Сухой пленки фоторезиста на основе электрохимический биодатчик Microfluidic платформа: Изготовление устройств, на чипе Assay подготовка и работы системы

Резюме

Биосенсор microfluidic платформа была разработана и изготовлены с использованием технологии лоу кост сухой пленки фоторезиста для быстрого и чувствительной квантификации различных аналитов. Эта система одноразовых позволяет для электрохимических индикация по чип прикол энзим соединенный анализов методике стоп потока.

Аннотация

В последние годы биомаркер диагностика стала незаменимым инструментом для диагностики заболеваний человека, особенно для диагностики точки обслуживания. Платформы easy-to-use и лоу кост датчик весьма желательно измерить различные типы аналитов (например, биомаркеры, гормоны и наркотики), количественно и конкретно. По этой причине сухой пленки фоторезиста технологии - включение дешево, снисходительный и высок объём изготовления - был использован для изготовления microfluidic биосенсор, представленные здесь. В зависимости от помощи биопроб, используемые впоследствии универсальная платформа способен обнаруживать различные типы биомолекул. Для изготовления устройства платиновые электроды строятся на гибкой полиимидные (PI) фольги в шаг только чистый номер процесса. PI фольги служит субстрат для электродов, которые изолированы на основе эпоксидных фоторезиста. Microfluidic канал впоследствии генерируется путем разработки и ламинирования сухой пленки фоторезиста (DFR) фольги на вафельные PI. С помощью гидрофобные остановки барьер в канал, канал разделяется на две конкретные области: иммобилизации раздел для энзим соединенный assay и электрохимические измерения ячеек для считывания сигнала растворенного в воде.

На чипе биопроб иммобилизации осуществляется путем адсорбции биомолекул на поверхности канала. Фермента глюкоза оксидаза используется как датчик для генерации электрохимических сигнала. Присутствии субстрат, глюкоза, производится перекиси водорода, который обнаружен на Платиновый рабочих электродом. Остановка потока техника применяется для получения усиления сигнала наряду с быстрого обнаружения. Различные биомолекул количественно может быть измерена с помощью системы внедрены microfluidic, давая указание различных видов заболеваний, или, относительно лечебного препарата мониторинг, содействие персонализированной терапии.

Введение

За последние два десятилетия диагностические приложения стали элементарных для углубленных исследований в области глобального общественного здравоохранения. Традиционно лабораторные диагностические инструменты используются для обнаружения заболеваний. Даже несмотря на то, что они по-прежнему играть ключевую роль в диагностике заболеваний, тестирования точки обслуживания (POCT) выполнена у пациента или пациент сам стал более и более распространенным явлением в последние годы. Особенно в таких случаях, которые требуют немедленного лечения, например, острый инфаркт миокарда или диабет мониторинг быстрое подтверждение клинического вывод имеет важное значение. Следовательно существует растущая потребность POCT устройств, которая может эксплуатироваться не экспертами и что одновременно способны выполнять точные в vitro диагностические тесты в короткое время^1,2,3,4 .

Уже достигнуты значительные успехи, достигнутые в области POCT. Однако есть еще много проблем, чтобы преодолеть^5,6,,78. Для платформы POCT будет успешно запущен на рынок и конкурировать с лабораторной диагностики, устройство должно строго соответствовать следующим требованиям: (i) предоставлять точные и количественные результаты, которые согласуются с лабораторией выводы; (ii) имеют короткий пример к результат раз, позволяя немедленного лечения пациента; (iii) располагают незатрудненного и простой обработки, даже при ведении неподготовленных людей и требуют вмешательства свернутого пользователя; и (iv) состоят из датчика лоу кост подразделение, предназначены для однократного использования приложений. Кроме того оборудование Бесплатная диагностика благоприятны, главным образом в бедных ресурсами среды^3,4,6.

Из-за этих серьезных требований только две POCT систем на основе электрохимических обнаружения (например, глюкозы в крови тест полоски) и иммуноанализа бокового потока (например, домашние тесты беременности) были успешно начаты на рынок так далеко. Однако обе системы страдают от недостатков, таких, как низкая производительность (т.е. мониторинга глюкозы крови имеет неточные результаты и анализы бокового потока только предоставляют результаты качественных измерений (положительный или отрицательный))^{4, 6}. Эти недостатки обычных систем POCT привели растущий спрос на изучение новых технологий, которые предлагают быстрый, лоу кост и количественного обнаружения точки зрения ухода за^4,5.

