ピエゾ高精度手術小片除去 (フェーザ): マウスの改良された頭蓋ウィンドウ術のテクニック

要約

圧電の手術は人間の口腔、歯科の手術での改善につながっています。マウスの骨手術用圧電手術を最適化するためにプロトコルを開発しました。

要約

多光子顕微鏡は、広く生体内神経細胞イメージングに適応されています。繰り返されるイメージングには、頭蓋ウィンドウの注入または頭蓋骨の繰り返される間伐が必要です。頭蓋のウィンドウは通常手術高速回転ドリルで、多くの調査官はドリルが繊細な硬膜や血管を損傷するを防ぐために挑戦それを見つけます。広範なトレーニングと実践の基礎となる組織を損傷することがなく骨を削除する必要が、こうして頭蓋窓手術を困難、時間のかかる、でき、組織の損傷を作り出します。歯科口腔外科に使われた、圧電外科は軟組織を傷つけることがなく骨を削除する超音波振動を利用しています。我々 は多光子イメージングに備えてマウス頭蓋窓手術を改善するために圧電手術を適用する手法を開発しました。私たちのラボ内で比較検索メソッドは手術時間が短くて済み、ロータリー ドリルで頭蓋ウィンドウ手術よりも硬膜出血による合併症の低い平均速度を持っています。

概要

生体内イメージング多光子の齧歯動物を準備する骨手術神経科学における重要な手法となっています。除去や骨の菲薄化多光子顕微鏡と光学イメージングのマウスを準備する必要は。この手術は、基になる硬¹を公開する骨の領域を完全に削除または硬²から完全に削除することがなく骨部を薄くことによって実行されます。薄い頭蓋骨アプローチ以下の炎症やミクログリア³の活性化が生じるが、イメージング、イメージング ウィンドウ サイズが小さく (200 μ m) と骨再生^{2 による視覚化されるウィンドウ中に限られた期間の浅い深さを提供しています}.洗練された、強化ガラス窓 (ポート) の画像サイズと撮影実施期間を増やすことができますが⁴を実行することは困難です。

両方の現在の手術は、薄いまたは頭蓋骨から骨を削除する高速回転ドリルを使用します。薄い頭蓋骨テクニックもドリル後骨²をさらに薄くメスを使用します。ポート技術には、高速研磨砥粒⁴の余分なステップが必要です。高速回転ドリル、空気動力タービンまたは電気モーターにより、高速で回転するドリル ビット。ロータリー ドリル セクション骨と軟組織、硬膜の損傷・血管の基になるリスクがあります。手術の成功は、外科医のスキルに依存します。これらのウィンドウは、機械的手術方法準備、加え光学さまざまなソリューションと頭蓋骨をクリアする化学方法は先進^5,6をしてきた。しかし、圧電手術は手術の機械的方法で、私たちの比較ここでは他の機械的方法に制限されます。

圧電手術デバイスせず有害な基になる軟部組織石灰化骨を分解する超音波振動を利用し、従って急速に骨の大面積を薄くためのアプローチを提供します。圧電手術用ハンドピースでタービンがセラミック ディスクのスタックによって置き換えられ、電流を適用すると、ディスクは、超音波の周波数で振動します。振動は、骨なし有害な軟部組織の種類を差別しないロータリー ドリル優位をカットするコーティングされたヒントをダイヤモンドにハンドピースによって転送されます。圧電手術もともと人間用トマソ ・ Vercellotti が開発、歯科で改善と頭蓋顔面外科^{7,8,9,10,11 につながっています。}.

圧電手術はラットで、骨切り術を作成する使用されています、磁気共鳴イメージング (MRI) と従来の歯科用ドリル¹²よりも大幅に少ないダメージを生成する組織によって発見されました。著者らは、柔らかい脳組織に近い骨を除去するため圧電手術が無事締結。マウス、しかしより簡単に破損している薄い硬、その研究は、慢性の光イメージングのため windows を準備しなかった。慢性的なイメージングは、血管が損傷していないことウィンドウの下血栓を形成しないことが必要です。硬膜への損傷は、クラウド、ウィンドウを引き起こす炎症につながるし、反応性アストロ サイトの増殖およびミクログリアをアクティブにします。ここで我々 は薄い頭蓋骨と完全骨除去頭蓋 windows 慢性的な撮影に適したを作成するマウス用圧電手術を最適化してきました。高速回転ドリルで頭蓋ウィンドウ手術にこの手技を比較しました。

