Сыворотки и плазмы скопировать номер обнаружения с помощью ПЦР в реальном времени

Резюме

Эта рукопись описывает копии номер вариационный анализ выполняется в сыворотке или плазме ДНК методом ПЦР в реальном времени. Этот метод подходит для прогнозирования лекарственной устойчивости в устойчивые кастрация рак предстательной железы пациенты, но это может быть информативным и для других заболеваний.

Аннотация

Сыворотки и плазмы клеток бесплатные ДНК (cfDNA) было показано, как информативный, неинвазивная источник биомаркеров для диагностики рака, прогнозирования, мониторинга и прогнозирования лечение сопротивления. Начиная от гипотезы, что андрогенных рецепторов (Ар) ген копии номер (CN) получить частые события в метастатических кастрация сопротивления предстательной железы (mCRPC), мы предлагаем для анализа этого события в cfDNA как потенциальный интеллектуального биомаркеров.

Мы оценивали AR CN в cfDNA с помощью 2 различных реального времени анализы ПЦР и 2 ссылку генов (RNaseP и Аго1). Количество ДНК в 60 ng был использован для каждой комбинации assay. AR CN прирост был подтвержден с помощью цифровой PCR как метод более точного. CN вариационный анализ уже была продемонстрирована быть информативным для прогноза лечения сопротивления в параметре mCRPC, но это может оказаться полезным также для других целей в различных пациентов. CN анализ на cfDNA имеет ряд преимуществ: это неинвазивный, быстро и легко выполнять, и она начинается с небольшой объем сыворотки или плазмы материала.

Введение

Циркулирующих клеток бесплатные ДНК (cfDNA) в крови было продемонстрировано оптимальным источником биомаркеров для диагностики рака, прогноз, мониторинг и прогноз лечения сопротивление^1,2. Многие исследования показали хороший соответствий между ДНК изменения (мутации, копии номер вариации, эпигеномные изменения в тканях) и тех, кто в соответствующий плазмы образцы¹, подтверждающее, что распространение опухоли ДНК (ctDNA) информативна для первичных и метастатических опухолей ткани изменения³. Таким образом, возможность обучения ctDNA позволяет для реконструкции геномных перестроек и скопировать номер вариации (CNVs) на определенных онкогенов⁴, выявления потенциально метастатического клоновых и subclonal клетки. CtDNA было показано, быть клинически полезным, особенно для рака лечение мониторинг как он укрывает специфических мутаций и CNVs, связанные с конкретной целевой терапии^5,6. Он также преодолевает потребность биопсия тканей и позволяет результаты должны быть получены в разное время лечения конкретных рака неинвазивным способом.

Что касается рака простаты, существенная корреляция между циркулирующих клеток свободных андрогенов рецепторов (Ар) CNVs и лечения ответ на abiraterone и enzalutamide было показано, число копии гена показывающее AR (CN) в cfDNA может быть перспективным биомаркер способны прогнозировать лечение сопротивления^7,8,9,10,11. CNVs конкретных генов в ctDNA может оцениваться с использованием различных подходов с разной чувствительностью, стоимости и оперативности (например. ПЦР в реальном времени, цифровой и следующего поколения последовательности).

Здесь мы опишем простой и быстрый подход, основанный на дуплекс анализов в реальном времени технологии PCR, для оценки AR CN в cfDNA^7,образцы сыворотки и плазмы⁸. Мы рассмотрели два различных анализы ПЦР, разработан в двух различных регионах геномной Интрон 5 AR (Xq12) и два других генов, как внутренние стандартных генов, известно, что число статус обычных копирования рака простаты (RNaseP, расположен на 14q11; Назад1, расположенный на 1 p 34). Мы выбрали два ссылку генов, а не один, чтобы увеличить точность и чувствительность результатов. ДНК, количество 60 ng был усилен для каждой комбинации пробирного (комбинированные проба для AR-assay_1 + RNaseP и AR-assay_2 + AGO1). Три образцы ДНК сыворотки или плазмы, от здоровых мужчин были объединены и используется как калибратора. Мы рассматривали предохранители от > 1.5 для AR выгоды и < 0.5 для удаления. Одним из главных преимуществ этого метода является, что он является гибким и что другие гены может также оцениваться, изменять стандартную внутреннюю ссылку генов, на основе типа опухоли и характеристики.