Для решения этих задач, стоящих перед POCT устройств, технология DFR недавно использовалась для изготовления одноразовых и лоу кост биодатчики^{9,10,11,12, 13 , 14}. по сравнению с мягких и жидких литографических материалы, такие как PDMS или Су-8, DFRs настоящее время множество преимуществ: они (i) доступны в различных композиций и толщины (от нескольких микрон до нескольких миллиметров); (ii) имеют очень грубо площадь поверхности, которая облегчает адгезии к различным материалам; (iii) функция Потрясающе толщина единообразия; (iv) предлагают дешевые, снисходительный и высок объём производства для массового производства; (v) являются легко резать с различными инструментами лоу кост, как пару простых ножницы; и (vi) позволяют для создания трехмерных структур, таких как microfluidic каналы, путем укладки нескольких DFR слои друг на друга.

С другой стороны DFRs в целом имеют относительно бедных разрешение по сравнению с жидкой фоторезистов, который является главным образом вызваны толщины пленки и увеличение расстояния между DFR благодаря защитной пленке, которая дополнительно позволяет света и маски рассеяние. Тем не менее для изготовления комплексных microfluidic биодатчиков, DFRs очень подходит для лоу кост массового производства.

Таким образом мы представляем в этой работы, изготовление и применение биосенсор на основе DFR электрохимических microfluidic. Подробный протокол описывает каждый шаг производства биосенсор платформы, на чипе иммобилизации модель на основе ДНК анализа, и ее электрохимических индикация с использованием метода stop потока. Это универсальная платформа позволяет выявлять многочисленные виды биомолекул, используя различные пробирного технологий (целломике,например, геномики и протеомики) или пробирного форматов (например, конкурентоспособной, бутерброд или прямой). Основываясь на такой платформе DFR, наша группа ранее успешно продемонстрировала быстрый и чувствительных квантификации различных аналитов, включая антибиотики^13,,1516 (тетрациклин, pristinamycin и β лактамные антибиотики), тропонин я¹⁷и вещество P-¹⁸.

