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  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Assorbimento della dopamina sinaptosomiali e strumenti sperimentali rappresentano di analisi di cromatografia liquida ad alte prestazioni per indagare l'omeostasi della dopamina nei topi valutando la funzione del trasportatore della dopamina e livelli della dopamina in tessuto striatal, rispettivamente. Qui presentiamo i protocolli per misurare il contenuto di tessuto di dopamina e di valutare la funzionalità del trasportatore della dopamina.

Abstract

Dopamina (DA) è un neurotrasmettitore modulatory controllo attività motoria, i processi di ricompensa e funzione conoscitiva. Danno della neurotrasmissione dopaminergica (DAergic) è fortemente associato con diverse malattie del sistema nervoso centrale-collegata come morbo di Parkinson, disordine di iperattività di deficit di attenzione e farmaco dipendenza1,2 ,3,4. Delineare meccanismi di malattie riguardanti lo squilibrio DA è dipende criticamente su modelli animali di imitare gli aspetti delle malattie, e quindi sono importanti per fornire nuove conoscenze e terapeutiche possibili protocolli che valutano le parti specifiche di omeostasi DA obiettivi per queste malattie.

Qui, vi presentiamo due protocolli sperimentali utili che quando combinati forniscono una lettura funzionale del sistema DAergica in topi. I parametri biochimici e funzionali su DA omeostasi sono ottenuti attraverso la valutazione dei livelli di DA e della dopamina (DAT) trasportatore funzionalità5. Quando si esamina il sistema DA, la capacità di misurare in modo affidabile i livelli endogeni di DA del cervello adulto è essenziale. Pertanto, vi presentiamo come eseguire cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) sul tessuto cerebrale dai topi per determinare i livelli di DA. Eseguiamo l'esperimento sul tessuto da striato dorsale (dStr) e nucleo accumbens (NAc), ma il metodo è adatto per altre aree cerebrali innervati DA anche.

DAT è essenziale per la ricaptazione della DA nel terminale presinaptico, controllando così l'attività temporale e spaziale di DA. rilasciato Nel valutare l'omeostasi DA conoscere i livelli e funzionalità di DAT nello striato è di grande importanza. Qui, forniamo un protocollo che consente contemporaneamente dedurre informazioni sui livelli di superficie e funzione usando un'analisi di assorbimento sinaptosomiale6 DA.

Attuali metodi combinati con protocolli standard immunoblotting forniscono il ricercatore con opportuni strumenti per caratterizzare il sistema DAergica.

Introduzione

Dopamina (DA) è un neurotrasmettitore modulatory critico per il comportamento del motore, la ricompensa e la funzione conoscitiva1,7,8,9. Squilibri nell'omeostasi DA sono implicati in diverse patologie neuropsichiatriche come disordine di iperattività di deficit di attenzione, tossicodipendenza, depressione e morbo di Parkinson1. DA viene rilasciato dal neurone presinaptico nella fessura sinaptica, dove lega a ed attiva i recettori sulla membrana pre- e postsinaptico, trasporto così ulteriormente il segnale. Il livello di DA nella sinapsi dopo il rilascio è controllato da DAT3,10, spazialmente e temporalmente. Il trasportatore sequestra dallo spazio extracellulare e così sostiene la fisiologica DA livelli3,11. Rimozione genetica di DAT nei topi provoca un fenotipo di hyperdopaminergic caratterizzato dai livelli elevati DA sinaptica, deplezione intracellulare DA piscine e profondi cambiamenti nella postsinaptica DAergica segnalazione10,12.

Qui, vengono presentati due protocolli separati, un metodo di misura DA contenuto del tessuto e l'altro per valutare la funzionalità del DAT. combinata con l'analisi di superficie biotinylation descritto da Gabriel et al.13 questi due metodi forniscono informazioni su DA livelli di contenuto e funzionali di DAT per una valutazione approfondita dell'omeostasi DA. Con questi metodi DA omeostasi dei vari modelli di malattia o topi transgenici può essere caratterizzato e descritto. Questi strumenti sono stati implementati e ottimizzati e sono uso standard nei nostri laboratori. Saggi di corrente hanno servito per studiare le conseguenze sull'omeostasi DA alterare il C-terminale di DAT14 o esprimendo la Cre ricombinasi sotto la tirosina idrossilasi (TH) promotore 5.

Protocollo

le linee guida dell'Ispettorato di sperimentazione animale danese (numero di autorizzazione: 2017-15-0201-01160) è stata seguita e gli esperimenti effettuati in una struttura completamente AAALAC accreditato sotto la supervisione di un locale benessere degli animali Comitato.