プロトコル

すべてのプロシージャを含む動物は、基準に従って行われたコロンビア大学医療センター機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) で設定します。ケタミンによる麻酔下頚部転位による安楽死を行った 100 mg/kg とキシラジン 10 mg/kg 腹腔内注入します。滅菌方法ですべての手術を行った (外科医はヘッド キャップ、マスク、滅菌手袋、きれいな使い捨て白衣を着ていた) 手術器具が利用ごとオートクレーブと。

1. 術前の手順

1. オートクレーブ無菌性を確保するためのすべての手術器械。
2. イソフルラン (誘導 4%、手術のため 1.5-2%) と C57bl6 マウスを麻酔します。適切な麻酔深度を確保するため 10 分毎の後足の指をピンチします。発声や後肢の後退が見られる場合は、麻酔を増やします。
3. 乾燥を防ぐために目に獣医の目の潤滑剤を適用します。
4. ハードジェルの除去または電気かみそりとシェービングで 3 分アプリケーションでは、頭皮に髪の毛を削除します。
5. 加熱パッドまたは校正水循環毛布 38 ° C に設定上の脳定位固定装置のフレームにマウスを置き
6. 術前鎮痛を提供する皮下ブプレノルフィン (0.1 mg/kg) を管理します。
7. クロルヘキシジンや betadine と 70% エタノール綿の先端アプリケータを使用して 3 つの交互になるアプリケーションと頭皮を消毒します。
8. 局所麻酔を提供するために頭皮の下には、生理食塩水で希釈ブピバカイン 50% の 100 mL を注入します。

2. 圧電頭蓋ウィンドウ手術

1. オートクレーブ滅菌の手術器具を使用して、サークルを削除 1 cm 頭皮の頭蓋骨に切り出して円形のパターンで手術用ハサミ。頭蓋骨骨膜組織、骨の上に公開することから頭皮を持ち上げます。
2. 鉗子の先端を使用して、任意の残りの骨膜の組織の明確な露出骨をこすり。これは歯科用のセメントが後該当しないことを確認することが重要です。
3. 最低の設定で振動する圧電手術ユニットを設定します。高設定が強烈な振動のための血管を破る可能性がありますに注意してください。
4. ハンドピース滅菌の円形先端を修正します。
   注: 4 mm の円形先端手術に適しています。大規模なチップのサイズは、ウィンドウ全体を同時に薄くことができるよう手術の速度に貢献します。
5. 氷冷人工脳脊髄液 (アプライド) と 10 mL のシリンジを入力し、圧電ハンドピースを持っていない手でそれを保持します。
6. また 1 mL/分の速度で頭蓋骨の上に注射器からアプライドを滴下して頭蓋骨を灌漑、頭蓋骨を置いた蠕動性ポンプを使用して他の手の使用を解放します。
   注: 冷たいアプライドと灌漑は高周波振動から摩擦による過熱を防ぐために重要です。
7. そっと光円運動と頭蓋骨に振動外科先端を適用 (1 につき 3 円 s)、薄い頭蓋骨準備 (5 〜 10 分) を実行する所望の深さに骨の薄い。
   注: ここでは、4 mm windows が行われた 20 μ m に薄くなっていた。ただし、ウィンドウのサイズは、外科の先端の大きさによって異なります。骨の厚さは、頭蓋骨に先端を適用する時間の長さに基づいて所望の深さに調整できます。
8. 優しくハンドピースの角度を調整し、頭蓋骨を均一に薄く頭蓋骨に圧力を適用するときの先端の角度を変更します。
9. 後ろに細い骨を余すことがなく完全な骨削除を実行するには、亀裂が表示されるウィンドウ領域の周りまで骨を薄きます。薄い骨の残りのフレークを鉗子で基になる硬膜を損傷することがなく削除します。
10. 冷たいアプライドで止血コラーゲン泡の 1 mm の部分を浸します。鉗子でウェットの泡を押しながら薄い頭蓋骨の上に置きます。約 30 のため薄い頭蓋骨の上に座ることができます任意のマイクロを停止する s の開発から出血します。
11. 鉗子を使用すると、骨に間伐されているウィンドウの上横 4 mm ガラス基板を配置します。
12. 小さなプラスチック製や木製綿の先端アプリケータのバックを使用して、場所にウィンドウを保持するために頭蓋骨に歯科アクリルの約 100 μ L を適用。