протокол

1. Изготовление Microfluidic биосенсор технологии с использованием DFR

1. приготовления Пи вафель.
   1. Вырезать PI субстрата в 6 - в круглых пластин. Поместить пи пластин в духовке при температуре 120 ° C для примерно 1 час для обезвоживания выпекать.
2. Первый шаг фотолитографии старт процесса.
   1. Программа спин-нанесения покрытий на время 30-s спиннинг при 3000 об/мин, с ускорением 2000 об/мин/s. место PI пластин на спин coater и исправить ее, применяя вакуум. Отказаться от 2 мл сопротивляться, позволяя старт процесса и запустите программу, спин-нанесения покрытий. Удаление пластины из спин coater и софт Выпекать PI пластин на горячей плите 2 мин на 100 ° C.
   2. Настроить желаемый маска для структурирования электродов на Пи пластины с нагим глазом и подвергать 400 МДж/см ² УФ света (365 Нм). Место заполнены с разработчиком соответствия сопротивляться на орбитальный шейкер вафельные в миску и дайте ему встряхнуть немного за 1 мин
   3. После удаляется избыток сопротивляться, использовать телевизор для полоскания PI вафельные с дейонизированной водой (ди вода) на мокрой скамейке и сушить потом с помощью сжатого воздуха.
3. Осаждения платины для формирования электродов.
   1. Использовать процесс осаждения стандартная ионно депозит 200 Нм платины на вафельные ¹⁹.
   2. Место вафля в миску. Добавление сопоставления для удаления в миску и удалите старт сопротивление при слегка покачивая пластины на орбитальный шейкер, до тех пор, пока все платиновые избыток удаляется. Сполосните и высушите PI пластин, как описано в шаге 1.2.3.
4. Второй шаг фотолитографии: формирование слоя изоляции.
   1. Поставить PI пластин в духовке, разогретой до 120 ° C за 5 мин до обезвоживает it.
   2. Программа первый шаг спин coater 5 s спиннинг время 500 об/мин. Программа второй шаг за 30 сек при 4000 об/мин, с ускорением 700 об/мин/s.
   3. Место PI пластин на спин coater и исправить ее, применяя вакуум. Отказаться от 4 мл соответствующей основе эпоксидной фоторезиста перед запуском программы спин coater.
   4. Soft выпекать покрытые вафельной 3 мин при 95 ° C на горячей плите.
   5. Настроить маску для слоя изоляции на пластины, с использованием соответствующих выравнивания знаки и глазной линзы. Разоблачить вафельные 100 МДж/см ² УФ света (365 Нм).
   6. Для постконтактная выпечки, место пластины на разогретой плита на 2 мин на 95 ° C.
   7. Место вафля в миску и развивать сопротивление с подходящей разработчика (например, 1-метокси-2-пропил используется для 2 мин, в случае Су-8) на орбитальный шейкер.
   8. Сначала промыть PI вафельные изопропиловый спирт и затем промыть и высушить его, как описано в шаге 1.2.3.
   9. Хард выпекать фоторезиста в духовке в течение 3 часов при 150 ° C.
5. При помощи плазменной очистки электродов.
   1. Для удаления фоторезиста остатков, использовать кислород плазмы с стандартной плазменного. Запуск программы очистки, мощность 200 Вт низкой частоты с помощью 100% O ₂ потока, скорость 250 sccm и общее время 3 мин
   2. Место PI пластины в камере плазмы, исправить пластины на пластину заземлением с помощью стеклянные крышки и начать процесс плазменной.
6. Серебро и осаждении хлорида серебра: создание электрода опорного.
   1. Passivate платины контакта колодки вафли с УФ чувствительных клейкой лентой. Разрезать фольгу 5 мм в ширину и 11 см длинные полосы и прикрепить их к пластины, защита частей не на хранение с серебром.
   2. Осаждения серебра, поместить звуковой ванны (35 кГц) в вытяжной шкаф и вставьте контейнер раствор серебра электролита (100 г/Л Ag, pH 12,5) в ванну. Установить звуковой ванны до комнатной температуры и мощности на 10%.
      Предупреждение: Серебряный электролит решения являются высокотоксичными и следует подходить с крайней осторожностью. Никогда не должно быть вдыхании паров.
   3. Подключите основной контакт ссылку электродов к источника постоянного тока. Подключить счетчик электрода, серебряной проволоки, который погружен в раствор серебра электролита, к текущему источнику с использованием стандартных соединительных кабелей.
   4. Установить источник тока DC и плотность тока -4,5 мА/см ², что приводит к серебряной наплавки примерно 0,3 мкм/мин начать звуковой ванны и пусть текущий источник баллотироваться на 10 минут промойте пластины с ди воды
   5. Для хлорирования электрод сравнения, судно 0,1 М раствора хлорида калия (KCl) Вставьте звуковой ванны. Подключите основной контакт пластины и Платиновый электрод, который погружен в еще несогретом растворе с постоянным текущего источника.
   6. Установить источник тока DC и плотность тока + 0,6-+ мА/см ², что приводит к скорость осаждения приблизительно 0,075 мкм/мин начать звуковой ванны и пусть текущий источник баллотироваться на 7,5 мин
   7. Промыть и высушить PI пластины, как описано в шаге 1.2.3.
   8. Снять ленту УФ чувствительных после УФ (365 Нм) воздействия 300 МДж/см ², промыть и высушить PI пластины, снова, как описано в шаге 1.2.3.
7. Третий шаг фотолитографии: с помощью DFRs для создания каналов microfluidic.
   1. Сократить необходимые слои DFR размер похож на вафельные (² 20 x 20 см). Исправьте желаемого маски на экспозиции блок и выровнять DFR слоя на маску, используя невооруженным глазом. Осветить противостоять с 250 МДж/см ² УФ света (365 Нм).
   2. Удалить защитную пленку фоторезиста и развивать сопротивление примерно 2 мин (в зависимости от структуры) в 1% раствор карбоната натрия (Na ₂ CO ₃), используя стандартный звуковой ванна (35 кГц), разогретую до 42 ° C и звуковой мощности 100%. Немедленно остановить реакции, встряхните сопротивляться за 1 мин в бане 1% HCl на орбитальный шейкер. Сполосните и высушите каждый слой DFR, как описано в шаге 1.2.3.
      Примечание: В общей сложности, четыре DFR слои должны быть обработаны как указано в шаге 1.7: один канал слоя, один слой и два слоя зад (Предотвращение изгиба в конце биосенсор).
8. Ламинирование DFR слои на подложке PI.
   1. Место PI пластин на накладных сетку прозрачности и исправить это с помощью стандартных липкая лента. Отрегулируйте уровень DFR канала на Пи пластины под микроскопом, используя соответствующие выравнивание структуры.
   2. Для ламинирования, использовать стандартный Горячий ролл ламинатор и Разогрейте верхнего рулона до 100 ° C и снизу рулона до 60 ° C. установить давление на 3 бар, с скорости 0,3 м/мин место вафельные с фиксированной DFR слоя в середине ламинатор и запустить это; DFR выталкивается через ламинатор. Повторите шаг после вращающихся пластин на 180°.
   3. Для предотвращения изгиба биосенсор, ламинат два слоя развитых зад на вафельные, следующие шаги 1.8.1-1.8.2.
9. Использованием гидрофобных остановки барьер и герметизации чип.
   1. Удалить защитный слой от лицевой стороны канала DFR заложитьER, поместив стандартных липкая лента на одном конце DFR и потянув ее вверх. Используйте ручной дозатор с 0,004 в трубы отказаться от мелких капель растворяют политетрафторэтилена в скважины слоя изоляции. Для герметизации microfluidic чип, ламинат DFR слоя на слой канала, как описано в шаге 1.8.
10. Хард выпечка microfluidic биодатчик.
    1. Удалить все защитные пленки на обложке и зад DFR слои. Нарежьте полосками, с использованием обычной пары ножниц биодатчиков. Вылечить фишки в духовке при температуре 160 ° С в течение 3 ч.

