Entwicklung eines raffinierten Protokolls für Trans-skleralen subretinalen Transplantation von menschlichen retinalen Pigment Epithelzellen in Ratte Augen

Zusammenfassung

Subretinale Injektion hat weit in präklinischen Studien der Stammzell-Ersatz-Therapie bei altersbedingter Makuladegeneration angewendet worden. In diesem visualisierte Artikel beschreiben wir eine weniger riskante, reproduzierbar und präzise modifizierte subretinalen Injektionstechnik über den Trans-skleralen Ansatz um Zellen in Ratte Augen zu liefern.

Zusammenfassung

Degenerative Netzhauterkrankungen wie altersbedingte Makula-Degeneration (AMD) sind die häufigste Ursache für irreversible Sehverlust weltweit. AMD zeichnet sich durch die Degeneration der Retina Pigment (RPE) Epithelzellen, die eine Monolage von Zellen funktionell unterstützen und anatomisch Umwickeln um die neuronale Netzhaut sind. Aktuellen pharmakologische Behandlungen für die nicht-neovaskulären AMD (trockene AMD) nur verlangsamen das Fortschreiten der Erkrankung aber nicht wiederherstellen Vision, dass Studien, die darauf abzielen, neue therapeutische Strategien zu identifizieren. Ersetzen die degenerativen RPE-Zellen mit gesunden Zellen hält Versprechen, trockenen AMD in der Zukunft zu behandeln. Umfangreiche präklinische Studien der Stammzell-Ersatz-Therapien für AMD beinhalten die Transplantation von Stammzellen gewonnenen RPE-Zellen in den subretinalen Raum von Tiermodellen, in denen die subretinale Injektionstechnik angewendet wird. In dieser präklinischen tierexperimentellen Studien am häufigsten verwendete Ansatz ist durch die Trans-skleralen Route, die wird durch die fehlende direkte Visualisierung des Nadelendes erschwert und oft retinalen Schäden führen kann. Ein alternativer Ansatz durch den Glaskörper ermöglicht die direkte Beobachtung der Nadel Endlage, aber es trägt ein hohes Risiko der chirurgischen Verletzungen wie mehr Augengewebe gestört werden. Wir haben einen weniger riskant und reproduzierbare modifizierte Trans-skleralen Injektionsverfahren entwickelt, definierte Nadel Winkeln und tiefen erfolgreich und konsequent RPE-Zellen in der Ratte subretinalen Raum liefern und übermäßige retinalen Schäden zu vermeiden. Zellen, die auf diese Weise geliefert wurden zuvor nachgewiesen, für mindestens 2 Monate in das Royal College of Surgeons (RCS) Ratte wirksam sein. Diese Technik kann nicht nur für Stammzelltransplantation, sondern auch für die Lieferung von kleinen Molekülen oder Gentherapien verwendet werden.

Einleitung

Die menschliche Netzhaut befindet sich auf der Rückseite des Auges-Funktionen als eine leichte sensorische Gewebe und spielt eine entscheidende Rolle in der Vision Wahrnehmung. Funktionsstörungen der retinalen Zellen oder Zelltod verursacht daher Sehstörungen oder dauerhafte Erblindung. Erkrankungen mit Degeneration oder Dysfunktion der Zellen in verschiedenen Schichten der Netzhaut sind als degenerative Netzhauterkrankungen, bekannt unter denen AMD die häufigste Form und die häufigste Ursache für irreversible Blindheit bei älteren Menschen in den entwickelten Ländern ^{ist 1,2}. Des pathologischen Prozesses von AMD ist verbunden mit "Drusen" Anhäufung zwischen der RPE-Schicht und die zugrunde liegenden Bruch-Membran, die wiederum RPE Unterstützung der Photorezeptor Physiologie, was zu neuronalen Retinaatrophie und Vision Verlust^{3beeinträchtigt, 4,5}. Bisher gibt es keine Heilung für fortgeschrittene trocknen (nicht-neovaskulären) AMD. Die Entstehung der Stammzell-Therapie als ein neues Paradigma in der regenerativen Medizin bringt die Hoffnung die dysfunktionalen oder tot RPE-Zellen durch Stammzellen gewonnenen gesunde Zellen zu ersetzen. In der Tat umfangreiche präklinische Studien der Transplantation von Stammzellen (z.B. menschlicher embryonaler Stammzellen)-abgeleitete RPE-Zellen in RPE-degenerativen Tiermodelle wurden durchgeführt^6,7, einige davon weit fortgeschritten sind, klinische Studien^8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). Vor kurzem, eine alternative Quelle für Stammzellen resident in der menschlichen RPE-Schicht, die menschlichen RPE Zellen (hRPESCs), wurde von unserem Labor identifiziert und ist derzeit in präklinischen Studien von hRPESC abgeleitet-RPE (hRPESC-RPE) Transplantation Zelltherapie für AMD verwendet wird ^{10 , 11 , 12 , 13}.

