Locust Antenlerinde Odorant Reseptör Genlerinin RNA ile Lokalizasyonu<em&gt; Yerinde</em&gt; Hibridizasyon

Özet

Bu yazıda, özellikle digoxigenin (DIG) etiketli veya biotin etiketli problar kullanılarak böcek antenlerinde, düşük seviyeli Odorant Reseptör (OR) genleri ve diğer genler için yerinde hibridizasyon protokolünde ayrıntılı ve etkili bir RNA açıklanmaktadır.

Özet

Böcekler, eksojen kimyasal sinyalleri algılamak için sofistike koku alıcı sistemler geliştirdiler. Bu kimyasal sinyaller, antenlerin kemosensilla olarak adlandırılan saç benzeri yapılara yerleştirilmiş Olfaktör Reseptör Nöronları (ORF) tarafından dönüştürülür. ORN membranlarında Odorant Alıcıların (OR'lerin) koku kodlamasında yer aldığı düşünülmektedir. Dolayısıyla, ORN'lere lokalize olan genleri tanımlayabilmek, OR genlerini tanımak için gereklidir ve daha ileri fonksiyonel in situ çalışmalar için temel bir temel sağlar. Böcek antenlerindeki spesifik OR'lerin RNA ekspresyon seviyeleri çok düşüktür ve histoloji için böcek dokusunun korunması zorlayıcıdır. Dolayısıyla, RNA in situ hibridizasyon ile belirli bir sensilla türüne bir OR'yi lokalize etmek zordur. Bu yazıda, özellikle düşük düzeyde ifade edilmiş böceklerin OR genleri için ayrıntılı ve son derece etkili bir RNA in situ hibridizasyon protokolü getirilmiştir. Buna ek olarak, spesifik bir OR Gen waBir işaretleyici olarak birlikte ifşa eden bir reseptör geni Orco kullanılarak çift renk floresan yerinde hibridizasyon deneyleri gerçekleştirerek belirlendi.

Giriş

En önemli kemoterapi organları olan böcek antikaları, Olfaktör Reseptör Nöronları (ORN'ler) tarafından innerve edilen, sensilla adı verilen, birçok saç benzeri yapılarla kaplıdır. Böcek ORN'lerin zarında, yedi transmembran alanı içeren bir protein türü olan Odorant Reseptörleri (OR'ler), bir odorant-kapılı iyon kanalı ^{1 , 2 , 3} olarak işlev gören bir heteromer oluşturmak için bir kollektör (ORCo) ile ifade edilir. Farklı OR'ler, kimyasal bileşikler ^{4 , 5 , 6'nın} farklı kombinasyonlarına tepki verir.

Locusts ( Locusta migratoria ) esas olarak önemli davranışları tetiklemek için koku alma ipuçlarını kullanır ⁷ . Locust OR'leri moleküler koku mekanizmalarını anlamak için önemli faktörlerdir. Belirli bir çekirge OR genini a. Nöronuna lokalize etmek.RNA tarafından morfolojik olarak spesifik sensillum tipi In Situ Hibridizasyon (RNA ISH), OR'lerin fonksiyonunu keşfetmenin ilk adımıdır.

RNA ISH, fizyolojik süreçler ve hastalık patogenezi ile ilgili bilgiler veren doku, hücreler ya da bütün yerinde belirli bir RNA sekansını ölçmek ve lokalize etmek için etiketli bir tamamlayıcı RNA probu kullanır. Digoxigenin etiketli (DIG etiketli) ve biyotin etiketli RNA probları, RNA hibridizasyonunda yaygın olarak kullanılmaktadır. Digoxigenin-11-UTP veya biotin-16-UTP ile RNA etiketleme, SP6 ve T7 RNA polimerazları ile in vitro transkripsiyonla hazırlanabilir. DIG ve biyotin etiketli RNA problarının şu avantajları vardır: non-radyoaktif; kasa; kararlı; Çok duyarlı; Son derece özeldir; PCR ve in vitro transkripsiyon kullanılarak üretilmesi kolaydır. DIG ve biyotin etiketli RNA probları kromojenik ve floresan olarak tespit edilebilir. DIG etiketli RNA probları, anti-digoksijin Alkali ile tespit edilebilir(NBT / BCIP) ile hassas ışıldayan kemilüminesan substratlar nitroblue tetrazolyum klorid / 5-bromo-4-kloro-3-indolil-fosfat toluidin tuzu veya optik mikroskop kullanılarak görüntülenebilen fosfataz (AP) konjüge antikorları veya 2 Konfokal bir mikroskop kullanılarak 4-kloro-2-metilbenzendiazonyum hemi-çinko klorid tuzu (Hızlı Kırmızı) ile birleştirilen bir 2-hidroksi-3-naftoik asit-2'-fenilanilid fosfat (HNPP). Biyotin etiketli RNA probları, anti-biyotin streptavidin at turp peroksidaz (HRP) konjuge antikorlarla, konfokal bir mikroskop kullanılarak fluorescein-tiramidlerle görselleştirilebilen antikorlarla tespit edilebilir. Böylece, DIG ve biotin etiketli RNA probları kullanılarak bir dilimdeki iki hedef geni saptamak için çift renkli floresan yerinde hibridizasyon gerçekleştirilebilir.