2. Assay иммобилизации процедуры на чипе

1. адсорбции авидин в иммобилизации области канала.
   1. Приготовляют раствор авидин 100 мкг/мл в 10 мм фосфат амортизированное saline (PBS) при рН 7,4.
   2. Отказаться от 2 мкл авидин раствора на входе биодатчик.
      Примечание: Канал заполняется капиллярных сил до тех пор, пока жидкость достигает гидрофобные остановки барьер.
   3. Для обеспечения что аэрогидродинамических держит останавливаясь на барьер во время всей инкубации, лунки 2 мкл ди воды на выходе микросхемы. Инкубировать чип при 25 ° C в течение 1 ч в закрытом контейнере.
   4. Удалить избыток реагентов через вход микросхемы, применяя вакуум. Промойте канал с 50 мкл буфера мытья (PBS с 0,05% 20 анимации), обойтись на выходе, в то время как вакуум применяется. Сухие канал для 30 s в то время как вакуум применяется.
2. Блокировка поверхности канала, чтобы препятствовать неспецифические привязки.
   1. Приготовляют раствор 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в 10 мм PBS при рН 7,4.
   2. Пипетки 2 мкл 1% BSA раствора на входе и 2 мкл ди-воды на выходе из канала. Инкубируйте чип при 25 ° C в течение 1 ч в закрытом контейнере. Удалите избыток реагентов и высушить канал, как описано в шаге 2.1.4.
3. Инкубации ДНК oligos помечены биотина и 6-FAM.
   1. Подготовить различные концентрации (0,001-5 мкм) ДНК раствора в 10 мм PBS при рН 7,4.
   2. Отказаться от 2 мкл одной концентрации ДНК раствора на входе и 2 мкл ди-воды на выходе. Инкубировать чип при 25 ° C в течение 15 мин в закрытом контейнере.
   3. Повторите шаг 2.3.2 другие концентрации ДНК, с использованием дополнительных биосенсор чипов.
   4. Удалить избыток реагентов и высушить канал, как описано в шаге 2.1.4.
4. Иммобилизации GOx-обозначенного антитела 6-FAM.
   1. Сформулировать 5 мкг/мл концентрация антител 6-FAM в 10 мм PBS при рН 7,4.
   2. Ввести 2 мкл антител раствора на входе и 2 мкл ди-воды на выходе из канала. Инкубируйте обозначенные антитела при 25 ° C в течение 15 мин в закрытом контейнере. Удалите избыток реагентов, как описано в шаге 2.1.4.