Die subretinale Injektionstechnik wird in den präklinischen Studien erwähnt durch mehrere Gruppen, darunter unsere Gruppe angewendet. Es gibt zwei grundsätzliche Ansätze für die subretinale Injektion bei Tieren: Trans-Glaskörperblutung und Trans-skleralen. Die Trans-Glaskörperblutung Ansatz hat den Vorteil des Chirurgen in der Lage, direkt am Ende der Nadel beobachten, wie das vordere Auge dringt, den gesamten Glaskörperblutung Hohlraum angrenzend an das Objektiv durchquert und dringt in die Netzhaut auf der Rückseite für das Auge, der subretinalen zu erreichen Platz^14,15,16. Es erfordert jedoch stören die Netzhaut an zwei Standorten (Front- und Seitenzahnbereich), birgt das Risiko einer Beschädigung des Objektivs und Rückfluss von Zellen in den Glaskörper führen kann, wenn die Nadel zurückgezogen wird. Im Gegensatz dazu der Trans-Sklera Ansatz grundsätzlich vermeidet Beteiligung der Netzhaut und Glaskörper und Rückfluss beendet das Auge. Bei pigmentierten Nagetieren der Chirurg kann zunächst beobachten, Eindringen von der Sklera, aber nach dem Übergang in die pigmentierte Aderhaut, das Ende der Nadel ist nicht mehr sichtbar. Ohne direkte Beobachtung Verletzung der Netzhaut ist üblich und Netzhaut Dissektion und Lieferung von Zellen und/oder Blut in den Glaskörper führen kann. Darüber hinaus, da die Augenoberfläche gekrümmt ist, ist es sehr schwierig zu wissen, welche Nadel Winkel und Tiefe für Trans-skleralen Injektionen am effektivsten sind.

In diesem visualisierte Artikel stellen wir eine Trans-skleralen subretinalen Injektionsverfahren informiert durch den Einsatz von postoperativen Auswertungen mit optischen Kohärenztomografie (OCT), die eine detaillierte Untersuchung der Injektionsstelle ermöglichen. Unsere Trans-skleralen Injektionstechnik nutzt definierten Orten, Winkel und Tiefe für Injektionsnadeln, sehr niedrigen chirurgische Trauma und hohe Zuverlässigkeit zu produzieren. Hier zeigen wir speziell die Injektion von hRPESC-RPE-Zellen in den subretinalen Raum der RCS Ratte, ein prä-klinischen Modell der menschlichen AMD. Mit dieser Methode Injektion lieferten wir erfolgreich und konsequent hRPESC-RPE-Zellen in den subretinalen Raum des RCS Ratte Augen mit einer sehr hohen Erfolgsquote. Injektion von Zellen fand zuvor mindestens 2 Monate nach der Injektion¹³Erhaltung des RCS Photorezeptoren zur Folge. Dieses Verfahren wird unter dem sezierenden Mikroskop durchgeführt und ist leicht zu erlernen. Es erfordert zwei Personen (ein Chirurg und ein Assistent) die Injektion durchführen und die durchschnittliche Zeit der Injektion für jedes Tier ist weniger als 5 Minuten. Die definierten Winkeln und tiefen für Injektionsnadeln ermöglichen Labors, wo OAT nicht verfügbar sind, um erfolgreiche subretinale Injektion zu erreichen ist. Es ermöglicht hoch reproduzierbare subretinalen Zugriff und kann verwendet werden, nicht nur für Stammzelltransplantation, sondern auch für Medikamententherapien Lieferung und gen.