1. sinaptosomiali assorbimento della dopamina (metodo 1)

Nota: questo protocollo è per la valutazione parallela dei due cervelli, ma può essere utilizzato con successo per eseguire esperimenti di assorbimento DA sinaptosomiali con quattro cervelli in parallela.

  1. Preparati
    1. etichetta 48 mL 1,5 micro-centrifuga tubi per tabella 1 (24 per ogni cervello). Utilizzare colori diversi per i tubi appartenendo a ogni cervello per evitare confusione tra i campioni
    2. etichetta 51 scintillazione tubi #1-51.
    3. Posto tampone fosfato (PBS) sul ghiaccio. Questo verrà utilizzato per mantenere il cervello refrigerati.
    4. Attivare la centrifuga per consentire pre-raffreddare a 4 ° C.
    5. Pre-pesare due provette da micro-centrifuga per ottenere il peso esatto del tessuto durante la preparazione sinaptosomiale (punto 2.6).
      6. Buffer di
    6. Prepare omogeneizzazione mescolando 4 mM HEPES e 0,32 M saccarosio. Regolare il pH a 7,4 e tenere il ghiaccio
      Nota: Omogeneizzazione buffer può essere mantenuto in aliquote a-20 ° C e scongelato il giorno dell'esperimento.
      7. Buffer di assorbimento
    7. preparare combinando le seguenti: 25mm HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO 4, 1 millimetro di acido ascorbico (0,194 g/L), 5 mM D-glucosio (0,991 g/L). Regolare il pH a 7.4 con NaOH (conduce a una concentrazione di sodio di circa 130 mM) e tenere il ghiaccio
      Nota: Per 2 cervelli, preparare 1500 mL di tampone per l'assorbimento. Preparare il tampone di assorbimento come un 10 x soluzione di riserva senza acido ascorbico e glucosio conservato a 4 ° C. rendere 1 x soluzione di lavoro appena il giorno, un'integrazione con acido ascorbico e del glucosio. Regolare il pH con NaOH 7.4.
    8. Preparare l'assorbimento buffer + ligando combinando le seguenti: 25mm HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaC l2, 1,2 mM MgSO 4, 1 millimetro di acido ascorbico (0,194 g/L), 5 mM D-glucosio (0,991 g/L), 1 μM pargyline, desipramina nM 100, 10 nM Inibitore della catecol-O-metil-transferasi (COMT). Regolare il pH 7.4 con NaOH e tenere il ghiaccio
      Nota: Utilizzare 50 mL di tampone per l'assorbimento e aggiungere ligando. Pargyline è aggiunto per aiutare a prevenire la degradazione di DA ossidazione attraverso della monoamina ossidasi (MAO). Inibitore COMT (RO-41-0960) viene aggiunto a prevenire il degrado di DA (catecolamine in generale) attraverso COMT. Desipramina è aggiunto per inibire l'assorbimento attraverso i trasportatori di serotonina e noradrenalina e quindi rendere i risultati di assorbimento specifico per DAT.
    9. Preparare l'assorbimento buffer + ligando + cocaina combinando le seguenti: 25mm HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO 4, 1 millimetro di acido ascorbico (0,194 g/L), 5 mM D-glucosio (0,991 g/L), 1 μM pargyline, desipramina nM 100 , 10 nM COMT inibitore, cocaina 500 μM. Regolare il pH a 7.4 con NaOH e tenere il ghiaccio
      Nota: Utilizzare 7 mL di tampone di assorbimento + ligando e aggiungere la cocaina. Cocaina è aggiunto per ottenere una misurazione di sfondo dell'assorbimento DA non specifici per sottrarre dai dati, lasciando solo l'assorbimento di DAT-specifici (poiché SERT e NET sono inibiti da desipramina, come descritto sopra). In alternativa, un inibitore altamente potente e specifico di DAT GBR-12935, può essere utilizzato invece.
