Valutazione della vitalità neuronale utilizzando la fluoresceina diacetato-propidium ioduro a doppia colorazione nel granulo cerebrale Neuron Culture

Riepilogo

Questo protocollo descrive come misurare con precisione la vitalità neuronale utilizzando la doppia colorazione di Fluorescein diacetato (FDA) e Propidium Iodide (PI) nei neuroni granulari cerebellari coltivati, una coltura neuronale primaria utilizzata come modello in vitro nella ricerca neuroscienza e neurofarmacologia.

Abstract

I neuroni granulari cerebrali coltivati ​​primari (CGNs) sono stati ampiamente usati come un modello in vitro nella ricerca neuroscienze e neurofarmacologica. Tuttavia, la coesistenza di cellule gliali e neuroni nella cultura CGN potrebbe portare a pregiudizi nella valutazione accurata della vitalità neuronale. La misurazione della resistenza cellulare è stata utilizzata con la doppia acetato di fluoresceina (FDA) e Propidium Iodide (PI), valutando simultaneamente le cellule vitali e morte. Abbiamo utilizzato FDA-PI duplice macchia per migliorare le sensibilità dei test colorimetrici e per valutare la vitalità neuronale nei CGNs. Inoltre, abbiamo aggiunto macchie di DNA fluorescenti blu ( ad esempio, Hoechst) per migliorare l'accuratezza. Questo protocollo descrive come migliorare l'accuratezza della valutazione della vitalità neuronale utilizzando questi metodi nella cultura CGN. Utilizzando questo protocollo, il numero di cellule gliali può essere escluso utilizzando la microscopia a fluorescenza. Una strategia analoga può essere applicata per distinguere gli indesideratiAl cellule da neuroni in varie colture cellulari miste, come la coltura corticale primaria e la coltura ippocampale.

Introduzione

I test di citotossicità colorimetrica, come il saggio di bromuro di 3- (4, 5-dimetil-2-tiazolil) -2,5-difenil-2-H-tetrazolium bromuro (MTT), sono comunemente usati per misurare la vitalità cellulare in vitro . I neuroni granulari cerebrali coltivati ​​primari (CGNs) dai ratti sono sensibili a varie neurotossine, tra cui l'ione 1-metil-4-fenilpiridina, il perossido di idrogeno e il glutammato ^1,2 . Pertanto, le culture CGN possono essere utilizzate come un modello in vitro nel campo della neuroscienza. Le colture CGN possono contenere una varietà di cellule, compresi i neuroni e le cellule gliali, che possono rappresentare circa l'1% delle cellule totali nella coltura CGN. Tuttavia, le cellule gliali rispondono in modo diverso alle neurotossine rispetto ai neuroni, portando ad una bias nella vitalità neuronale misurata dai test colorimetrici ³ .

Nelle cellule vitali, il fluorescein diacetato (FDA) può essere convertito in fluoresceina mediante esterasi.Propidio Ioduro (PI) può interagire con il DNA dopo penetrare le cellule morte e può essere utilizzato per indicare l'apoptosi all'interno della cultura. Pertanto, la duplice colorazione FDA-PI può contemporaneamente valutare le cellule vitali e le cellule morte, suggerendo che la vitalità delle cellule può essere misurata più accuratamente combinando entrambi i metodi colorimetrici. Inoltre, aggiungendo Hoechst, una macchia fluorescente blu per i nuclei, l'accuratezza della vitalità cellulare potrebbe essere ulteriormente migliorata. Il protocollo qui presentato descrive la duplice colorazione FDA-PI e la tripla colorazione FDA-PI-Hoechst, che può essere utilizzata per analizzare accuratamente la vitalità neuronale in CGN coltivate in primari.

Questo protocollo sfrutta la visualizzazione e la distinzione di CGN e cellule gliali per le loro diverse dimensioni e forme. Dopo la colorazione, i numeri di neuroni vitali e neuroni morti sono contati da immagini rappresentative prese da microscopia fluorescente. Le cellule gliali di grandi dimensioni sono escluse dal confronto di tipiche CGNs tAken in modalità fluorescente con quelli presi in modalità di contrasto di fase. Una strategia simile può essere eseguita per misurare la vitalità neuronale in colture cellulari miste contenenti neuroni e cellule gliali, come le colture corticali primarie e le colture ippocampali.