DIG ve / veya biyotin etiketli problarla RNA ISH, OR , iyonotropik reseptör, odorant bağlayıcı protein gibi olfaktöre bağlı genlerin lokalize edilmesi için başarıyla kullanılmıştırDrosophila melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria ve çöl keçiboynuzu Schistocera gregaria ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16'nın} böcek antenlerindeki duyu nöron membranı proteini. Bununla birlikte, böcek OR'ları için RNA ISH gerçekleştirirken iki önemli zorluk vardır: (1) OR genleri ( ORco hariç) düşük seviyelerde ve yalnızca birkaç hücrede ifade edilir, sinyal algılamayı çok zorlaştırır ve (2) böcek dokusunu korumak için Histoloji, morfolojinin korunması ve arka plan gürültüsünün düşük olması gibi zorlu olabilir. Bu yazıda böcekte OR genlerinin lokalizasyonu için RNA ISH'sini açıklayan ayrıntılı ve etkili bir protokolHem kromojenik hem de Tyramide Sinyali Yükseltme (TSA) algılama da dahil olmak üzere, antenler sunulmuştur.

Protokol

NOT: RNA bozunumunu sınırlamak için ıslak-otoklavlanmış damıtılmış su (60 dakika boyunca 121 ° C'de) ve ayrıca ıslak-otoklav malzemeleri kullanarak çözeltiler hazırlayın.