      Importante: Tenere tutto su ghiaccio d'ora in .
  2. Sinaptosomiali preparazione
    1. sacrificare un mouse in un momento di dislocazione cervicale e decapitazione.
    2. Tagliare la pelle con le forbici per rivelare il cranio e tagliare qualsiasi tessuto in eccesso posteriore di sinistra del cranio da decapitazione. Tagliare il cranio con piccole Forbici rette lungo la sutura ed anteriormente possibile finire.
    3. Mettere le punte di due forbici in ogni occhio del mouse e tagliare attraverso il cranio per rimuovere il resto del cranio e il cervello intatto. Rimuovere il cervello e inserirlo nella gelida PBS rapidamente. Ciò manterrà freddo, mentre il secondo cervello è dissecato.
    4. Utilizzando una matrice di cervello, sezionare una fetta della corona 3 mm dello striato (anteriore-posteriore: +1,5 mm a-1,50 mm) seguita da una dissezione più fine con un perforatore. Vedere la Figura 1 per punzone area.
    5. Mantenere il tessuto sul ghiaccio a tutte le volte andare avanti.
    6. Trasferire il tessuto in una provetta da 1,5 mL micro-centrifuga per la pesatura.
      Nota: Questo peso verrà utilizzato nel passaggio 1.2.14.
    7. 1.2.1-1.2.6 passaggio ripetere per il secondo cervello.
    8. Una volta che il peso è stata ottenuta per entrambi i cervelli, trasferire il tessuto a un bicchiere di omogeneizzazione contenente 1 mL di tampone di omogeneizzazione ghiacciata.
    9. Omogeneizzare il tessuto con un pestello guidato motore a 800 giri/min, 10 colpi anche.
      Nota: Un colpo è uguale a uno su e giù per azione, il primo colpo dovrebbe essere circa 5 s, quanto segue: 3-4 s. omogeneizzazione in mezzo isotonico è importante per prevenire la rottura dei sinaptosomi 6. Utilizzando la forza appropriata e mezzo isotonico permetterà i terminali presinaptici reseal inclusione citoplasma, vescicole sinaptiche, i mitocondri e citoscheletro 15.
    10. Trasferire l'omogeneizzato a una micro-centrifuga da 1,5 mL e raccogliere l'omogenato rimanente dal vetro omogeneizzazione risciacquando con 0,5 mL di tampone di omogeneizzazione ulteriori.
    11. Tenere il campione sul ghiaccio mentre il tessuto da altri cervello è omogeneizzato. Eseguire i due cervelli in parallelo in passaggi 1.2.12-1.2.13.
    12. Pellet di nuclei e delle cellule di detriti da centrifugazione (1.000 x g, 10 min, 4° C).
    13. Trasferire il surnatante (S1) (contenente le membrane cellulari ed il citoplasma) al nuovo per microcentrifuga da 1,5 mL e centrifugare a 16.000 x g per 20 min a 4 ° C.
    14. Scartare il surnatante (contenente citoplasma) e risospendere il pellet (P2) (contenente grezze sinaptosomi) nel buffer di omogeneizzazione 40 μL / tessuto di mg (in base al peso ottenuto nel passaggio 1.2.6). Risospendere delicatamente la frazione sinaptosomiale grezza con una pipetta p1000 come troppa forza si romperà i sinaptosomi.
      Nota: È importante finire con almeno 280 μL. In caso contrario, sarà necessario diluire con più di 40 µ l per mg. 1.2.1-1.2.13 passaggi devono essere eseguiti più velocemente possibile e tutto deve essere tenuta su ghiaccio. Appena synaptosomes grezzo sono stati risospesi in buffer di omogeneizzazione sono abbastanza stabili, finché sono tenute il ghiaccio 6 , 15 , 16.