Protocollo

Tutte le procedure sono state seguite dalla guida del National Institutes of Health (NIH) per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (pubblicazioni NIH n. 80-23, riveduta nel 1996) e sono state approvate dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) all'Università di Ningbo SYXK-2008-0110).

1. Preparazione di soluzioni e mezzi di cultura

Nota: i reagenti e le scorte devono essere preparati in condizioni sterili. Sterilizzare filtrando utilizzando un filtro con una porosità di 0,22 μm.

1. Preparare la soluzione di stock di poli-L-lisina (PLL) aggiungendo 5 mg di PLL a 10 ml di acqua doppia distillata (ddH2O). Sterilizzare filtrando. Aliquota e conserva la soluzione di riserva PLL a -20 ° C per diversi mesi.
2. Preparare il tampone di Krebs con l'aggiunta di 7,25 g di NaCl, 0,4 g di KCl, 0,14 g di NaH2P04, di 2,6 g di D-glucosio e di 5,94 g di acido 4- (2-idrossietil) -1-piperazinattanesolfonico a 100 ml di DdH _{2 <}/ Sub> O. Sterilizzare filtrando. Conservare la soluzione di tampone Krebs a 4 ° C per un massimo di un mese.
3. Preparare la soluzione 3,82% di Mg ₂ SO ₄ aggiungendo 3,82 g di Mg ₂ SO ₄ a 100 ml di ddH ₂ O. Sterilizzare filtrando. Conservare la soluzione Mg ₂ SO ₄ a 4 ° C per diversi mesi.
4. Preparare la soluzione di CaCl2 1,2% con l'aggiunta di 1,2 g di CaCl ₂ a 100 ml di ddH2O. Sterilizzare filtrando. Conservare la soluzione CaCl2 a 4 ° C per diversi mesi.
5. Preparare la soluzione 2M KCl aggiungendo 15 g di KCl a 100 mL di ddH ₂ O. Sterilizzare filtrando. Conservare la soluzione KCl a 4 ° C per diversi mesi.
6. Preparare la soluzione di stock di D-glucosio aggiungendo 1,8 g di D-glucosio a 100 ml di ddH2O. Sterilizzare filtrando. Aliquota e conservare la soluzione D-glucosio a 4 ° C per un massimo di un mese.
7. Preparare la cellula della citosina β-D-Arabinofuranoside (Ara-C)Ione aggiungendo 0,24 g di Ara-C a 10 ml di ddH2O. Sterilizzare filtrando. Aliquota e conservare la soluzione di riserva Ara-C a 4 ° C per diversi mesi.
8. Preparare 250 ml di mezzo di coltura (per 25-30 cuccioli) utilizzando 25 ml di Fetal Bovine Serum (FBS), 2,5 ml di glutammina 100x, 2,78 ml di soluzione 2M KCl e 2,5 ml di antibiotici 100x in Basal Medium Eagle (BME) . Regolare il volume a 250 ml e sterilizzare filtrando.
9. Preparare il mezzo 25K usando 2,5 ml di glutammina 100x, 2,78 ml di soluzione 2M KCl e 2,5 ml di antibiotici 100x in BME. Regolare il volume a 250 ml e sterilizzare filtrando.
10. Preparare il medium di 5K usando 2.5 mL di glutammina 100x e 2.5 mL di antibiotici 100X in BME. Regolare il volume a 250 ml e sterilizzare filtrando.
    NOTA: Il mezzo di coltura, mezzo medio 25K e 5K deve essere preparato di recente
11. Preparare la soluzione di stock FDA aggiungendo 5 mg di FDA a 1 mL di acetone. Conservare la soluzione di riserva FDA a 4 ° C per il magazzinaggio a lungo termine.
12. Preparare la soluzione di riserva PI aggiungendo 1 mg di PI a 1 mL di ddH ₂ O. Conservare la soluzione di riserva PI a 4 ° C per diversi mesi.
13. Preparare la soluzione di magazzino Hoechst aggiungendo 5 mg di Hoechst 33342 a 1 mL di ddH ₂ O. Conservare la soluzione di riserva di Hoechst a 4 ° C per diversi mesi.

2. Preparazione di soluzioni di dissezione

NOTA: fare questo 1 d prima della dissezione.