3. Амперометрическое сигнал обнаружения с помощью метода Stop потока

1. приготовления раствора субстрата для электрохимических обнаружения.
   1. Сформулировать раствором глюкозы 40-мм в 0,1 М PBS при рН 7,4 в ультра-чистой воде.
   2. Для предварительного лечения, приготовляют раствор 0,1 М PBS на рН 7,4 в ультра-чистой воде.
2. Предварительная обработка рабочих электродов.
   1. Использовать держателя на заказ чип, чтобы позволить легко размещения чипа и оптимизированных и электрические подключения.
   2. Электрически соединить потенцио биодатчик. Обеспечить аэрогидродинамических контакт microfluidic канала шприцевый насос и водохранилище реагента, используя заказные адаптер и трубки. Запустите ноутбук, который подключен к потенцио и запустить контроллер насоса шприца, оптимизированных потока через чип.
   3. Вручную, запустите шприцевый насос с PBS 0,1 М со скоростью потока 20 мкл/мин. На рабочем электроде против электрод сравнения на чипе, применять чередуя напряжения 0,8 и -0.05 V 5 s 30 циклов. После этого, окисляет рабочих электродом, применяя напряжения 0,8 V 60 s.
3. Assay индикация с использованием метода stop поток.
   1. Начать пробирного индикация сигнала, ждать до тех пор, пока стабилизирует текущего измеряемого сигнала. Остановить шприцевый насос и переключения реагент от 0,1 М PBS в растворе глюкозы 40-мм и запустить программное обеспечение на контроллер насоса шприца; он автоматически остановит поток для 1, 2 или 5 мин и затем перезапустить поток снова. Наблюдать за полученный текущей пик.
      Примечание: Для анализа данных, либо текущий пик или заряд пик могут рассматриваться, как описано в модели электрохимического сигнала индикации ( рис. 2).

Результаты

Проектирование и изготовление биосенсор Microfluidic платформа:

Изготовление чипов биосенсор microfluidic реализуется на уровне вафельные методами стандартных офсетным, используя несколько слоев DFR. Эта стратегия изготовление опирается на ламин?...

Обсуждение

Представленные здесь для изготовления microfluidic электрохимический биодатчик протокол позволяет развитие лоу кост, компактный и простой в использовании платформа для обнаружения биомолекул. В зависимости от assay, потом используется на биосенсор могут быть обнаружены несколько различных ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
Pyralux	DuPont	AP8525R	Used as polyimide substrate
MA-N 1420	Micro Resist Technology	MA-N1420	Lift-off resit to define the platinum depostion
Ma-D 533s	Micro Resist Technology	MaD533S	Developer for MA-N1420
Platinum	-	-	Electrode and contact pad material
Ma-R 404s	Micro Resist Technology	MaR404S	Remover for MA-N1420
SU-8 3005	MicroChem Corp.	SU-8-3005	Photoresist to define the electrode area and as insulation
1-methoxy-2-propanol acetate	Sigma-Aldrich	108-65-6	Developer for SU-8 3005
2-Propanol	VWR	8.18766.2500	Removing of the SU-8 developer
1020R	Ultron Systems Inc.	1020R	UV sensitive adhesive tape for protection of contact pads
Arguna S	Degussa	1935	For Silver depostion on reference electrode
KCl	Methrom	62308.020	For chloridation of the silver reference electrode
Pyralux	DuPont	PC1025	Dry film photoresist
Sodium carbonat	Fluka	71352	Developer for Pyralux PC1025
Hydrogen chloride	Sigma-Aldrich	30720	To top the development of the DFR
Teflon AF 1600	DuPont	AF1600	For employing the stopping barrier
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
PA104	Mega Electronics	-	Bubble etch tank
FED 53	Binder	9010-0018	Oven
SPIN150	APT	-	Spin coater
Präzitherm	Harry Gestigkeit GmbH	PZ 28-2	Hot plate
Hellas	Bungard Elektronik	40000	Exposure unit
Tetra30-LF-PC	Diener	-	Plasma unit
Univex 500	Leybold	-	Physical vapor deposition unit
Shaker S4	ELMI	-	Orbital shaker
Sonorex Super 10 P	Bandelin	783	Sonic bath
6221 DC and AC	Keithley	-	Current source
HRL 350	Ozatec	-	Laminator unit
Vaccum pen	EFD	-	Vacuum pen