2. Esperimento di assorbimento

  1. aggiungere 440 μL assorbimento buffer + ligando + cocaina per l'area 12 per microcentrifuga da 1,5 mL e 440 μL assorbimento buffer + ligando a 36 restanti provette per microcentrifuga da 1,5 mL (Vedi tabella 1 per il layout).
    Nota: Rimuovere dal ghiaccio 15 min prima dell'inizio dell'esperimento a portarli a temperatura ambiente, ma tenere il ghiaccio fino a quando poi per conservare gli inibitori.
  2. Preparare la curva di saturazione (dopamina (2, 5, 6-[3H]-DA) (3-H della dopamina) (91,1 IC/mmol) alle varie concentrazioni finali (0.031, 0,0625, 0.125, 0.25, 0.5 e 1.0 μM)).
    1. Etichetta sei microcentrifuga 2 mL come 10, 5, 2.5, 1.25, 0,62 e 0,31.
    2. Aggiungere 750 μL assorbimento buffer + ligando nelle 5 provette microcentrifuga con numero più basso.
    3. Aggiungere 1,455.4 μL assorbimento buffer + ligando, 14,6 dopamina μL (1 mM), 30 µ l-dopamina 3-H (11 μM) nella provetta etichettata 10.
    4. Trasferire 750 μL dal tubo etichettati 10 nella provetta etichettata 5. Mescolare bene e trasferire 750 μL da questo tubo al tubo 2,5. Ripetere questa diluizione con i rimanenti tubi.
  3. Pre-sciacquare i filtri in microfibra di vetro con 4 mL di tampone di assorbimento dopo la loro immissione su un secchio di filtro ben 12.
  4. Aggiungere 10 μL della sospensione sinaptosomiali della membrana per le prime 24 mL 1,5 micro-Centrifugare le provette (Vedi tabella 1 per il layout) contenente tampone μL 440. Vortice attentamente e spin giù poco per assicurare che i sinaptosomi sono sommersi nel buffer. 37 o C per 10 min. di lasciare
    Nota: È importante essere esatti sui tempi durante l'esperimento di assorbimento per un confronto equo tra cervelli. Utilizzare un cronometro per precisione.
    5. Dopamina
  5. aggiungere 50 μL di concentrazione 10 e 5 μM (sezione 2.2) per i primi due colonne e lasciare a 37 o C per 5 minuti con agitazione. Dopo esattamente 5 minuti, fermare la reazione aggiungendo 1 mL di tampone di assorbimento ghiacciata. Fare lo stesso con concentrazione 2.5 e 1,25 μM (par. 2.2) e poi con concentrazione 0,62 e 0,31 μM.
  6. Aggiungere i campioni per i filtri di pre-risciacquata in microfibra e lavare con 5 x 4 mL di tampone di assorbimento ghiacciata. Quando i primi 12 campioni sono stati aggiunti ai filtri, è possibile spostare i filtri ai tubi di scintillazione. Ripetere questa operazione per i prossimi 12 campioni.
  7. Ripetere il punto 2.4-2.6 per il prossimo cervello.
  8. Preparare 3 max-conteggio tubi posizionando un filtro in microfibra nella parte inferiore dei tubi di scintillazione 49-51 e aggiungendo 25 µ l della concentrazione di dopamina massima sulla parte superiore (10 μM).
  9. Lasciare tutti i 51 scintillazione tubi in una cappa per 1 h.
  10. Aggiungere 3 mL di liquido scintillazione per ogni tubo di scintillazione e agitare vigoroso su un agitatore per 1 h.
  11. Conteggio [3 H]-DA in un beta counter per 1 min.
    1. Aprire il programma e scegliere: etichetta: H-3, piastra/filtro: flaconcino da 4 mL, 4 x 6, tipo di dosaggio: normale e tempo di conteggio: 1 min.
      Nota: Questo passaggio può essere eseguito il giorno seguente se più conveniente. Lasciare i campioni ricoperti con carta stagnola tutta la notte.
  12. Determinazione della proteina
    1. utilizzare un kit di analisi della proteina di BCA standard per determinare le concentrazioni di proteina di sinaptosomi di adeguamento da conteggi al minuto (cpm) per fmol/min/μg e per un corretto confronto dell'assorbimento tra i campioni.

3. Analisi dei dati

  1. uso i dati dall'assorbimento esperimento per rendere una saturazione della curva per ciascun gruppo e calcolare il tasso di reazione (V max) e la costante di Michaelis Menten (M. K).
    Nota: Il valore di K M riflette la concentrazione di substrato necessaria per raggiungere la metà del V max. Di conseguenza, V max riflette direttamente la funzione di DAT (capacità di assorbimento massima), che dipende dal numero di DAT sulla superficie e su come la sua attività potrebbe essere modulata da modifiche di posttranslational e/o proteine interagenti, così come il alterazioni in gradienti ionici. Il valore di K M è una misura indiretta di affinità del substrato per il trasportatore che, cosa importante anche può essere modulata da proteine interagenti e/o di modifiche di posttranslational. Per valutare appieno i cambiamenti funzionali è pertanto importante determinare direttamente i livelli di espressione di superficie da per esempio un'analisi di superficie biotinylation. Una descrizione di reuptake della dopamina e un'elaborazione sul significato dei valori max K M e V sono state esaminate da Schmitz et al 17.

4. Cromatografia liquida ad alte prestazioni (metodo 2)

  1. dissezione cerebrale
    1. Label e pesare microcentrifuga; uno per ogni regione per topo.
    2. Sacrificare un mouse in un momento di decapitazione e dislocazione cervicale. Rimuovere velocemente il cervello come descritto nella sezione 1.2. Eseguire ulteriori dissezione immediatamente.
    3. Utilizzando una matrice di cervello, sezionare una fetta della corona 3 mm dello striato seguita da più fine una dissezione bilaterale di NAc e dStr con un perforatore. Vedere la Figura 3 per punzone area.
    4. Trasferire il tessuto per provette per microcentrifuga da 1,5 mL e posizionare rapidamente il ghiaccio secco. Pesare il tessuto e posizionarlo immediatamente indietro sul ghiaccio a secco.
      Nota: Il peso del tessuto è importante per il calcolo della concentrazione più tardi.
      5. 4.1.1-4.1.4
    5. ripetere le operazioni con il mouse successivo.
      Nota: Posizionare il tessuto a 80 o C fino a ulteriore elaborazione o immediatamente procedere all'elaborazione del tessuto.