1. Preparare la soluzione di dissezione aggiungendo 15 ml di buffer Krebs, 1,2 ml di soluzione Mg ₂ SO ₄ di 3,82% e 0,45 g di albumina Bovine Serum (BSA) a 150 ml di ddH2O. Regolare il pH a 7,4 con NaOH.
2. Etichetta 5 tubi da 50 ml come segue: 1, 2, 3, 4 e 5.
3. Mettere 40 ml di soluzione di dissezione in una siringa da 50 ml con un filtro. Filtrare 30 mL di soluzione di dissezione nel tubo 1 e 2 mL ciascuno a più piatti da 35 mm di colture di cellule, che saranno utilizzati per la lavorazione dei tessuti.
4. Per tUbe 2, aggiungere 12,5 mg di tripsina in 50 ml di soluzione di dissezione. Mescolare completamente vorticando. Sterilizzare filtrando.
5. Al tubo 3, aggiungere 1, 2 mg di DNAse I, 7,8 mg di inibitore della soia trypsina e 150 μl di soluzione Mg ₂ SO ₄ del 3,82% in 15 ml di soluzione di dissezione. Mescolare completamente vorticando. Sterilizzare filtrando.
6. Al tubo 4, aggiungere 5 ml della soluzione dal tubo 3. Aggiungere 10,5 ml di soluzione di dissezione. Sterilizzare filtrando.
7. Al tubo 5, aggiungere 100 μl di soluzione Mg ₂ SO ₄ del 3,82% e 15 μl di 1,2% CaCl2 in 12,5 ml di soluzione di dissezione. Mescolare completamente vorticando. Sterilizzare filtrando.
8. Conservare tutti i tubi a 4 ° C prima dell'uso.

3. Rivestimento delle piastre di coltura cellulare

NOTA: fare questo 1 d prima della dissezione.

1. Aggiungere 1 mL di soluzione di stock PLL a 100 mL di ddH2O (concentrazione finale: 5 μg / mL). Plastica del cappottoPiastre di coltura a 6 pozzetti oa 12 pozzetti (2 mL per pozzetto per piastre di coltura a 6 pozzetti o 1 mL per pozzetto per piastre di coltura a 12 pozzetti) aggiungendo 5 μg / mL di soluzione di poli-L-lisina.
2. Incubare a temperatura ambiente per 1 giorno (oa 37 ° C per 2 ore). 1-2 h prima della dissezione, rimuovere la soluzione usando una pipetta. Lavare una volta con ddH ₂ O e asciugare nel cappuccio della coltura cellulare.

4. Trattamento di tessuti per 8 settimane Sprague-Dawley Rats.

1. Mettere un piatto da 100 mm sul ghiaccio. Decapitate i cuccioli di ratto nel piatto utilizzando una coppia di forbici sterilizzate.
2. Inserire le forbici nel magnum foramen e tagliare i due lati del cranio, dalle orecchie agli occhi. Sollevare il cranio usando un paio di pinze. Assicurarsi che l'intero cervello sia nel cranio. Isolare il cervelletto e inserirlo nel suddetto piatto da 35 mm utilizzando una coppia di pinze.
3. Lavorare sotto un microscopio di dissezione. Rimuovere le meningi ei vasi sanguigni con due coppie di pinze.
4. Tagliate i tessuti con una lama. Mettere i tessuti nel tubo 1. Centrifugare per 5 minuti a RT e 1.500 x g.
5. Aspirare il surnatante. Salva la pellet.
6. Aggiungere la soluzione nel tubo 2 al pellet. Risospendere agitando dolcemente.
7. Mettere il tubo in un bagno d'acqua di 37 ° C per 15 minuti. Scuotere delicatamente ogni 3 min.
8. Aggiungere la soluzione nel tubo 4 a questa soluzione. Agitare e centrifugare per 5 minuti a RT e 1.500 x g.
9. Aspirare il surnatante. Salva la pellet.
10. Aggiungere la soluzione nel tubo 3 per risospendere il pellet.
11. Preparare due tubi da 15 ml. Mettere metà delle cellule in ogni tubo. Pipette su e giù per 60-70 volte utilizzando una pipetta Pasteur a cotone per homogenizzare le cellule.
12. Aggiungere 3 ml della soluzione nel tubo 5 ad ogni tubo da 15 ml. Lasciarli sedere a RT per 10 min e quindi rimuovere con cura il surnatante con una pipetta Pasteur a cotone. Posizionare il surnatante in nuovi tubi da 15 ml e centrifugare per 5 minuti a RT e 1.500 x g.
13. UNSpira il surnatante. Salva la pellet.
14. Aggiungere un mezzo di coltura nella pellet per ottenere una densità di cellule di circa 1,5 x 10 ⁶ cellule / ml (circa 100 ml per 10 cuccioli).
15. Mettete le cellule in piastre di coltura e li coltivate nell'incubatore a 37 ° C e 5% CO ₂ .