протокол

Протокол состоит из изоляции ДНК пробах сыворотки или плазмы для выполнения копирования номер анализа ПЦР в реальном времени. Были исполнены экстракции ДНК, ДНК количество управления (Спектрофотометр) и ПЦР в реальном времени для конкретных целей. На рисунке 1сообщается резюме процедуры и сроки.

Протокол следует принципам IRST человека Комитет по этике исследований.

1. сыворотка сбор и обработка

1. Собирают около 5 мл цельной крови в сыворотке крови трубки без антикоагулянта для получения сыворотки. Поддерживать Трубы крови при температуре 4 ° C до обработки.
2. Пробирок на 1000 x g 15 мин при 4 ° C.
3. Тщательно передачи сыворотки в 2 мл пробирок.
4. Отказаться от сбора трубки и немедленно заморозить супернатант в-80 ° C до использования.

2. плазмы сбор и обработка

1. Соберите около 10 мл цельной крови в плазме трубки с ЭДТА получить плазмы. Полностью заполнить трубу и затем инвертировать его 8 раз. Поддерживать Трубы крови при температуре 4 ° C до обработки.
2. Центрифуга трубки на 1800 g x 15 мин при комнатной температуре с параметра нет тормозов на центрифуге.
3. Тщательно перенесите в верхней части плазмы в 2 мл пробирок. Повторите передачу, оставляя по крайней мере 1 мл супернатант над слоем белых клеток.
   Примечание: Перенос в верхней части супернатант уменьшает риск загрязнения клетки или клетки мусора.
4. Отказаться от сбора трубки и немедленно заморозить супернатант в-80 ° C до использования.

3. ДНК изоляции от сыворотки или плазмы

Примечание: Изоляции ДНК из сыворотки или плазмы должно производиться с использованием коммерческих протокола, изменения в следующих шагах.

1. Размораживать один Алиготе (содержащие от 0,5 до 2 мл) сыворотки или плазмы при комнатной температуре.
2. Вортекс и перемешивают образец и передачи 0,5 мл сыворотки или плазмы в ясно 1,5 мл трубку. Заморозить остальные материала при температуре-80 ° C.
3. Добавьте 50 мкл протеиназы k (20 мг/мл) непосредственно в образце.
4. Добавить 0,5 мл буфера lysis образца и смешайте хорошо закупорить.
5. Закройте трубы и Проинкубируйте образцы на 56 ° C в течение 15 мин в блоке тепла.
6. Добавьте указано количество 100% этанола в мыть буфер 1 и 2, как указано в инструкции изготовителя.
7. Принести образцы обратно до комнатной температуры и добавить 0,5 мл абсолютного этанола и смешайте хорошо закупорить.
8. 650 мкл смеси, полученного на шаге 3.7 разделения столбцов и центрифуги на 6000 x g за 1 мин.
9. Отменить трубка, содержащая через поток и столбце на новой чистой коллекции трубки. Повторите шаги 3.8 и 3.9 еще один раз.
10. Добавьте 500 мкл буфера мытья 1, без смачивания краю столбца и центрифуги на 6000 x g за 1 мин.
11. Отменить трубка, содержащая через поток и заменить ее новой коллекции чистый трубки.
12. Добавьте 500 мкл буфера мытья 2, без смачивания краю столбца и центрифуги на полной скорости (20000 x g) 3 мин.
13. Отменить трубка, содержащая через поток и заменить ее новой коллекции чистый трубки.
14. Центрифуга на полной скорости (20000 x g) 3 мин для удаления любых остаточных Отмывающий буфер.
15. Место столбца в чистой 1,5 мл трубку. Добавить 150 мкл буфера и ждать 7 мин, чтобы убедиться, что буфер смачивает столбец.
16. Центрифуга на 8000 x г за 1 мин.
17. Пипетка elute от шага 3.16 снова в тот же столбец и центрифуги на полной скорости (20000 x g) за 1 мин для обеспечения максимального восстановления ДНК.

4. ДНК количественной и разбавления

1. Выполняют количественного определения ДНК с помощью спектрофотометра. Используйте 2 мкл пример на скамейке Топ спектрофотометром в соответствии с инструкциями изготовителя.
   Примечание: Если количество ДНК не является достаточно, чтобы продолжить с ПЦР в реальном времени (по крайней мере 120 ng), выполнения новый процесс изоляции ДНК.
2. Разбавляют ДНК из сыворотки или плазмы до 2,5 нг/мкл в окончательном объеме, достаточном для всех реальном масштабе времени PCR (около 50 мкл).