5. Preparazione dei tessuti

  1. centrifuga per consentirgli di effettuare la pre-raffreddare a 4 ° C, attivare
  2. preparare la soluzione di omogeneizzazione (0,1 N perclorico Acido (HClO 4)) e tenere il ghiaccio.
  3. Soluzione di omogeneizzazione Using, preparare standard fresco 0,1 pmol/μL dopamina da una soluzione madre (una diluizione 10.000 x) di 1 mM.
    Nota: La soluzione madre è preparata sciogliendo dopamina nel buffer di omogeneizzazione ad una concentrazione stock di 1 mM, che può essere mantenuto a 20 ° C per circa un mese. Se altre aree del cervello sono di interesse, concentrazione dello standard devono essere modificate, da altre zone del cervello compreso prefrontral corteccia, ippocampo, nigra di substantia e area tegmentale ventrale possiedono fino a 100 volte inferiore DA rispetto al corpo striato.
  4. Aggiungere 500 μL di soluzione di omogeneizzazione per ogni campione (cioè del tessuto di NAc e dStr; sezione 4.1) e omogeneizzare campioni usando un ultra-omogeneizzatore in piena velocità per circa 30 s. tenere il campione in acqua ghiacciata durante l'omogeneizzazione. Tra ogni campione, pulire l'omogeneizzatore ultra con acqua (piena velocità per 30 s).
  5. Centrifugare i campioni per 30 min a 4 ° C, 14.000 x g.
  6. Trasferimento circa 200 μL di campione a un filtro di vetro 0.22 μm (1 cm di diametro) utilizzando una siringa di plastica da 1 mL.
    Nota: L'uso di filtri di vetro non è importante, come i filtri scelti sono 0.22 μm per rimuovere le sostanze ad alto peso molecolare.
  7. Analizzare campioni tramite rilevazione elettrochimica (CE)-HPLC metodologia 18 come descritto nella sezione 6.