5. Aggiunta di Ara-C e D-glucosio durante la coltura

1. Dopo 24 h, aggiungere la soluzione di base Ara-C (10 μL / pozzetto per le piastre di coltura a 12 pozzetti o 20 μL / pozzetto per piastre di coltura a 6 pozzetti, concentrazione finale: 1 mM) per inibire la crescita delle cellule gliali.
2. Il giorno 7, aggiungere 50 μL di soluzione di D-glucosio per pozzetto per le piastre di coltura a 12 pozzetti o 100 μl per pozzetto per le piastre di coltura a 6 pozzetti in modo che la concentrazione finale sia di 1 mM.

6. FDA-PI Double Staining e FDA-PI-Hoechst Triple colorazione in CGN Culture

1. Preparare la soluzione di lavoro FDA-PI aggiungendo 20 μL di soluzione di stock FDA (Concentrazione finale: 10 μg / mL) e 50 μL di soluzione acquosa di PI (concentrazione finale: 50 μg / mL) in 10 mi di PBS. Mescolare vorticando e posizionarlo su ghiaccio.
   1. Per la soluzione di lavoro di FDA-PI-Hoechst, aggiungere 20 μL di soluzione di stock FDA (concentrazione finale: 10 μg / mL), 50 μL di soluzione batterica PI (concentrazione finale: 50 μg / mL) e 10 μL di soluzione di magazzino Hoechst (Concentrazione finale: 5 μg / mL) in 10 mi di PBS. Mescolare vorticando e posizionarlo su ghiaccio.
      NOTA: Preparare di recente la soluzione di lavoro FDA-PI e la soluzione di lavoro FDA-PI-Hoechst prima dell'uso.
2. Prendere la piastra di coltura cellulare dall'incubatrice. Mettilo in ghiaccio.
3. Aspirare il mezzo di coltura e sostituirlo con PBS freddo.
   NOTA: La modifica della soluzione deve essere effettuata lentamente e con attenzione. Evitare di toccare le celle con le punte pipetta.
4. Aspirare il freddo PBS e sostituirlo con soluzione fredda FDA-PI o FDA-PI-Hoechst (500 μL / noiLl per le piastre di coltura a 12 pozzetti o 1 mL / pozzetto per le piastre di coltura a 6 pozzetti). Lasciare in ghiaccio per 5 min.
5. Aspirare la soluzione di lavoro FDA-PI o FDA-PI-Hoechst e aggiungere PBS freddo (100 μL / pozzetto per le piastre di coltura a 12 pozzetti o 50 μL / pozzetto per piastre di coltura a 6 pozzetti).
   NOTA: Le cellule non devono essere lasciate asciugare quando si scattano le immagini.
6. Prendere le immagini utilizzando la microscopia fluorescente. Usare un filtro di eccitazione con una banda passante di 450 - 490 nm. Rileva le emissioni di fluorescenza per FDA, PI e Hoechst rispettivamente a 520, 620 e 460 nm. Nelle stesse condizioni, scattare una foto in luce normale utilizzando la modalità di contrasto di fase della microscopia fluorescente.
   NOTA: Prendere le immagini entro 15 minuti dopo la colorazione FDA-PI o FDA-PI-Hoechst. Il tempo di esposizione è 100-300 ms e il guadagno analogico è 2.8x.