3. ポスト外科ケア

1. 手術器具からマウスを削除し、回復のため温水ケージに配置。モニターは、それまで継続的にそれは (通常の機動性、歩行、動作、評価される) 完全な意識を取り戻しました。
2. 動物のグルーミング、食糧、および水消費、警護行動 (例えば足を引きずって、背を丸めて姿勢) または侵略を増加、活性低下を含む手術後の痛みの症状のため 3 日間 1 日 2 回を評価します。それは完全に回復するまでは、動物を他の動物の会社に返されません。
3. ブプレノルフィンを管理 (0.05-0.1 mg/kg) 3 日間手術後鎮痛 8-12 h として皮下。裂、炎症、感染の兆候に密接に術後ウィンドウの領域を監視します。動物は給餌やグルーミング行動基準に戻らない、可能な介入や安楽死について獣医に相談します。

結果

圧電手術前、に頭蓋骨から任意の残留骨膜を削除します。頭蓋骨が不透明で滑らかな (図 1 a)、外科医は、圧電手術を始める可能性があります。ピエゾ先端の振動で骨を取り外しときは、氷で頭蓋骨を灌漑するため重要です冷たいアプライド。アプライド (図 1 b) の下部先端から 1 mm が浸水した場合に、適切な灌漑が実現されます。適切な潅漑なし骨は過熱し、脳に損傷を与えます。外科医によって選ばれた所望の深さに頭蓋骨が薄くなって後可能性がありますいくつかの残留の骨にある血管から出血します。すべての出血を急激に中止するためにウィンドウの領域にアプライドに浸したコラーゲン泡の小さな 1 mm の部分を適用します。約 30 の頭蓋骨の上に座るコラーゲンを聞かせて s (図 1 c)。コラーゲンの泡を削除すると、硬膜の血管の明確に可視化をできるように、透明ウィンドウが表示されます。硬膜は、大きなあざせずそのままになります。(図 1 d)。赤と炎症を起こしている硬膜がある場合手術中に先端に適用されるあまりにも多くの圧力から壊れた血管のためそうです。新しいウィンドウを保護し慢性的なイメージングのための準備、領域にガラス基板を配置しなければなりません。正しく適用ガラス基板はウィンドウの上に座ってゆっくりと地域への損傷は行われません。ガラス基板は、ウィンドウ全体をカバーする必要があります。頭蓋骨にガラス基板を正しく適用すると、ウィンドウが半透明ガラスの下のままになります。硬膜の血管をすべてまだ目に見える (図 1e) になります。歯科用アクリルは、頭蓋骨の表面にそれを完全に遵守するガラス基板周り適用する必要があります。ガラス基板のエッジも歯科アクリル (図 1 階) で説明する必要があります。

手術 (図 2 a) あたり約 10-12 分を取って圧電手術は通常従来の頭蓋窓よりもはるかに高速であることがわかった。また、あざや出血 (図 2 b) の目によって観測された硬膜による以下の合併症があったことが分かった。適切に準備ウィンドウは、皮質ニューロンの生体内での蛍光プローブの多光子イメージングになります。レイヤー 4 皮質ニューロンの細胞体の赤いカルシウム インジケーター JRGECO1a をイメージしました (図 3 a-3B)。フェーザを使用した窓からこれらの細胞体のカルシウム濃度を観察すること。