6. Analisi di cromatografia liquida ad alte prestazioni

  1. preparare la seguente soluzione per fase mobile: acetato di sodio 55mm, acido octanesulfonic 1 mM, Na 2 EDTA 0,1 mM, acetonitrile 8%, acido acetico 0,1 M, pH = 3.2.
    Nota: Regolare il pH con acido acetico 0,1 M. È importante essere precisi con il pH. La soluzione deve essere degasseRe del degassificatore on-line (parte integrante del sistema HPLC). Fare 2 L della fase mobile e cambiarlo una volta al mese (cambiarlo quando il rumore diventa evidente). A causa di fluttuazioni ci vogliono circa 24 h per regolare dopo la modifica la fase mobile.
  2. Set-up del rivelatore:
    1. Set volt uscita a 700 mV e temperatura di 32 ° C il forno rivelatore; questo è molto importante. Fare un programma di intervallo utilizzando il manuale online. Consultare il manuale per ulteriori dettagli). Aggiungere il programma di tempo secondo la tabella 2.
      Nota: In questo studio, il programma è impostato per modificare automaticamente la corrente in tempi di ritenzione set, per mantenere l'HPLC alla corrente ottima e per mantenere i picchi del cromatogramma come ampliato come possibile, ma ancora all'interno di vista. Questo è stato ottimizzato per striatal cervello lisati da topi.
  3. Quando il programma è stato aggiunto al rivelatore, fare una curva di calibrazione del punto 3, iniettando lo standard tre volte (5, 10 e 15 μL).
    Nota: Standard (10 μL (μL 10 x 0,1 pmol/μL = 1 pmol DA)) deve essere iniettato ogni decimo campione e campioni tarati allo standard più vicina. Sintonia fine il sistema il giorno prima lo standard di 3 punti di regolazione, e controllando se il cromatogramma esce nell'intervallo previsto. Se si osserva un notevole rumore, cambiare la fase mobile. Se un picco è superiore a 990 mV poi re-iniettare il campione in un volume più basso, o fare un nuovo programma di gamma e una nuova curva standard. Il limite di rilevamento è misurato come 3 volte il valore di rumore in sistemi mV per il più basso valore di picco iniettato per ogni standard (NA, DOPAC, DA, 5-HIAA, HVA, 3-MT e 5-HT).
    1. Sistema di set-up aprendo la soluzione di LC e attivazione inizia a 1; questa analisi in modalità in linea. Digitare l'ID utente e la password e fare clic su ok. Attesa per la soluzione di LC per connettersi agli strumenti. Vai alla tabella batch e compilare dati informazioni (ad esempio, tipo di campione: sconosciuto per campioni e std per il tipo di analisi standard,: esso QT, inj volume: 10, ISTD amt: livello 1 con). Salvare il file (andare su File - > salvare il file Batch come - > salvare).
    2. Rendere il sistema iniettare il campione primo premendo ' Start Batch '. Ciò comporta l'iniezione di 10 μL di campione di autocampionatore con un modulo di dosaggio del solvente.
      Nota: Utilizzare una pompa portata di 0,15 mL/min e una colonna C18 con fase di inversione. Qui è stato usato un rivelatore amperometrico per rilevazione elettrochimica. L'elettrodo a carbone vetroso deve essere impostata a 0,8 V con un elettrodo di riferimento Ag/AgCl. Al fine di analizzare campioni di dopamina, utilizzare cromatografia 3 µ ODS C18 (3) (DA 2 mm x 100 mm, particella 3 µm) per realizzare la separazione cromatografica.
    3. Estrarre le aree dei picchi registrati e calcolati.
      1. Vai all'acquisizione dati per seguire il cromatogramma quando i campioni hanno finito. Vai al post eseguire analisi - Lc > ha scelto il nome del file (il cromatogramma si aprirà) - > fare clic su Visualizza. Sulla barra degli strumenti di integrazione manuale, aggiungere tutte le cime per essere integrato - > Vai al report di dati e stampare la lettura.
        Nota: Qui il software solution LC è stato usato per controllo di sistema e all'analisi di dati.
  4. Delle aree di picco, calcolare la concentrazione di dopamina in un campione, come indicato di seguito utilizzando la concentrazione nota dello standard:
    1. utilizzare l'area del picco dello standard (è uguale a 1 pmol) per acquisire il fattore r.
      figure-protocol-19700
    2. utilizzare il fattore A per ottenere la concentrazione dei campioni.
      Concentrazione del campione (in pmol a 10 μL) = area del picco × fattore di A del campione
    3. utilizzare questa formula per ottenere la concentrazione del campione in ng.
      Campione concentrazione pmol / 10 µ l x 500 µ l x MW di dopamina = concentrazione del campione in ng
      campione di concentrazione (in ng) = concentrazione del campione (in pmol a 10 μL) x 500 μL x MW di dopamina
    4. utilizzare la concentrazione del campione in ng per ottenere t egli campione concentrazione nel tessuto di pg/g (campione di concentrazione in pg / g di tessuto = tessuto pg/g).

Risultati

Protocollo di corrente DA assorbimento (Figura 1) include tutti i passaggi necessari per valutare la funzionalità del DAT in sinaptosomi dai topi. I nostri dati rappresentativi del metodo DA assorbimento (Figura 2) raffigura una curva di saturazione con dati non rettificati (Figura 2B) e regolato dati (Figura 2A). La curva di saturazione Mostra l'assorbimento da topi wi...

Discussione

Questo manoscritto descrive i protocolli sperimentali utili per delineare DA omeostasi in qualsiasi modello del mouse di scelta. Forniamo protocolli dettagliati per misura i livelli di DA nel tessuto cerebrale da topi con HPLC e sinaptosomiali DA assorbimento per valutare funzionale DA trasporto attraverso DAT. Saranno elaborati le procedure, protocolli e i limiti per l'esperimento di HPLC e analisi di assorbimento sinaptosomiale DA sotto.