Protokoll

Alle Verfahren, bei denen Tiere wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der State University of New York at Albany genehmigt.

(1) Voreinspritzung Vorbereitung

1. Vorbereitung einer hRPESC-RPE Zellsuspension
   Hinweis: Die folgenden Schritte werden durchgeführt in sterilen Gewebekultur Haube und Vertrautheit mit sterilen Grundtechnik erforderlich ist.
   1. Primäre hRPE Zellen zu isolieren von menschlichen Spender Augen im Alter von 50-90 Jahre und Zellkulturen in 24-Well Platten¹². Tiefgefrieren der Zellen in der Passage 1, Tauwetter nach Bedarf und Kultur Durchlass 2 (P2) Zellen für 4-5 Wochen (Abbildung 1A) zur Injektion.
   2. Entfernen Sie das Kulturmedium¹² und sanft spülen Brunnen zweimal mit 500 µL vorgewärmt 1 X Dulbeccos Phosphat gepufferte Kochsalzlösung ohne Calcium & Magnesium (1 x DPBS-CMF) durch Zugabe von 1 X DPBS-CMF in Brunnen mit einer 1.000 µL Pipette und entfernen sie mit einem Vakuum.
   3. Jedes gut 300 µL Trypsin/DNAse hinzufügen. Inkubieren Sie hRPESC-RPE-Zellen in Trypsin/DNAse (4 kU DNase pro 1 mL 0,25 % Trypsin-EDTA) für 4 min bei 37 ° C, die Zellen zu trennen.
   4. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop zu sehen, ob sie aufgerundet haben. Weiterhin die Zellen in Trypsin/DNase für eine zusätzliche 2 min inkubieren, wenn sie noch nicht aufgerundet.
   5. Sobald die Zellen aufgerundet werden, verwenden Sie eine 1.000 µL Pipette genannte freistehenden Zellen aus dem Brunnen und übertragen die Trypsin/DNase mit freistehende Zellen in ein 15 mL konische Röhrchen in gleicher Lautstärke vorgewärmten Kulturmedium, Trypsin/DNase zu inaktivieren.
   6. Spülen Sie Brunnen mit vorgewärmten 1 X DPBS-CMF durch Pipettieren sanft auf und ab, besonders an den Rändern des Brunnens; Fügen Sie diese Zellen die vorherigen konischem Rohr.
   7. Zentrifugieren Sie das konische Rohr auf 286 X g für 5 min bei 4 ° C zu die Zellen Pellets.
   8. Den Überstand zu entfernen und die Zellen mit 1 mL Kulturmedium Aufschwemmen.
   9. Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer.
   10. Zentrifugieren Sie bei 286 X g für 5 min bei 4 ° C zu die Zellen zu Pellets.
   11. Entfernen des Überstands und Aufschwemmen Zellen in sterilen ausgewogen Salz Lösung (BSS) bei 50.000 Zellen/µL (, 50.000 Zellen in 1 µL Volumen während subretinale Injektion zu liefern).
   12. Übertragen Sie die endgültige Zellsuspension (CS) in eine 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch und halten in einem Eis-Wassergemisch bis zur Injektion Verwendung.
2. Vorbereitung der Zelle Injektor
   1. Legen Sie eine sterile abgeschrägte 33-Gauge-Nadel in die Injektionsspritze und Schrauben Sie fest an den Injektor zu montieren.
   2. Spülen Sie den Injektor mit 100 % igem Ethanol 5-6 Mal.
   3. Spülen Sie den Injektor mit 70 % Ethanol 5-6 Mal.
   4. Spülen Sie den Injektor mit BSS 5-6 Mal.
   5. Markieren Sie die Injektor Nadel mit einem sterilen schwarzen Filzstift an einer Position von 600 µm weg von der Spitze der Nadel unter dem sezierenden Mikroskop (Abbildung 1 b).
   6. Legen Sie den Injektor auf einem Mikromanipulator Injektionslösung.