7. Valutazione della vitalità neuronale

1. Per la duplice colorazione FDA-PI, sovrapporre le immagini delle celle rilevate dopo il filtraggioDa diversi filtri di fluorescenza trascinando il livello FDA-positivo sul livello PI-positivo in un software di editor grafico.
   1. Regolare l'opacità del livello FDA-positive immettendo "50%" nel campo "Opacità" del pannello "Livelli". Unire due livelli facendo clic sul pulsante "Unisci visibile" nel menu "Livello". Impostare il contrasto delle immagini sovrapponi digitando "50" nel campo "Contrasto" sotto "Immagine" | "Regolazioni" | "Luminosità / Contrasto". Assicurarsi che non ci sia FDA e PI celle doppie positive nelle immagini sovrapposte.
2. Per la tripla colorazione FDA-PI-Hoechst, sovrapporre le immagini delle celle rilevate dopo filtrare diversi filtri di fluorescenza trascinando il livello FDA-positivo sul livello PI-positivo in un software di editor grafico. Regolare l'opacità del livello FDA-positive immettendo "50%" nel campo "Opacità" dei "Livelli &34; pannello.
   1. Unire due livelli facendo clic sul pulsante "Unisci visibile" nel menu "Livello". Trascinare il livello Hoechst-positive sul livello unito. Regolare l'opacità del livello Hoechst-positive immettendo "50%" nel campo "Opacità" del pannello "Livelli". Unire i due livelli facendo clic sul pulsante "Unisci visibile" nel menu "Livello".
3. Separare visivamente le cellule gliali grandi e irregolari da CGN confrontando le immagini scattate in modalità fluorescente con quelle effettuate in modalità di contrasto di fase - le cellule con diametri tre volte più grandi di CGNs sono considerate cellule gliali e vanno escluse.
4. Contare il numero di neuroni vitali e dei neuroni morti, rispettivamente, utilizzando un plugin di contatore cellulare in un programma di elaborazione delle immagini ( ad esempio, ImageJ) ⁴ .
   1. Per la duplice colorazione FDA-PI, contrassegnare manualmente le piccole cellule FDA-positive comeNeuroni vitali. Segnare manualmente le cellule PI-positive come neuroni morti. Per la tripla colorazione FDA-PI-Hoechst, contrassegnare manualmente le piccole cellule FDA- e Hoechst-double-positive come neuroni validi. Evidenziare manualmente le cellule PI- e Hoechst-double-positive come neuroni morti.
5. Calcolare la percentuale di vitalità neuronale usando la seguente equazione:% della vitalità neuronale = numero di neuroni vitali / numero di neuroni morti + numero di neuroni vitali) x 100%. Per ogni pozzo, scegliere cinque campi casuali e mediare la percentuale di vitalità neuronale.

Risultati

La doppia immunostaining di GAP43 (rosso) e GFAP (verde) è stata usata per analizzare la forma dei neuroni e delle cellule gliali rispettivamente di ^{2 , 5} . Entrambi i neuroni e le cellule gliali sono presenti nella coltura CGN. Le cellule gliali GFAP positive sono grandi e irregolari in forma, come indicato dalle frecce nelle immagini ( Figura 1 ). I saggi tradizionali per la vitalità delle cellule non possono...

Discussione

Questo protocollo è stato modificato da procedure precedentemente descritte ^{6 , 7} . I ricercatori hanno trascorso il tempo cercando di ridurre la crescita delle cellule non neuronali migliorando le condizioni di coltura dei neuroni primari in vitro ⁸ . Tuttavia, anche con condizioni di coltura migliorate, alcune cellule gliali rimangono. Inoltre, le cellule non neuronali sono necessarie nelle colture neuronali primarie perché a...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-lysine	Sigma	P2636
D-glucose	Sigma	G8270
Cytosine β-D-Arabinofuranoside	Sigma	C1768
Fetal bovine serum	Gibco	10099141	high quality FBS is essential for culture
100× glutamine	Gibco	25030081
100× anti-biotic	Gibco	15240062
BME medium	Gibco	21010046
Fluorescein diacetate	Sigma	F7378
Propidium iodide	Sigma	P4170
Hoechst 33342	Yesen	40731ES10
rabbit Anti-GAP43 antibody	Abcam	ab75810
mouse Anti-GFAP antibody	Cellsignaling	3670
Bovine serum albumin	Sangon Biotech	A602440
Trypsin	Sigma	T4665
DNAse	Sigma	D5025
Soybean trypsin inhibitor	Sigma	T9003
Pasteur pipette	Volac	Z310727	burn  the tip round before use
12-well cell culture plates	TPP	Z707783
6-well cell culture plates	TPP	Z707759	high quality cell culture plate  is essential for culture
Filter	Millipore	SLGP033RB
Pipet 5 ml	Excell Bio	CS017-0003
Pipet 10 ml	Excell Bio	CS017-0004
Dissect microscope	Shanghai Caikang	XTL2400
CO2 Incubator	Thermo Scientific	311
Fluorescence microscope	Nikon	TI-S
Fluorescence filter and emmision cubes	Nikon	B-2A, G-2A, UV-2A
Photo software	Nikon	NIS-Elements
Graphics editor softeware	Adobe	Photoshop CS
Image process softeware	NIH	ImageJ