1. RNA ISH Antisens ve Sense Problarının Hazırlanması

1. Hedef gen amplifikasyonu ve saflaştırılması
   1. İlk olarak, fragmanların her iki ucuna adeneler ekleyen bir Taq DNA Polimerazı ile Lmigor1'in tam uzunlukta cDNA'sını ihtiva eden plazmitten L. migratoria OR1'in ( Lmigor1 , GenBank: JQ766965) 387 bp'lik iki katlı bir fragmanını üretin .
      1. 50 μL 2x reaksiyon karışımı, 4 μL duyu ve antisense primerler ( Tablo 1 ), 1 μL plasmid şablonu ve 41 μL RNaz içermeyen H ₂ O içeren 100 μL'lik son reaksiyon hacmi kullanın. Aşağıdaki PCR Protokol: 94 ° C'de 5 dakika, ardından 30 saniye için 94 ° C, 30 saniye boyunca 55 ° C ve 1 dakika boyunca 72 ° C'de 30 çevrim, Bunu 10 dakika boyunca 72 ° C takip etti.
      2. (: JQ766966 GenBank) ve LmigORco bölgesinin 1.251 bp'lik çift sarmallı fragmanı (GenBank: JN989549) LmigOR2 bölgesinin 1.303 bp'lik çift sarmallı fragmanını üretmek için aşağıdaki adımları tekrarlayın. Bu deneylerde kullanılan primerler Tablo 1'de sunulmuştur.
      3. 1x Tris-asetat-EDTA tamponu içerisinde PCR ürünlerini% 1.2 agaroz jel üzerinde çalıştırın ve etidyum bromid boyama kullanarak görselleştirin.
   2. Bu PCR ürünlerini bir jel özütleme kiti kullanarak ayıklayın.
      1. Elektroforezden sonra, jelden DNA bantlarını çıkarın ve jel dilimlerini 1.5 mL tüp içine yerleştirin. Ardından 0.1 g jel dilim başına 100 μL bağlama tamponu (Tampon PN) ekleyin. Hareketleyin ve jel dilim tamamen çözünene kadar 50 ° C'de inkübe edin.
      2. Toplama tüpüne bir CA2 adsorpsiyon sütunu yerleştirin ve 500 uL denge tamponu (Tampon BL) ekleyin. Bu, silika membranın soğurma kabiliyetini ve stabilitesini geliştirir. Centri1 dakika süreyle 12.400 xg hızla.
      3. Çözünmüş jel karışımını adsorpsiyon kolonu grubuna aktarın ve 2 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Ardından, 1 dakika için 12.400 xg'de tüpleri santrifüjleyin. Akışı atın ve adsorpsiyon sütununu toplama tüpüne tekrar takın.
      4. 600 μL yıkama solüsyonu (etanol ilave edildi, Tampon PW) iki kez ilave edin. 1 dakika için 12.400 xg'de santrifüjleyin. Akışı boşaltın ve adsorpsiyon sütununu toplama tüpüne tekrar takın.
      5. Toplama tüpünü boşaltın ve kalıntı etanolün buharlaşmasına izin vermek için 12.400 xg'deki sütun tertibatını 2 dakika yeniden santrifüjleyin.
      6. Adsorpsiyon sütununu temiz bir 1.5 mL santrifüj tüpüne dikkatlice aktarın. Pelleti 5-10 dakika havayla kurutun ve DNA'yı uygun bir hacimde ( örn. 30 mcL) nükleaz içermeyen suda yeniden çözün.
      7. Oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin. 2 dakika için 12.400 xg'de santrifüjleyin. Adsorpsiyon sütununu atın ve DNA'yı 4 ° C veya -20 ° C'de saklayın.
2. Rekombinant plazmidleri yapılandırın
   1. LmigOR1'in 387 bp'lik fragmanını, LmigOR2'nin 1.303 bp'si fragmanını ve Lmigorco'nun 1,251 bp'lik fragmanını, T4 DNA ligazı kullanarak eklenen DNA'ya komşu olan T7 (upstream) ve SP6 (downstream) RNA polimerazları için promotörler içeren bir T vektörüne bireysel olarak bağlayın . Takip eden 10 μL reaksiyon hazırlayın: 2x ligasyon tamponu 5 uL, T vektörü 1 μL, eklenen genin DNA'sının 3 uL'si (~ 100 ng) ve T4 DNA ligazının 1 μL'si ve 4 ° C'de O / N inkübe edin.
   2. LmigOR1 387 bp'lik bir fragman, LmigOR2 bölgesinin 1.303 bp'lik fragmanı ve bir 1.5 mL steril tüplerde kompetan Escherichia coli DH5a hücrelerine 50 uL ayrı ayrı LmigORco bölgesinin 1.251 bp'lik bir fragman ihtiva eden her bir rekombinant plazmidin 5 uL ekleyin.
      1. Nazikçe karıştırın ve tüpleri 30 dakika boyunca buz içine koyun ve daha sonra 42 saat boyunca 90 s inkübe edin° C. Onları 3 dk buza geri aktarın.
      2. Her tübe ampisilin olmadan 450 uL Luria-Bertani (LB) sıvı ortam ekleyin ve 37 ° C'de 1 saat boyunca 150 rpm'de bir çalkalayıcıda inkübe edin, E. coli DH5α'yı geri getirin.
      3. Her bir transformantın 100 uL'lik bir bölümünü alın ve bunları 50 ug / mL ampisilin, 24 ug / mL izopropil β-D-l-tiogalaktopiranosid (IPTG) ve 40 ug / mL 5-bromo-4 içeren LB katı substrat plakalarını inoküle etmek için kullanın -kloro-3-indolil-β-D-galaktopiranozit (X-gal).
      4. Bu plakaları, 18 saat boyunca 37 ° C'de sabit inkübatörde inkübe edin. Mavi beyaz tarama yöntemini kullanarak hedef rekombinant plazmidleri tarayın. Sanger sekanslama kullanarak hedef rekombinant plasmidlerin sıralamasını yapın ve üç OR geninin ekleme yönlerini belirleyin.
3. Rekombinant plazmidleri lineer hale getirmek için kısıtlama endonükleazları seçin