5. в реальном масштабе времени PCR

1. Оттепель копировать количество анализов, ссылка гена пробирного, образцы ДНК разбавленный и калибраторы, объединили в лед. Сбалансировать при комнатной температуре мастер смесь, которая хранится на 4 ° C.
2. Подготовка смесь 1 мкл целевого анализа, 1 мкл ссылка гена пробирного и 10 мкл мастер смеси для 3 реплицирует каждого образца и калибраторы пуле. Подготовка смеси, в том числе отрицательного контроля (вода) и 2 дополнительных образцов.
3. В 96 хорошо пластины, аликвота 12 мкл смеси в каждой скважине. Сделать не пипеткой или спин трубы.
4. Мкл 8 (концентрация 2,5 нг/мкл) каждого образца ДНК и калибраторы, объединили в каждой скважине. Сделать не пипеткой или спин трубы. Изменение подсказки для каждой скважины.
   Примечание: 30 образцов ДНК могут быть обработаны для каждого реального времени эксперимент с использованием 96-луночных пластины: образцы 30 x 3 + 1 x 3 калибраторы пуле + отрицательный контроль = 94.
5. Кратко вращаться вниз пластину на 1000 x g.
6. Запустите пластину, используя следующий протокол: провести этап на 95 ° C в течение 10 мин, 40 циклов при 95 ° C 15 s и 60 ° C в течение 1 мин.

6. анализ данных и интерпретации

1. В разделе «опции», ниже результатов амплификации сюжета, установите порог Ct на 0,2 для первого целевого гена проанализированы. Повторите набор для каждой целевой объект или ссылку генов. Чтобы экспортировать в реальном времени PCR в расширение .txt, нажмите «Экспорт» в панели инструментов. Флаг только «результаты» в окне Выбор данных для экспорта → выбрать как тип файла расширение .txt → нажмите «начать экспорт» → закрыть средство экспорта.
2. Откройте программное обеспечение для анализа и импорта файла .txt (инструментов → импорта).
3. Выберите имя файла для анализа и выбора анализа параметр на панели инструментов (играть символ).
4. Укажите калибровочных образцов и известное количество экземпляров целевого объекта (например, 1 копия гена AR ). Нажмите «Применить».
5. Для каждого образца Опустите один колодец с различными Дельта Ct (ΔCt) по сравнению с другими скважин.
6. Повторный анализ эксперимента (пресс играть символ).
7. Оцените результаты по номеру копирования бар сюжет или таблицы.
   Примечание: Таблица результатов содержит множество параметров, как доверие, Z-скор и реплицирует проанализированы, которые могут быть полезны для интерпретации результатов.

Результаты

Общая cfDNA концентрация была количественно методом спектрофотометрии для всех образцов, анализ, показаны медиана 6.12 нг/мкл (диапазон: 2.00-23.71 нг/мкл) для образцов сыворотки и медианные 3.21 нг/мкл (диапазон: 2.31-8.49 нг/мкл) для образцов плазмы. Мы проанализировали в общей сложн?...

Обсуждение

AR CN анализа в сыворотке и плазме крови образец представляет собой новый, неинвазивная подход для стратификации пациентов рака простаты устойчивы кастрация (УПК). Недавно было продемонстрировано, что AR CN способна прогнозировать результаты в УПК пациентов с abiraterone и enzalutamide, до и...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Vacutainer Serum Tubes	Becton Dickinson	367814	whole blood tube for serum
BD Vacutainer EDTA Tubes	Becton Dickinson	366643	whole blood tube for plasma
Ethanol absolute	VWR		the user could use also other companies
TaqMan Copy Number assay	Thermo Fisher Scientific	4400291	Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283
TaqMan Copy Number assay (modified)	Thermo Fisher Scientific	4467084	Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn
TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P	Thermo Fisher Scientific	4403326
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4326708	Master mix for Real Time PCR
QIAamp DNA Mini Kit (50)	Qiagen	51304	DNA extraction kit
MicroAmp 96-Well Plates	Thermo Fisher Scientific	N8010560	plates for realt time PCR
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	-	the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA
7500 Fast Real-Time PCR System	Applied Biosystem	-	the user could use also other real time instrument
CopyCaller Software	Applied Biosystem	-	Software for copy number analysis