図 1: 圧電手術。(、) 頭蓋骨フェーザの適切が準備された後。滑らかできれいな表面を残し、すべての骨膜の組織が削除されました。(b) 進行中のフェーザの代表的なイメージ。下部振動外科先端が氷の水没から 1 mm 冷たいアプライド。流体は、1 mL/分の速度で頭蓋骨に適用されます。光の円運動が頭蓋骨に適用され、超音波振動で骨を薄きます。(c) 頭蓋骨を薄めた後、コラーゲン泡の 1 mm の円形の部分はアプライドが骨から任意の微小出血を停止するウィンドウの残りの部分できる寒さに浸した。すべてそのまま血管の半透明 dura (d)、正常にウィンドウが表示されます。目に見える損傷や脳の表面にあざがあります。(e) ガラス基盤は脳の表面を保護するためにウィンドウの上に配置されます。(f) 歯科アクリルは完全に窓にガラス基板を修正する頭蓋骨に適用されます。棒 1 mm すべてのイメージのスケールです。

図 2。フェーザまたは歯科訓練の成功率の比較はドリル手術です。(A) 手術あたりの平均時間はフェーザの歯科用ドリル手術よりも低い (p < 0.05、2 尾 t 検定) n = グループあたり 30 手術と外科医あたり 10 手術の平均します。(B) (350 X ズームを設定する目的で外科医の目によって観測された硬膜に出血や目に見える破損はないと定義) 成功の手術の割合はフェーザ歯科用ドリルの手術よりも高い (n = 30 手術、グループごとに 1 つž 検定試験)。エラー バーが表示の SD

図 3。多光子イメージング体内頭蓋窓から薄くフェーザと。(A) カルシウム赤カルシウム インジケーター JRGECO1a で観測されたトランジェントをマウスの大脳皮質の生体の 4 層錐体細胞でイメージしました。スケールバー = 100 μ m。 (B) 同じウィンドウがレイヤー 4 運動皮質の異なる領域。Headfixed マウス 3 mm 窓フェーザと準備を。スケール バー = 30 μ m. 多光子顕微鏡で Imaged、40 × 対物、1040 nm 励起波長。

ディスカッション

手術は、手術のヒントを変更することによって変更できます。ハンドピースに適用できるヒントのさまざまなサイズがあります。サイズや先端の形状を変更すると、異なるサイズの窓になります。4 mm のヒントに加えまた 3 mm のチップを試みたし、それがまたうまく発見します。氷で灌漑があっても我々 は基になる硬膜の損傷につながる骨のあまりにも多くの熱を引き起こしていると書き込み集中して振動のため (約 0.25 mm) が狭すぎるがヒントで良い結果を得ることができませんでした冷たいアプライド。我々 は、使用可能なその他のヒントの多くを試していないと見込んで他の実験室はこれらの異なるヒント用の新しいアプリケーションを見つけることができます。手術は比較的簡単ですが、我々 は、トラブルシューティングが必要な場合がありますいくつかの手順があることがわかった。最初は、振動のヒントが多くの可視性を減少し、手術の手順を薄く骨の間に骨の深さを見極めの難しさを生成アプライドで乱流を生成することです。勧めしますどのように薄い骨は、骨の側に滅菌綿棒を用いて頭蓋骨とウィンドウを乾燥するための休憩を取るにも困難である場合。面の粗さは薄い骨にダメージを与えるので、ウィンドウに直接綿棒は適用されません。深さをチェックした後に、アプライドを再適用して手術を続行します。また、硬膜への損傷がある場合先端にあまりにも多くの圧力を置く外科医により通常は分かった。ハンドピースをやさしく保持、以下の力を適用するこの問題は解決可能性があります。外科医は、骨の先端を削りは強制的に、それは薄い骨でブレークが発生し、頭蓋骨に損傷を与えます。最後に、骨が薄くなる、基になる硬膜が傷ついた表示される場合、余分な熱振動による可能性が高いです。アプライドの流れの速度を増加すると、この問題が修正されます。

フェーザの主な制限は、ハンドピースは、骨を薄くことができますが、硬膜上すべての骨を削除することはできません。ダイヤモンド コーティング先端が小さな大まかなバンプ。頭蓋骨を薄くために必要な摩擦は、硬膜をすり減らすし、すべての骨を削除するために使用された場合の出血を引き起こします。したがって、残りの薄層を削除する鉗子の使用が必要です。薄い頭蓋骨を介してイメージングが少なく炎症やミクログリアやアストロ サイトの以下の増殖を生成するかどうかの進行中の討論がある、いくつかのケースで骨の残りを持たないウィンドウは、最寄りなどイメージング^{3 の大きい深さを提供するために}.