(2) subretinale Injektion

1. OP-Bereich und tierische Vorbereitung
   1. Eine 4-5 Wochen alten RCS Ratte (60-100 g) wiegen und betäuben mit Isofluran-Dampf-Delivery-System.
      Hinweis: Induzieren Anästhesie halten die Isofluran Durchflussgeschwindigkeit bei 5 %. Bestätigen Sie die Tiefe der Narkose mit den Pfoten, und reduzieren Sie die Durchflussmenge auf 2-3 % für Anästhesie Wartung während der Operation.
   2. Legen Sie eine sterile OP drapieren, mit einem Heizkissen unter, auf der Bühne des sezierenden Mikroskops eine sterile OP-Bereich einrichten.
   3. Übertragen Sie die Ratte auf den OP-Bereich und die Ratte in einem Prüfkopf angeschlossenen Isoflurane Narkose halten.
   4. Die Ratte Körper mit Gaze abdecken. Kneifen Sie die Ratte Zehe, um Vollnarkose zu bestätigen.
2. Trans-skleralen subretinale Injektion unter die Lupe genommen
   1. Geben Sie einen Tropfen des Auges Schmiermittel auf die Ratte unbetätigter Auge.
   2. Positionieren Sie die Ratte auf der rechten Seite mit dem linken Auge mit Blick auf die Decke für Injektion, seinen Kopf in Richtung der rechten Hand des Operateurs und den Rücken in Richtung der Chirurg.
   3. Schneiden Sie Schnurrhaare, die das Auge mit einer kleinen Schere abdecken.
   4. Tropfen Sie eine kleine Menge der Augendusche von der zeitlichen Seite des linken Auges und sammeln Sie die Selbstbeteiligung an der nasalen Seite mit einem Baumwoll-Applikator, das Auge zu spülen.
   5. Erweitern Sie die Pupille mit 1 % Tropicamid und 2,5 % Phenylephrin (frisch hergestellt aus 10 % Phenylephrin durch verdünnen es am Tag der Operation in steriler 0,9 % Kochsalzlösung) nach der Injektion OCT-Prüfung durch die Anwendung ein Tropfen von jedem.
   6. Ziehen Sie vorsichtig die Haut rund um das Auge 4-6 Mal, das Augenlid zu öffnen, so dass das Auge leicht Proptosed für einen leichteren Zugang zu Regionen nach der Limbus ist.
   7. Geben Sie einen Tropfen der Augendusche und halten Sie das Auge feucht zu.
   8. Sanft die CS (vorbereitet in Schritt 1.1.12) genannte und laden Sie den Injektor mit 1,2 µL CS. Die extra 0,2 µL dient zur Injektion Rückfluss zu kompensieren.
      Hinweis: Basierend auf unseren Messungen über 5.000-8.000 Zellen sind in den Rückfluss mit einer Injektion von 50.000 Zellen/µL, das entspricht etwa 10-16 % des Zellverlustes verloren und ein Aufpreis von 0,2 µL CS injiziert wurde, um diese Zelle Verlust zu kompensieren.
   9. Legen Sie den Injektor mit CS auf einem Mikromanipulator gefüllt (oder haben einen Assistenten, die es zu halten) vertikal als RPE Zellen neigen dazu, leicht in der Schwebe zu versenken.
   10. Tragen Sie einen Rückgang von 0,5 % Proparacaine (lokale Lokalanästhetikum auf) auf das Auge und entfernen Sie das überschüssige mit einem Baumwoll-Applikator.
       Hinweis: Dieser Schritt sollte die Hornhaut Reflex zu unterdrücken und verhindern, dass das Auge blinkt während der nachfolgenden Schritte.
   11. Verwenden Sie Zange zu greifen die Bindehaut posterior, den Limbus, drehen das Auge nasal und heben die Bindehaut um ein "Zelt" zu machen.