Il protocollo di assorbimento sinaptosomiale in grado ...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato dalla UCPH 2016 programma d'eccellenza (U.G., A.R., K.J.), la Fondazione di Lundbeck (M.R.) la Fondazione Lundbeck Center for biomembrane in nanomedicina (U.G.), l'Istituto nazionale di salute sovvenzioni P01 DA 12408 (U.G.), danese Consiglio per la ricerca indipendente - scienze mediche (U.G.).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
COMT inhibitorSigma Aldrich, GermanyRO-41-0960For synaptosomal DA uptake protocol
[3H]-DopaminePerkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USANET67-3001MCFor synaptosomal DA uptake protocol
Glass microfiber filtersGF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire1822-024For synaptosomal DA uptake protocol
HiSafe Scintillation fluidPerkin Elmer1200-437For synaptosomal DA uptake protocol
MicroBeta2Perkin ElmerFor synaptosomal DA uptake protocol
BCA Protein Assay kitThermo Scientific Pierce23225For synaptosomal DA uptake protocol
HEPESSigma Life ScienceH3375For synaptosomal DA uptake protocol
SucroseSigma Life ScienceS7903For synaptosomal DA uptake protocol
NaClSigma Life ScienceS3014For synaptosomal DA uptake protocol
KClSigma Life ScienceP9541For synaptosomal DA uptake protocol
CaCl2Merck KGaA10043-52-4For synaptosomal DA uptake protocol
MgSO4Sigma Life Science63065For synaptosomal DA uptake protocol
Ascorbic AcidSigma Life ScienceA0278For synaptosomal DA uptake protocol
D-GlucoseSigma Life ScienceG7021For synaptosomal DA uptake protocol
PargylineSigma AldrichP-8013For synaptosomal DA uptake protocol
DesipramineSigma AldrichD3900For synaptosomal DA uptake protocol
DopamineSigma Life ScienceH8502For synaptosomal DA uptake protocol
CocaineSigma Life ScienceC5776For synaptosomal DA uptake protocol
Brain matrixASI instrumentsRBM2000CFor synaptosomal DA uptake protocol
Cafano mechanical teflon disrupterBuch & HolmDiscontinuedFor synaptosomal DA uptake protocol (homogenization)
Antec Decade (Amperometric detector)Antec, Leiden, The NetherlandsDiscontinued: new model DECADE Elite / Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176For HPLC protocol
Avantec 0.22 μm glass filterFrisenette ApS, Denmark13CP020ASFor HPLC protocol
Column: Prodigy 3 μ ODS-3 C18Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, GermanyPart Number:00A-3300-E0For HPLC protocol
LC solution softwareShimadzuLabSolutions Series WorkstationFor HPLC protocol
Perchlor acid 0.1MFluka Analytical35418-500mlFor HPLC protocol (Tissue preparation)
EDTASigmaE5134-50gFor HPLC protocol
NatriumdihydrogenphospharBie&Berntsen1.06346 1000gFor HPLC protocol
Sodium 1-octanesulfonate monohydrateAldrich74885 -10gFor HPLC protocol
Acetonitrile, isocratic HPLC gradeScharlauAC03402500For HPLC protocol
Filtre 0.22umFrisenette ApS, DenmarkAvantec 13CP020ASFor HPLC protocol (Tissue preparation)
ortho-Phosphoric acid 85%Merck1.00563. 1000mlFor HPLC protocol
ElectrodeAntec, Leiden, The NetherlandsAN1161300For HPLC protocol (see manual online)
Detector program on DECADE II electrochemical detectorAntec, Leiden, The NetherlandsLite™ Electrochemical Detector type 175 and 176For HPLC protocol