   1. Kısıtlama endonükleazlarını kullanın tŞapka sadece vektörün çoklu klonlama bölgesinde sindirmekle kalmaz aynı zamanda ekleme DNA'sını kesmeyin. Bu deneyde, 3 genin tamamı, T vektörüne vektörünkine karşılık gelen yönde yerleştirilir.
   2. Antisens probları üretmek için LmigOR1'in 387 bp'si , LmigOR2'nin 1,303 bp'si ve Lmigorco'nun 1,251 bp'si fragmanını içeren rekombinant plazmidleri lineer hale getirmek için Nco I sınırlandırma endonükleazı kullanın. Duyu sondalarını üretmek için Sp e I kısıtlama endonükleazı kullanın.
      NOT: Ekleme yönü vektöre karşılık geliyorsa, T7 sonundan itibaren eşsiz bir kısıtlama bölgesi rekombinant plazmiti doğrusallaştırmak için seçilir ve SP6 RNA polimeraz antisens probunu hazırlamak için kullanılır. SP6'nın sonundan itibaren eşsiz bir kısıtlama bölgesi rekombinant plazmiti lineer hale getirmek üzere seçilir ve sense probu hazırlamak için T7 RNA polimeraz kullanılır. Aksi takdirde, ekleme yönü tO zaman, SP6'nın sonundan itibaren eşsiz bir kısıtlama bölgesi rekombinant plazmiti lineer hale getirmek üzere seçilir ve antisens probunu hazırlamak için T7 RNA polimeraz kullanılır. T7'nin sonundaki benzersiz kısıtlama alanı, rekombinant plazmiti lineer hale getirmek üzere seçilir ve SP6 RNA polimeraz, duyu sondası hazırlamak için kullanılır.
4. Doğrusallaştırılmış rekombinant plasmidlerin saflaştırılması
   1. Özet 20 ug LmigOR1 387 bp'lik bir fragman, LmigOR2 bölgesinin 1.303 bp'lik fragmanı ve 10x tampon 10 uL ihtiva eden bir 100 uL reaksiyon Nco I kısıtlayıcı endonükleaz ile LmigORco bölgesinin 1.251 bp'lik bir fragman, 40 uL içeren üç rekombinant plazmidlerin her biri 37 ° C'de 3 saatlik bir inkübasyon takip 0.5 ug / uL plazmid, Nco I 3 uL ve RNaz içermeyen _H2O 47 uL.
   2. Benzer şekilde, bu üç rekombinant plazmitten her birinin 20 ug'sini sindirinSpe I restriction endonuclease'i söyleyin.
   3. Bu sindirilmiş plasmidleri, 1.1.2'de açıklandığı gibi bir jel özütleme kiti kullanarak saflaştırın. Bu özütlenmiş doğrusallaştırılmış rekombinant plasmidlerin konsantrasyonlarını spektrofotometri ile belirleyin ve 0.5 μg / μL'ye ayarlayın.
5. Antisens ve algılama probları hazırlayın
   1. Antisens ve duyu probları üretmek için T7 / SP6 RNA transkripsiyon sistemini kullanın. SP6 RNA polimeraz, in vitro olarak şablon olarak doğrusallaştırılmış rekombinant plazmidleri kullanarak bu üç OR geni için DIG ve biyotin etiketli antisens probları için çift sarmallı RNA'nın transkribasyonu için kullanılır. T7 RNA polimeraz, duyu sondaları üretmek için kullanılır. Reaksiyonu, 2 mcL 10x NTP karışımı, 2 μL 10X transkripsiyon tamponu, 1 uL RNaz inhibitörü, 2 μL T7 veya SP6 RNA polimeraz, 4 μL 0.5 μg / μL doğrusal hale getirilmiş plazmid ve 20 μL son hacim içinde gerçekleştirin. ardından 9 mL RNaz içermeyen _H2O37 ° C'de 3 saat süreyle inkübe edildi.
   2. DIG ve biotin etiketli antisens ve sensleri 37 ° C'de 1 μL DNaz ile 30 dakika inkübe edin. 2.5 μL 5 M LiCl ve 75 μL mutlak etanol ekleyin, sonra reaksiyonları -70 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
   3. 15.000 xg'de 30 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatle boşaltın. Çökeltiyi yıkamak için 150 μL% 70 etanol ekleyin. % 70 etanol (1 L), steril damıtılmış suya (263.2 mL)% 95 etanol (736.8 mL) ekleyerek hazırlayın.
   4. Yeniden 4 ° C'de 30 dakika süreyle 15.000 xg'de santrifüjleyin ve pelleti oda sıcaklığında 5-10 dakika boyunca hava ile kurutun. RNA antisens çözülür ve probları algılamak için RNaz içermeyen _H2O 25 uL ekleyin.
   5. Eklenen genin uzunluğu 1 kb'den fazla ise, daha sonra RNA antisensını parçalayın ve bir bikarbonat-karbonat tampon solüsyonlarında inkübe ederek ortalama 300 bp'lik bir uzunluğa kadar sondaları tarayın. Reaksiyonu, 50 μL son hacimde gerçekleştirin, cRNA, prob ontaining 25 uL ve bikarbonat, karbonat tamponu çözeltisi 25 uL (80 mM NaHCOj _3, 120 mM _{Na2 CO3,} pH 10.2) 60 ° C'de ilave edildi. Gerekli olan hidroliz süresi önceden yayınlanmış bir formül ^{17 ile verilmiştir} .
   6. Reaksiyonu durdurmak için 5 μL% 10 asetik asit ilave edin. Bu deneyde LmigOR2 ve Lmigorco antisens ve sense sondalarını sırası ile 24 ve 23 dakika boyunca parçalayın .
      T = (L _o -L _f ) / kXL _o XL _f
      L _o = başlangıç ​​fragman uzunlukları kb olarak
      L _f = son fragman uzunlukları kb cinsindendir
      K = hidroliz için hız sabiti, yaklaşık 0.11 kb ^-1 dak ^-1
      T = dakikada hidroliz süresi
   7. Son olarak, 250 μL hibridizasyon tamponu ekleyin ve -80 ° C'de saklayın.