   12. Mit einer Schere oben auf das "Zelt" abgeschnitten, machen eine kleine Öffnung in der Bindehaut und der zugrunde liegenden Sklera setzen.
   13. Verwenden Sie Zange zu greifen den Rand von den restlichen Bindehaut Rand neben dem Limbus und das Auge nasal zu drehen, so dass die Pupillen Achse in einem Winkel von etwa 30 Grad bezogen auf die Tischplatte (Abbildung 1). Weiterhin greifen der Bindehaut Marge braucht man um eine Gegenkraft während Nadel Einschübe zur Verfügung und das Auge in einem optimalen Winkel zu erhalten.
   14. Um ein Kernloch für Zelle Injektion zu machen, legen Sie das Ende einer sterilen abgeschrägte 31-Gauge-Insulin-Nadel bei 1.200-1.500 µm nach dem Limbus mit der Eröffnung der Spitze nach oben zeigt.
   15. Stellen Sie den Winkel der Insulin-Nadel, so dass es 10-15 Grad über der Sklera (tangential zu einer imaginären Ebene an der geplanten Einstichstelle). Dringen Sie langsam die Lederhaut-Aderhaut-Komplex mit einer Nadel Tiefe von etwa 500 µm. Bei pigmentierten Ratten wird am Ende der Nadel unter die pigmentierte Aderhaut "verschwinden". Für die Marke des hier verwendeten Insulin-Nadel ist der Abstand zwischen der Spitze der Nadel die Abschrägung 500 µm.
   16. Zurückziehen Sie vorsichtig, die Insulin-Nadel (eine sehr kleine Erguss des Blutes kann gesehen werden).
   17. Wenn starke Blutungen vermerkt ist, kann ein Auge Speer angewendet werden um das Loch zu löschen falls erforderlich. Anhaltende Blutungen nach die Speer-Anwendung ein Schiff zeigt kann beschädigt worden sein.
   18. Führen Sie die RPE Zellen geladen Injektor Nadel in die Pilotbohrung mit der Öffnung nach unten, und in einem Winkel von etwa 10-15 Grad relativ zur lokalen Oberfläche der Sklera.
   19. Sanft den Injektor Nadel in die Pilotbohrung bis zu einer Tiefe von etwa 500 µm auf den subretinalen Raum zugreifen. Es sollte über einen 100 µm Spielraum zwischen dem Rand der schwarzen Stift Marke und dem Punkt, wo die Nadel durch die pigmentierte Aderhaut (Abbildung 1 und 1 D) abgedeckt ist.
   20. Fragen Sie den Assistenten, sanft drücken Sie den Kolben der Spritze Injektor das entsprechende Volumen der Zellen (ca. 1,2 µL) zu injizieren. Bereit sein, einige Gegenkraft als Assistentin auf den Kolben drückt.
       Hinweis: Vorherige mock Praxis mit dem Assistenten kann die Chirurgen und Mitarbeiter mit der notwendigen Erfahrung mit diesem Schritt bereitstellen.
   21. Visuell mit Schwerpunkt auf den Stift markieren Sie Rand zu, halten Sie den Injektor für 25-30 s und dann zurücknehmen Sie langsam des Injektors. Eine kleine Menge der Rückfluss wird allgemein beobachtet.
       Hinweis: Wenn kein Rückfluss zu beobachten ist, möglicherweise gab es eine intravitreale Injektion. Siehst du Rückfluss durch die Dichtung oder Zellen füllen unterhalb der Sklera, war die Injektion zu flach.
   22. Spülen Sie die Zelle Ausfluss aus der Injektionsstelle mit sterilem Augendusche 3 Mal und sammeln Sie den Überschuss mit einem Baumwoll-Applikator.
   23. Geben Sie einen Tropfen des Auges Schmiermittel auf dem operierten Auge und transfer die Ratte zum OCT, den Speicherort der transplantierten Zellen und die Größe der subretinalen Lungenblase zu untersuchen.