我々 は、マウスにおける多光子イメージングに備えて頭蓋ウィンドウを最適化しています。フェーザは、我々 の知識の光イメージングのための齧歯動物の頭蓋ウィンドウ手術する圧電技術の最初のアプリケーションです。我々 は、マウスにおける圧電手術の使用が増加速度の利点を共有し、また人間^7,8,9,10で報告された副作用を減少を見つけます。圧電デバイスの使用率より速く手術 (図 2 a) と高速回転と比較した場合の出血の有害事象の少ないドリル (図 2 b)。我々 もわかった、我々 のラボでフェーザ頭蓋ウィンドウ手術に対する従来のアプローチよりも学ぶ術が容易に。速度の利点と使いやすさは、外科医の間で異なる可能性があります。薄い頭蓋骨準備通常フェーザ アプローチは通常、10 分未満を必要としながらドリルとメス²骨を薄くための 30-45 分が必要です。

フェーザを使用した windows のレイヤー 4 エンコード カルシウム インジケーター JRGECO1a 関連付けられているアデノ ウイルス発現されていた大脳皮質の錐体細胞内カルシウム過渡現象をイメージできる我々 がわかった (AAV9。Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40). 我々 も見つかりましたが、ロータリー ドリルやメスを使用した薄い頭蓋骨の頭蓋ウィンドウと比較して、イメージングの領域だったロータリー ドリルを使用した薄い頭蓋骨が大きく、メスは 20 μ m 径^{2 の画像ウィンドウ}.フェーザ、我々 はすぐに 3-4 mm の領域を薄くことができた。これは、ポート⁴報告画像ウィンドウに似ています。この大きなウィンドウは、歯科用ドリルやメスを使用した薄い頭蓋骨 windows に対して報告された急速なイメージングの利点を保持します。また、フェーザと準備ウィンドウをすぐにイメージできる、伝統的な骨削除ではなくウィンドウが最適な状態にすることができます前に癒すために週を必要があります windows イメージ³。

この手法は、硬膜の下で血管内の血流の変化を研究に適用できます。重要な今後の研究は、頭蓋の] ウィンドウの他の方法をフェーザの免疫反応性を比較することです。これはフェーザが既存のメソッドと比較して少ないの炎症を生成するかどうかを決定することが重要でしょう。我々 は、ここに記載されて圧電手技の頭蓋 windows を実行し、多光子イメージングで生体を正常に使用するより多くのラボになります願っています。

ハンドピースが最低の設定で振動に設定されていると、アプライドは一定の割合で灌漑されていることを確認します。冷たいアプライドを常に適用する必要がありますまたはそれはヒートアップし、硬膜に損傷を与えます。アプライド必要があります少なくとも 1 mL/分注射器を使用するか、手で開催されたまたはハンドピースで組み込みの灌漑ではなく、蠕動ポンプ使用率で適用することがわかった。ハンドピースの灌漑システムはアプライドをあまりにも強制的に排出し、視認性が大きく落ちるがあまりにも多くの乱流を生成します。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Piezosurgery Touch	Mectron	5120062	Piezosurgery GP model has the same settings
Circular 4mm flat piezosurgery tip (# OT11)	Mectron	3370019	This tip was ideal for our windows but there are many other tips of different sizes availible.
Stereotax frame	Kopf	963
Mouse adaptor	Stoelting	51625
Peristaltic pump for irrigation.	Cole-Parmer	WU-77120-42	Makes it easier to irrigate and frees up the other hand to provide stability. Irrigation can be performed by hand with a syringe if necessary.
Avitene Ultrafoam	Bard-Davol	1050020	Important to stop any minor bleeding instantly.
C&B Metabond	Parkell	S380	Much stronger than regular dental acrylic.
Artificial cerebro spinal fluid (ACSF)	Tocris	3525
Puralube opthalmic ointment	Dechra	17033-211-38
Mice	JAX	664
Prairie Ultima multiphoton microscope	Olympus
JRGECO1a (AAV9.Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40)	UPENN Vector Core