2. Kriyostat Bölümlerinin Hazırlanması

1. Önceden soğutun-24 ° C'ye kadar mikrotom.
2. Aktif olan ve bozulmamış anteni bulunan yeni çıkma yetişkin çekirge seçin. Steril usturalar kullanarak antenleri 2-3 mm'lik parçalara kesin.
3. OCT bileşimini dondurucu mikrotom tutucuya koyun ve bileşime yatay olarak bir veya iki örnek koyun. Ardından, tutucu donma mikrotomuna -24 ° C'de aktararak bileşik donana kadar dengeye getirin. Tutacağı çıkarın ve örnekleri küçük bir bileşik ile örtün. Tutacağı, -24 ° C'de tekrar en az 10 dakika boyunca donma mikrotomuna aktarın ( Şekil 1 ).
   NOT: Bileşikte kabarcıklarıkullanmaktan kaçının.
4. Tutucuyı örneklerle birlikte dondurma mikrotomuna sabitleyin, ardından donmuş örnekleri -24 ° C'de 12 um kalınlığında kesitlere bölün.
5. Dilimleri teker teker slaytlara (25 x 75 mm, nükleaz içermeyen) çözün ve 10 dakika hava ile kurutun.

3. Sabitleme Bölümleri

1. Kriyostat hazırlandıktan sonraSlaytları plastik bir kutuya (~ 100 x 40 x 80 mm) koyun ve 4 ° C'de 30 dakika süreyle% 4 paraformaldehit solüsyonu (PFA) içinde slaytlar kuluçkaya yatarak dokuları düzeltin.
2. Slaytları 1X Fosfat Tamponlu Tuz (PBS) 1 dakika yıkayın.
3. Alkalin proteinleri ortadan kaldırmak için, slaytları 0.2 M HC1'ye 10 dakika boyunca aktarın.
4. Nükleik asidin yüzey proteinini ortadan kaldırmak için, slaytları 1 dakika boyunca% 1 Triton X-100 ile 1XPBS'ye aktarın.
5. Slaytları 1x PBS'de 30 saniye süreyle iki kez yıkayın.
6. Son olarak, slaytları formamid solüsyonunda 10 dakika süreyle 4 ° C'de durulayın.