Riferimenti

  1. Tritsch, N. X., Sabatini, B. L. Dopaminergic modulation of synaptic transmission in cortex and striatum. Neuron. 76, 33-50 (2012).
  2. Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles. J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).
  3. Kristensen, A. S., et al. SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation. Pharmacol Rev. 63, 585-640 (2011).
  4. Gainetdinov, R. R., Caron, M. G. Monoamine transporters: from genes to behavior. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 261-284 (2003).
  5. Runegaard, A. H., et al. Preserved dopaminergic homeostasis and dopamine-related behaviour in hemizygous TH-Cre mice. Eur J Neurosci. 45, 121-128 (2017).
  6. Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. The separation of synaptic vesicles from nerve-ending particles ('synaptosomes'). Biochem J. 90, 293-303 (1964).
  7. Hornykiewicz, O. Dopamine (3-hydroxytyramine) and brain function. Pharmacol Rev. 18, 925-964 (1966).
  8. Schultz, W. Behavioral dopamine signals. Trends Neurosci. 30, 203-210 (2007).
  9. Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
  10. Giros, B., Jaber, M., Jones, S. R., Wightman, R. M., Caron, M. G. Hyperlocomotion and indifference to cocaine and amphetamine in mice lacking the dopamine transporter. Nature. 379, 606-612 (1996).
  11. Torres, G. E., Amara, S. G. Glutamate and monoamine transporters: new visions of form and function. Curr Opin Neurobiol. 17, 304-312 (2007).
  12. Jones, S. R., et al. Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4029-4034 (1998).
  13. Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons. J Vis Exp. , (2014).
  14. Rickhag, M., et al. A C-terminal PDZ domain-binding sequence is required for striatal distribution of the dopamine transporter. Nat Commun. 4, 1580 (2013).
  15. Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3, 1718-1728 (2008).
  16. Whittaker, V. P. Thirty years of synaptosome research. J Neurocytol. 22, 735-742 (1993).
  17. Schmitz, Y., Benoit-Marand, M., Gonon, F., Sulzer, D. Presynaptic regulation of dopaminergic neurotransmission. J Neurochem. 87, 273-289 (2003).
  18. Yang, L., Beal, M. F. Determination of neurotransmitter levels in models of Parkinson's disease by HPLC-ECD. Methods Mol Biol. 793, 401-415 (2011).
  19. Earles, C., Schenk, J. O. Rotating disk electrode voltammetric measurements of dopamine transporter activity: an analytical evaluation. Anal Biochem. 264, 191-198 (1998).
  20. Wu, Q., Reith, M. E., Kuhar, M. J., Carroll, F. I., Garris, P. A. Preferential increases in nucleus accumbens dopamine after systemic cocaine administration are caused by unique characteristics of dopamine neurotransmission. J Neurosci. 21, 6338-6347 (2001).
  21. Schonfuss, D., Reum, T., Olshausen, P., Fischer, T., Morgenstern, R. Modelling constant potential amperometry for investigations of dopaminergic neurotransmission kinetics in vivo. J Neurosci Methods. 112, 163-172 (2001).
  22. Hoover, B. R., Everett, C. V., Sorkin, A., Zahniser, N. R. Rapid regulation of dopamine transporters by tyrosine kinases in rat neuronal preparations. J Neurochem. 101, 1258-1271 (2007).
  23. Hansen, F. H., et al. Missense dopamine transporter mutations associate with adult parkinsonism and ADHD. J Clin Invest. 124, 3107-3120 (2014).
  24. Damier, P., Hirsch, E. C., Agid, Y., Graybiel, A. M. The substantia nigra of the human brain. II. Patterns of loss of dopamine-containing neurons in Parkinson's disease. Brain. 122 (Pt 8), 1437-1448 (1999).
  25. Atack, C. V. The determination of dopamine by a modification of the dihydroxyindole fluorimetric assay. Br J Pharmacol. 48, 699-714 (1973).
  26. Yoshitake, T., et al. High-sensitive liquid chromatographic method for determination of neuronal release of serotonin, noradrenaline and dopamine monitored by microdialysis in the rat prefrontal cortex. J Neurosci Methods. 140, 163-168 (2004).
  27. Decressac, M., Mattsson, B., Lundblad, M., Weikop, P., Bjorklund, A. Progressive neurodegenerative and behavioural changes induced by AAV-mediated overexpression of alpha-synuclein in midbrain dopamine neurons. Neurobiol Dis. 45, 939-953 (2012).
  28. Huot, P., Johnston, T. H., Koprich, J. B., Fox, S. H., Brotchie, J. M. L-DOPA pharmacokinetics in the MPTP-lesioned macaque model of Parkinson's disease. Neuropharmacology. 63, 829-836 (2012).
  29. Mikkelsen, M., et al. MPTP-induced Parkinsonism in minipigs: A behavioral, biochemical, and histological study. Neurotoxicol Teratol. 21, 169-175 (1999).
  30. Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Dempsey, C., Fields, V. Comprehensive profiling of dopamine regulation in substantia nigra and ventral tegmental area. J Vis Exp. , (2012).
  31. Van Dam, D., et al. Regional distribution of biogenic amines, amino acids and cholinergic markers in the CNS of the C57BL/6 strain. Amino Acids. 28, 377-387 (2005).
  32. Barth, C., Villringer, A., Sacher, J. Sex hormones affect neurotransmitters and shape the adult female brain during hormonal transition periods. Front Neurosci. 9 (37), (2015).
  33. Corthell, J. T., Stathopoulos, A. M., Watson, C. C., Bertram, R., Trombley, P. Q. Olfactory bulb monoamine concentrations vary with time of day. Neuroscience. 247, 234-241 (2013).
  34. Zhuang, X., et al. Hyperactivity and impaired response habituation in hyperdopaminergic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 1982-1987 (2001).
  35. Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30, 44-55 (1974).
  36. Wickham, R. J., Park, J., Nunes, E. J., Addy, N. A. Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats. J Vis Exp. , e52468 (2015).
  37. Phillips, P. E., Robinson, D. L., Stuber, G. D., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry. Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).
  38. Callaghan, P. D., Irvine, R. J., Daws, L. C. Differences in the in vivo dynamics of neurotransmitter release and serotonin uptake after acute para-methoxyamphetamine and 3,4-methylenedioxymethamphetamine revealed by chronoamperometry. Neurochem Int. 47, 350-361 (2005).

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