à la zone chirurgicale et placez le rat dans un cône de nez connecté au système de maintenir anesthésie isoflurane.
   4. Couvrir le corps du rat avec de la gaze. Pincer l’orteil de rat pour confirmer une anesthésie complète.
2. TRANS-scleral injection sous-rétinienne sous le microscope
   1. Appliquez une goutte de lubrifiant oculaire sur yeux opérés de rat.
   2. Positionner le rat sur son côté droit avec son œil gauche face au plafond pour injection, sa tête vers la droite du chirurgien et son dos vers le chirurgien.
   3. Tailler les moustaches qui couvrent le œil avec des petits ciseaux.
   4. Couler une petite quantité de lavage d’oeil du côté temporal de le œil gauche et recueillir l’excès du côté nasal avec un applicateur de coton se rincer le œil.
   5. Dilater la pupille phényléphrine tropicamide et 2,5 % de 1 % (fraîchement faites de 10 % la phényléphrine en diluant il en solution saline 0,9 % stérile sur le jour de l’opération) pour un examen de OCT après l’injection en appliquant une goutte de chacune.
   6. Tirez doucement sur la peau qui entoure l’oeil 4 - 6 fois pour ouvrir la paupière afin que le œil est légèrement proptosed pour faciliter l’accès aux régions postérieures à la limbe.
   7. Appliquez une goutte de lavage oculaire et garder le œil humide.
   8. Doucement, triturer le CS (préparé à l’étape 1.1.12) et charger l’injecteur avec 1,2 µL CS. L’extra de 0.2 µL est utilisé pour compenser pour le refoulement de l’injection.
      Remarque : Selon nos mesures, sur 5 000-8 000 cellules sont perdent dans le reflux avec une injection de 50 000 cellules/µL, ce qui équivaut à environ 10 à 16 % de la perte de cellules et un supplément de 0.2 µL CS a été injecté pour compenser cette perte de cellules.
   9. Placer l’injecteur rempli de CS sur un micromanipulateur (ou avoir un assistant tenez-le) verticalement comme pre, les cellules ont tendance à couler facilement en suspension.
   10. Appliquez une goutte de proparacaïne de 0,5 % (anesthésique topique local) sur le œil et enlevez le surplus avec un applicateur de coton.
       Remarque : Cette étape devrait supprimer le réflexe cornéen et empêcher le œil de clignoter pendant les étapes suivantes.
   11. Pince permet de saisir la conjonctive postérieure à la limbe, tourner de le œil par voie nasale et soulevez la conjonctive pour faire une « tente ».
   12. Utiliser des ciseaux pour couper le dessus de la « tente » de faire une petite ouverture dans la conjonctive et exposer la sclère sous-jacent.
   13. Utiliser les pinces pour saisir le bord de la marge de conjonctive reste à côté de la limbe et tourner le œil par voie nasale afin que l’axe pupillaire est à un angle d’environ 30 degrés par rapport au haut de la table (Figure 1). Préhension continue de la marge de la conjonctive est nécessaire pour fournir une force contre le pendant l’insertion de l’aiguille et pour maintenir le œil à un angle optimal.
   14. Pour percer un trou de guidage pour l’injection de cellules, positionnez l’extrémité d’une aiguille stérile de l’insuline calibre 31 biseauté à 1 200-1 500 µm postérieur à la limbe avec l’ouverture de la pointe vers le haut.
   15. Ajustez l’angle de l’aiguille de l’insuline pour qu’il soit 10-15 degrés au-dessus de la sclère (tangente à un plan imaginaire au point d’injection prévue). Pénétrer lentement dans le complexe de la sclère-choroïde jusqu'à une profondeur de l’aiguille d’environ 500 µm. Chez le rat pigmenté, l’extrémité de l’aiguille va « disparaître » sous la choroïde pigmentée. Pour la marque de l’aiguille de l’insuline utilisée ici, la distance entre la pointe de l’aiguille et le biseau est 500 µm.
   16. Avec précaution, retirer l’aiguille de l’insuline (on peut voir un très petit épanchement de sang).
   17. Si vous constatez des saignements excessifs, une lance de le œil peut être appliquée pour dégager le trou, si nécessaire. Un saignement continue après que l’application lance indique un navire peut ont été endommagé.
   18. Guider l’aiguille d’injecteur de cellules chargées de RPE dans le trou pilote, avec l’ouverture vers le vers le bas et à un angle d’environ 10-15 degrés par rapport à la surface du locale de la sclère.
   19. Insérez délicatement l’aiguille de l’injecteur dans le trou de guidage pour une profondeur d’environ 500 µm à accéder à l’espace sous-rétinienne. Il devrait y avoir sur une marge de 100 µm, entre le bord de la marque de crayon noir et le point où l’aiguille est couvert par la choroïde pigmentée (Figure 1C et 1D).
   20. Demandez à l’assistant d’appuyer légèrement sur le piston de la seringue d’injection pour injecter le volume approprié de cellules (environ 1,2 µL). Être prêt à fournir certains Counter-force l’Assistant ne s’appuie sur le piston.
       Remarque : Pratique antérieure des simulacre avec l’assistant peut fournir le chirurgien et l’assistant avec l’expérience nécessaire à cette étape.
   21. Tout en se concentrant visuellement sur le stylo marque RAS, maintenez l’injecteur en place pendant 25-30 s et puis rétracter lentement l’injecteur. Une petite quantité de reflux est fréquemment observée.
       Remarque : Si aucun dispositif n’est observée, il peut avoir été une injection intravitréenne. Si vous voyez des reflux par le joint ou les cellules de remplissage sous la sclérotique, l’injection était trop faible.
   22. Rincer l’efflux de cellule au site d’injection avec le lavage oculaire stérile 3 fois et recueillir l’excès avec un applicateur de coton.
   23. Appliquez une goutte de lubrifiant de le œil sur le œil opéré et transférer le rat à la station de l’OCT pour examiner l’emplacement des cellules transplantées et la taille de la cloque sous-rétinienne.