4. Hibridizasyon

1. Antisens ve duyu sondalarını hazırlayın
   1. 1.5 mL nükleazsız tüplerde RNA antisensini veya duyu sondalarını seyreltmek için hibridizasyon tamponu kullanın. Bu deneyde, tüm antisens ve algılama probları ( Lmigor1, LmigOR2 ve LmigOrco ) için 1 μL prob ekleyerek 99 μL hibridizasyon tamponu. Genel olarak, 1: 100 seyreltme antisens problarının kullanılması bu protokolü kullanarak önemli pozitif sinyaller ve düşük arka planlar üretir.
   2. Kromojenik tespit için, DIG etiketli probları ayrı ayrı sulandırın.
   3. TSA tespiti için, biyotin etiketli LmigOR1 ile biotin etiketli LmigOrco problar veya DIG-labeled LmigOR2 ile LmigOR1 DIG etiketli hibridizasyon tamponu içinde bir araya probları seyreltin.
   4. Seyreltileri 65 ° C'de 10 dakika boyunca ısıtın ve buz üzerinde en az 5 dakika bekletin.
2. melezleme
   1. Slaytları boşaltın ve doku bölümlerine seyreltilmiş antisens ve duyu probları (Adım 4.1) 100 uL ekleyin. Daha sonra, doku bölümleri üzerine lamelleri (24 mm x 50 mm, nükleaz içermez) yerleştirin.
   2. Kaplamalı yatakları yatay olarak nemli bir kutuya (~ 300 x 180 x 50 mm ³ ; Şekil 2 ) yerleştirin ve55 ° C'de 22 saat. Ortamı nemli tutmak için kutusunun altına formamid solüsyonu veya 1X PBS ekleyin, ancak slaytları sıvıya daldırmayın.
3. Yıkama ve bloke etme.
   1. Hibridizasyon sonrasında, lamelleri dikkatlice çıkarın. Slaytları 60 ° C'de 0.1x Salin Sodyum Sitrat (SSC) içinde 30 dakika boyunca iki kez yıkayın.
      NOT: Yıkama, slaytları plastik bir kapa yerleştirilen ve hafifçe bir rocker (~ 50 dev / dak; Şekil 2 ) üzerinde çalkalanan bir slayt tutucusuna yerleştirme anlamına gelir.
   2. Slaytları 30 saniye boyunca 1x Tris Tamponlu Tuz (TBS) içinde durulayın.
   3. Her slaytta% 0.03 Triton X-100 takviyeli TBS'de 1 mL engelleyici reaktif ekleyin ve 30 dakika inkübe edin. Daha sonra engelleme çözümünü atın.
4. İmmünohistokimya.
   1. Kromojenik saptama için 750 ünite (U) / mL anti-digoxigenin AP-konjuge antikoru seyreltmek için TBS'de bloke etme reaktifi kullanın1.5 U / mL AP çözeltisinden dy. Kaplanmış (24 mm x 50 mm) slayt başına 100 μL AP çözeltisi ekleyin.
   2. TSA saptaması için 750 u / mL anti-digoksigenin AP-konjüge antikoru ve anti-biotin streptavidin HRP-konjuge antikoru AP / HRP çözeltisine seyreltmek için TBS'de bloke etme reaktifini kullanın. Kaplanmış (24 mm x 50 mm) slayt başına 100 μL AP / HRP çözeltisi ekleyin.
   3. Slaytları nemli bir kutu içinde inkübe edin ( Şekil 2 ), 60 dakika boyunca 37 ° C'de. Kutuyu nemli tutmak için formamid solüsyonu veya 1X PBS kullanın, ancak hantal değil.

5. Boyama

1. Lamelleri dikkatlice çıkarın. Slaytları,% 0.05 Tween-20 ile takviye edilmiş 1x TBS'de 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. Slaytları DAP-tamponunda durulayın (kromojenik saptama: pH 9.5; TSA saptama: pH 8.0) 5 dakika boyunca yıkayın.
2. Boyama (kromojenik tespit)
   1. 100 uL NBT (375 μg / mL) / BCIP (188 μg / mL) substrat çözeltisi (DAP içinde seyreltilmiş;PH 9.5) her slayta. Slaytlara lamelleri (24 x 50 mm) dikkatlice yerleştirin.
   2. Slaytları, nemli bir kutuya substrat solüsyonuyla 10 dakika boyunca inkübe edin - O / N, 37 ° C'de.
      NOT: Mikroskop altında zaman zaman slaytlara bakarak gelişimini kontrol edin.
   3. Gelişme hazır olduğunda, slaytları suya aktararak reaksiyonu durdurun.
3. Boyama (TSA algılama)
   1. Şırınga filtresinden (0.22 μm; Şekil 2 ) HNPP (100 μg / mL) / Hızlı Kırmızı (250 μg / mL) substratını taşımak için bir şırınga kullanın.
   2. Bir lamel ile kaplı başına 100 uL HNPP / Hızlı Kırmızı substrat ekleyin (24 x 50 mm). Slaytları, oda sıcaklığında HNPP / Hızlı Kırmızı substrat ile 30 dakika inkübe edin.
   3. Lamelleri dikkatlice çıkarın ve slaytlar, 0.05% Tween-20 ile takviye edilmiş 1X TBS'de 5 dakika süreyle üç kez yıkayın.
   4. 100 uL TSA substratı / kaplanmış (24 x 50 mm ² ) kaydırın. Slaytları TSA substratı ile oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
   5. Lamelleri dikkatlice çıkarın ve slaytlar, 0.05% Tween-20 ile takviye edilmiş 1x TBS'de 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
4. Slaytları PBS / gliserol (1: 3) içine gömün.
   NOT: Bu prosedürleri tamamladıktan sonra, floresan sinyalinin çabucak söndürüleceği için, slaytlar en kısa sürede gözlemlenmelidir.