(3) nach der Injektion Behandlung

1. Entzündungshemmende und Schmerz Reliever-Behandlung
   1. Injizieren Sie Buprenorphin bei 0,1 mg/kg Körpergewicht in Kochsalzlösung subkutan, um Schmerzen zu verringern.
   2. Dexamethason bei 1,6 mg/kg Körpergewicht in Kochsalzlösung durch intraperitoneale Injektion (i.p.) für die Entzündung Kontrolle zu injizieren.
2. Tierische Erholung
   1. Zurück die Ratte in den Recovery-Käfig unter einer Wärmelampe auf Körpertemperatur zu halten.
   2. Beobachten des operierten Auges auf Anzeichen einer Blutung.
   3. Beobachten Sie die Ratte um sicherzustellen, dass sie aus der Narkose kommt.
   4. Zurückkehren Sie das wiederhergestellte Tier zu einem frischen Käfig und kennzeichnen Sie den Käfig mit einer Operation Karte und überwachen Sie täglich auf Anzeichen von Not, okuläre Blutung oder Hornhauttrübungen. Benachrichtigen Sie den Tierarzt sofort, wenn Bedenken bestehen.

Ergebnisse

Wenden Sie die in diesem Artikel beschriebenen Technik lieferten wir konsequent hRPESC-RPE-Zellen in den subretinalen Raum des RCS Ratten durch die präzise Steuerung der Position, Winkel und Tiefe der Injektor Nadel einfügen in das Gewebe (Abbildung 1 b-D ). Sofort war folgende Transplantation, eine OCT-Untersuchung durchgeführt, um die Injektionsstelle und der subretinalen Lungenblase erstellt durch die transplantierten Zellen zu beobachten. Postopera...

Diskussion

Die subretinale Injektionstechnik dargestellt in diesem Artikel wird über den Trans-skleralen Weg, wo die Injektor Nadel die Randschichten (Lederhaut-Aderhaut-RPE Komplex) die Augenwand dringt, ohne die neuronale Netzhaut schädigen oder stören den Glaskörper Hohlraum. Ein alternative Trans-Glaskörperblutung Ansatz hat ein potenzielles Risiko Objektiv Schaden führt zu Katarakt, da Nagetiere Objektiv befindet sich den Großteil der Glaskörper Hohlraum. Im Vergleich zu dieser Methode, unsere Technik ist weniger riska...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Life Technologies	25200-072
DNAse I	Sigma	DN-25
1xDulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium & Magnesium (1xDPBS-CMF)	Corning Cellgro	431219
Sterile Balanced Salt Solution (BSS)	Alcon	00065079550
Sterile eye wash	Moore Medical	75519
Sterile 0.9% saline	Hospira	488810
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%)	Akorn	17478026312
Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%)	Bausch & Lomb	24208058559
Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) stock	Bausch & Lomb	42702010305	This is used to make 2.5% Phenylepherine
Buprenex	Patterson	433502
Dexamethasone	APP Pharmaceuticals	63323051610
100% Ethanol	Thermo Scientific	615090040
70% Ethanol	Ricca Chemical Company	2546.70-5
Sterile GenTeal Lubricant Eye Gel	Novartis	78042947
Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops	Alcon	00065143105
hRPESC-RPE cells	Not available commercially		Please refer to "Reference #12" for cell isolation and mainteinance.
24-well plates	Corning	3526
Conical tubes (15 ml)	Sarstedt	62554002
Microcentrifuge cap with o-ring	LPS inc	L233126
Capless Microcentrifuge tubes (1.7 ml)	LPS inc	L233041
Centrifuge	Eppendorf	5804R
Sterile alcohol wipe	McKesson	58-204
Sterile cotton tip applicators	McKesson	24-106-2S
Sterile Weck-Cel spears	Beaver-Visitec International	0008680
Sterile surgical drapes	McKesson	25-515
Gauze	McKesson	16-4242
Nanofil syringe (10 ul)	World Precision Instruments	Nanofil
Nanofil beveled 33-gauge needle	World Precision Instruments	NF33BV-2
Insulin syringe needles 31-gauge	Becton Dickinson	328418
Rat toothed forceps	World Precision Instruments	555041FT
Vannas Micro Dissecting Spring Scissors	Roboz	RS-5602
Circulating water T pump	Stryker	TP700
Heating pad	Kent Scientific	TPZ-814
Animal anesthesia system	World Precision Instruments	EZ-7000
Balance	Ohaus	PA1502
Stereo microscope	Zeiss	Stemi 2000
Microscope light source	Schott	ACE series
Bioptigen Envisu Spectral Domain Ophthalmic Imaging System	Bioptigen	R2210
Sterile black marker pen	Viscot Industries	1416S-100
Miniature measuring scale	Ted Pella Inc	13623
Infrared Basking Spot Lamp	EXO-TERRA	PT2144	This is used as a heating lamp for animals during the post-surgical recovery  phase