3. après l’injection traitement

1. Traitement analgésique anti-inflammatoire et douleur
   1. Injecter la buprénorphine à 0,1 mg/kg de poids corporel dans une solution saline par voie sous-cutanée pour diminuer la douleur.
   2. Injecter de dexaméthasone à 1,6 mg/kg de poids corporel dans une solution saline par injection intrapéritonéale (I.P.) pour le contrôle de l’inflammation.
2. Récupération de l’animale
   1. Retourner le rat à la cage de récupération sous une lampe de chaleur pour maintenir la température du corps.
   2. Observer le œil opéré des signes d’hémorragie.
   3. Observer le rat pour s’assurer que celle-ci sort de l’anesthésie.
   4. Retourner l’animal récupéré à une nouvelle cage marquer la cage avec une carte de chirurgie et surveiller chaque jour pour déceler tout signe de détresse, hémorragie oculaire ou les opacités cornéennes. Aviser immédiatement le vétérinaire si il est à craindre.

Résultats

En utilisant la technique décrite dans cet article, nous avons toujours livré cellules RPE-hRPESC dans l’espace sous-rétinienne des rats RCS en contrôlant précisément l’emplacement, l’angle et la profondeur de l’insertion d’aiguille injecteur dans les tissus (Figure 1 b-D ). Immédiatement suivant la transplantation, un examen OCT a été réalisée pour observer le point d’injection et la cloque sous-rétinienne créé par les cellules ...

Discussion

La technique d’injection sous-rétinienne décrite dans cet article est par la voie trans-sclérale, où l’aiguille de l’injecteur pénètre dans les couches supérieures de la paroi de le œil (sclère-choroïde-RPE complexe) sans nuire à la rétine neurale ou perturber la cavité vitréenne. Une approche alternative trans-vitréennes a un risque potentiel de dommages de lentille conduisant à la cataracte, étant donné que l’objectif des rongeurs occupe la majorité de la cavité vitréenne. Par rapport à ce...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Life Technologies	25200-072
DNAse I	Sigma	DN-25
1xDulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium & Magnesium (1xDPBS-CMF)	Corning Cellgro	431219
Sterile Balanced Salt Solution (BSS)	Alcon	00065079550
Sterile eye wash	Moore Medical	75519
Sterile 0.9% saline	Hospira	488810
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%)	Akorn	17478026312
Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%)	Bausch & Lomb	24208058559
Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) stock	Bausch & Lomb	42702010305	This is used to make 2.5% Phenylepherine
Buprenex	Patterson	433502
Dexamethasone	APP Pharmaceuticals	63323051610
100% Ethanol	Thermo Scientific	615090040
70% Ethanol	Ricca Chemical Company	2546.70-5
Sterile GenTeal Lubricant Eye Gel	Novartis	78042947
Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops	Alcon	00065143105
hRPESC-RPE cells	Not available commercially		Please refer to "Reference #12" for cell isolation and mainteinance.
24-well plates	Corning	3526
Conical tubes (15 ml)	Sarstedt	62554002
Microcentrifuge cap with o-ring	LPS inc	L233126
Capless Microcentrifuge tubes (1.7 ml)	LPS inc	L233041
Centrifuge	Eppendorf	5804R
Sterile alcohol wipe	McKesson	58-204
Sterile cotton tip applicators	McKesson	24-106-2S
Sterile Weck-Cel spears	Beaver-Visitec International	0008680
Sterile surgical drapes	McKesson	25-515
Gauze	McKesson	16-4242
Nanofil syringe (10 ul)	World Precision Instruments	Nanofil
Nanofil beveled 33-gauge needle	World Precision Instruments	NF33BV-2
Insulin syringe needles 31-gauge	Becton Dickinson	328418
Rat toothed forceps	World Precision Instruments	555041FT
Vannas Micro Dissecting Spring Scissors	Roboz	RS-5602
Circulating water T pump	Stryker	TP700
Heating pad	Kent Scientific	TPZ-814
Animal anesthesia system	World Precision Instruments	EZ-7000
Balance	Ohaus	PA1502
Stereo microscope	Zeiss	Stemi 2000
Microscope light source	Schott	ACE series
Bioptigen Envisu Spectral Domain Ophthalmic Imaging System	Bioptigen	R2210
Sterile black marker pen	Viscot Industries	1416S-100
Miniature measuring scale	Ted Pella Inc	13623
Infrared Basking Spot Lamp	EXO-TERRA	PT2144	This is used as a heating lamp for animals during the post-surgical recovery  phase