6. Gözlem

1. Kromojenik tespit
   1. Optik mikroskop kullanarak doku bölümlerine dikkat edin. Kromojenik tespitin sonuçlarını gözlemlemek için 10X, 20X ve 40X objektif lensleri seçin.
   2. Sonuçları analiz etmek ve görüntüleri yakalamak için DP-BSW yazılımını kullanın.
2. TSA algılama
   1. Konfokal mikroskop kullanarak doku bölümlerine dikkat edin. DIG etiketli genler 543 nm ışık altında kırmızı renkte gözlemlenmeli ve biyotin etiketli genler488 nm ışık altında gözlemlendi, yeşil bir renk ortaya çıktı. Ortaya çıktıklarında sarı renkte.
   2. Sırasıyla TSA bulgularının gözlemlenmesi için 20X ve 40X objektif lensleri seçin.
   3. Sonuçları analiz etmek ve görüntüleri yakalamak için FV1000 yazılımını kullanın.

Sonuçlar

Kromojenik tespit ile, her yetişkin antenal kesitteki antennal hücrelerin küçük bir alt grubu, DIG etiketli LmigOR1 ve LmigOR2 antisens probları ile gösterildi ( Şekil 3 ). Lmigor1 ve LmigOR2'yi lokalize etmek için ardışık kesitlerdeki RNA ISH, iki geni eksprese eden antennel hücrelerin , Lmigorco'yu eksprese eden ORN kümelerinde bulunduğunu gösterdi; bu, varsayılan L...

Tartışmalar

OREC dışındaki OR genlerinin ekspresyon seviyeleri böcek antenlerinin histolojik dilimlerini korumak için çok zordur, böcek antenlerinde OR genlerini lokalize etmek için RNA ISH gerçekleştirmek zordur. Buna ek olarak, TSA algılama da çok zor. Bu sorunları çözmek için aşağıdaki tedbirler alınmalıdır. Antenler, morfolojilerini slaytta koruyan ince ve yumuşak antennal kütikülleri olan yeni molting erişkin çekirgelerinden seçilir. Donmuş numuneler 12 um kalınlığında kesitlere bölü...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
2×TSINGKETM Master Mix	TSINGKE, China	TSE004
RNase-free H2O	TIANGEN, China	RT121-02
REGULAR AGAROSE G-10	BIOWEST, SPAIN	91622
Binding buffer	TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China	DP209-02
Balance buffer	TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China	DP209-02
Wash solution	TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China	DP209-02
T Vector	Promega, USA	A362A
T4 DNA Ligase	Promega, USA	M180A
Escherichia coli DH5α	TIANGEN, China	CB101
Ampicillin	Sigma, USA	A-6140
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Inalco, USA	1758-1400
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside	SBS Genetech, China	GX1-500
Nco I	BioLabs, New England	R0193S
Spe I	BioLabs, New England	R0133M
DIG RNA Labeling Kit	Roche, Switzerland	11175025910
Biotin RNA Labeling Kit	Roche, Switzerland	11685597910
DNase	DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland	11175025910
LiCl	Sinopharm, China	10012718
Ethanol	Sinopharm, China	10009257
Acetic acid	BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China	10000292
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands	4583
Slides	TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China	FISH0010
HCl	Sinopharm, China	80070591
Millex	Millipore, USA	SLGP033RS
Tween 20	AMRESCO, USA	0777-500ML
Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt	Roche, Switzerland	11175041910
Glycerol	Sinopharm, China	10010618
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
1×Tris-acetate-EDTA	Sigma, USA	V900483-1KG	0.04mol/L Tris-Base
1×Tris-acetate-EDTA	BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China	10000292	0.12%acetic acid
1×Tris-acetate-EDTA	Sigma, USA	03677	Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)
Luria-Bertani (LB) liquid medium	Sinopharm, China	10019392	10g/L NaCl
Luria-Bertani (LB) liquid medium	MERCK, Germany	VM335231	10g/L Peptone from casein (Tryptone)
Luria-Bertani (LB) liquid medium	MERCK, Germany	VM361526	5g/L Yeast extract
LB solid substrate plate	Sinopharm, China	10019392	10g/L NaCl
LB solid substrate plate	MERCK, Germany	VM335231	10g/L Peptone from casein (Tryptone)
LB solid substrate plate	MERCK, Germany	VM361526	5g/L Yeast extract
LB solid substrate plate	WISENT ING, Canada	800-010-CG	15g/L Agar Bacteriological Grade
10×phosphate buffer saline (pH7.1)	Sinopharm, China	10019392	8.5%NaCl
10×phosphate buffer saline (pH7.1)	Sigma, USA	V900041-500G	14mM KH2PO4
10×phosphate buffer saline (pH7.1)	Sigma, USA	V900268-500G	80mM Na2HPO4
10×Tris buffered saline (pH7.5)	Sigma, USA	V900483-1KG	1M Tris-Base
10×Tris buffered saline (pH7.5)	Sinopharm, China	10019392	1.5M NaCl
Detection Buffer (DAP)       chromogenic detection pH9.5       TSA detection pH8.0	Sigma, USA	V900483-1KG	100mM Tris-Base
Detection Buffer (DAP)       chromogenic detection pH9.5       TSA detection pH8.0	Sinopharm, China	10019392	100mM NaCl
Detection Buffer (DAP)       chromogenic detection pH9.5       TSA detection pH8.0	Sigma, USA	V900020-500G	50mM MgCl2·6H2O
20×saline-sodium citrate (pH7.0)	Sinopharm, China	10019392	3M NaCl
20×saline-sodium citrate (pH7.0)	Sigma, USA	V900095-500G	0.3M Na-Citrate
4% paraformaldehyde solution (pH9.5)	Sigma, USA	V900894-100G	4% paraformaldehyde
4% paraformaldehyde solution (pH9.5)	Sigma, USA	V900182-500G	0.1M NaHCO3
Sodium Carbonate Buffer (pH10.2)	Sigma, USA	V900182-500G	80mM NaHCO3
Sodium Carbonate Buffer (pH10.2)	Sigma, USA	S7795-500G	120mM Na2CO3
Formamide Solution (pH10.2)	MPBIO, USA	FORMD002	50% Deionized Formamide
Formamide Solution (pH10.2)			5×saline-sodium citrate
Blocking Buffer in Tris buffered saline	Roche, Switzerland	11175041910	1% Blot
Blocking Buffer in Tris buffered saline	AMRESCO, USA	0694-500ML	0.03% Triton X-100
Blocking Buffer in Tris buffered saline			1×Tris buffered saline
Alkaline phosphatase solution	Roche, Switzerland	11175041910	1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody
Alkaline phosphatase solution			Blocking Buffer in Tris buffered saline
Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution	Roche, Switzerland	11175041910	1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody
Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution	TSA kit, Perkin Elmer, USA	NEL701A001KT	1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody
Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution			Blocking Buffer in Tris buffered saline
Hybridization Buffer	MPBIO, USA	FORMD002	50% Deionized Formamide
Hybridization Buffer			2×saline-sodium citrate
Hybridization Buffer	Sigma, USA	D8906-50G	10% dextran sulphate
Hybridization Buffer	invitrogen, USA	AM7119	20 µg/ml yeast t-RNA
Hybridization Buffer	Sigma, USA	D3159-10G	0.2 mg/ml herring sperm DNA
2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate	Roche, Switzerland	11758888001	1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate (10mg/ml)
2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate	Roche, Switzerland	11758888001	1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25mg/ml)
2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate			Detection Buffer
Tyramide signal amplification substrate	TSA kit, Perkin Elmer, USA	NEL701A001KT	2% fluorescein-tyramides
Tyramide signal amplification substrate	TSA kit, Perkin Elmer, USA	NEL701A001KT	Amplification Diluent
Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrument
Freezing microtome	Leica, Nussloch, Germany	Jung CM300 cryostat
Spectrophotometer	Thermo SCIENTIFIC, USA	NANODROP 2000
Optical microscope	Olympus, Tokyo, Japan	Olympus IX71microscope
Confocal microscope	Olympus, Tokyo, Japan	Olympus BX45 confocal microscope