生体内で破壊カルス開発マウス大腿骨の骨、MRI 対応のデバイスを用いたマウスの骨治癒過程の評価

要約

軟骨内骨の治癒過程における破壊カルス組織の発達の評価は、癒しのプロセスを監視するため不可欠です。磁気共鳴画像 (MRI) の使用を報告する-マウスにおける骨再生中、MRI を許可するマウス大腿骨の互換性のある創の外固定が器にスキャンします。

要約

軟骨骨折治癒骨折カルス線維、骨、軟骨組織の開発を含む複雑なプロセスです。カルスのさまざまな組織の量は骨折の治癒経過に関する重要な情報を提供します。縦小動物を用いた前臨床骨折治癒研究におけるカルス組織の発達を監視する生体内で利用できる技術には、デジタル撮影と µCT イメージングが含まれます。しかし、両方の技法、石灰化と非石灰組織を区別することができるのみ。その結果、線維組織からの軟骨を区別するため不可能です。対照的に、磁気共鳴画像 (MRI) は含水率に基づく解剖学的構造を可視化して、軟部組織や軟骨破壊のカルスを非侵襲的識別することがあります。ここで、MRI 対応に対して、創外マウス大腿骨のマウスにおける骨再生中に MRI スキャンを許可するの使用を報告します。実験を創固定器とカスタムメイドのマウント デバイスできることを紹介反復的な mri 従って破壊カルス組織の発達に関する縦断的分析を有効にします。

概要

二次癒合骨癒しの最も一般的な形式です。生育に伴う軟骨内骨化^1,2,3の特定の側面を模倣した複雑なプロセスです。早期の骨折血腫は主に免疫細胞、粒状化および線維組織ので構成されます。低酸素分圧および高い生体力学的緊張破壊ギャップで骨芽細胞分化を妨げるが、軟骨^4,5,6前駆細胞の分化を促進します。これらの細胞は、骨の骨折の初期安定性を提供する軟骨基質を形成する傷害の部位で増殖を開始します。カルスの成熟過程における軟骨細胞の肥大、なり受けるアポトーシス、またはトランス-骨芽細胞に分化します。軟骨の骨転移の地帯で血管新生は、⁷骨組織の形成を許可する高酸素レベルを提供します。骨破壊ギャップの橋渡し後、生体力学的安定性が増加し、生理学的な骨の輪郭と構造³を得るために発生する外部破壊カルスの培養破骨細胞を改造します。したがって、線維、軟骨、骨破壊カルス組織の量は骨治癒過程に関する重要な情報を提供します。カルス組織の発達人間とマウス^8,9,10,11の両方の変化によって癒しの障害または遅延が表示されます。デジタル ラジオグラフィーとイメージング^12,13µCT 縦カルス組織における前臨床骨折治癒の小動物を使用して研究を監視する生体内で利用できるテクニックが含まれます。ただし、両方の技術は無機非石灰化組織の間で区別することができるのみです。対照的に、MRI は優れた軟部組織コントラストを提供し、軟部組織や軟骨破壊のカルスを識別することがあります。

前作は、膜内骨欠損治癒¹⁵中マウスの死後MRI マウスにおける関節骨折¹⁴とin vivo MRI のための有望な結果を示した。しかし、両方の研究はまた限られた空間解像度と組織のコントラストを述べました。以前、マウス軟骨骨折¹⁶を治癒の間に柔らかいカルス形成の縦断的評価のため生体内で高分解能 MRI の可能性を示した。ここでは、MRI 対応に対して、創外マウスの大腿骨骨切り術を用いた軟骨骨折治癒経過中に縦カルス組織開発を監視するためにプロトコルを報告します。創外固定器の挿入のためのカスタムメイド取付デバイスのデザインは、繰り返しスキャン中に標準化された位置を確保しました。

プロトコル

すべての動物実験管理と実験動物の使用のための国際規則を遵守し、(第 1250, Regierungspräsidium テュービンゲン、ドイツ) は、地域の規制当局によって承認されました。すべてのマウスは 14 h ライトにケージごと 2 ~ 5 動物のグループで維持され、水と食料と 10 h 暗い概日リズム提供 広告自由

。

1 です。 手術材料やマウスの前処理の準備

1. 定置滅菌すべて手術材料。滅菌時間の 20-30 分のための 120-135 ° C のオートクレーブ温度を使用します
。
2. 購入 C57BL/6 マウスまたは 19 35 g 体重の間にある別の負担からマウス。適切な動物の世話や調査官によって承認されている国家のガイドラインに従って実験プロトコルに従う ' s 施設動物ケアおよび使用委員会。最低限の手順を開始する前に 7 日間馴化期間の許可します
。
3. 術後 3 日まで術前に、1 日飲料水を介してすべてのマウスに鎮痛を提供します
。

2。手術の手順と創外固定器の応用

1. 管にマウスのプリロード 5-7% のイソフルランと 60 mL/分の酸素の場所。姿勢反射の損失の後麻酔誘導管から、マウスを削除し、1-3% のイソフルランと 60 mL/分の酸素を提供する吸入マスクで麻酔を維持します。 麻酔中に
   1. モニター呼吸パターンと後肢足反射。呼吸数は約 100 サイクル/分、後肢の反射が存在しないことを確認します
      。 ​ 注: 必要なガスの量は年齢、性別、体重、およびマウスのひずみに依存します
   。
2. 術前注入マウス単一用量の抗生物質の皮下 (クリンダマイシン、45 mg/kg)。さらに、生体の体液バランスの維持のため 500 μ L の生理食塩水の皮下流体デポとマウスの挿入 (0.9 %nacl).
角膜を防ぐために
3. は、マウスの目に眼軟膏を適用、乾燥します。麻酔中に 37 ° C で加熱板の上にマウスを置くし、生理を維持する手術体温します
。
4. は右後肢から毛皮を取り外してアルコール ベースの消毒薬と外科の領域をスクラブします。無菌ではない区域を避けるために滅菌手袋の小さな部分と右後肢をカバーします。3 回右後肢を消毒します。外科領域を除いて全体のマウスに滅菌ドレープを配置します
。
5. は、メスで右大腿骨の前方の側面に沿って縦皮約 1 cm を切開します。マイクロのハサミ、鉗子で 大腿二頭筋筋 と 外側広筋 を露骨に区切ります。骨の前外側部分への無料アクセスを許可するようにマイクロ シザーと大腿骨転子で腱原点側をカットします。坐骨神経が保持されることを確認してください
。
6. は、大腿骨に平行、創外固定器 ( 図 1 A N/mm 3 の軸剛性) を配置します。手動で 0.45 mm のドリルビットと皮質を介して孔をドリルし、試錐孔にピンをマウント セラミックを配置します。最も遠位ピンに続いて、最も近位ピンと 2 つのピン間に起動します。
   1. がない引張、圧縮、またはせん断力、創固定器取付手順の中にそうでなければ骨切り達成のギャップは、創固定器の緩和のため十分なされませんを確認してください
   。
7. 鋸引きのプロシージャ中に脱水症状を避けるために滅菌食塩の量が少ないと骨を加湿します
。
8. 0.4 mm のジリ ワイヤソーを用いた 2 つの内側のピン間全体の骨骨切り術 0.4 mm を作成します
   。 注: 必要に応じて、振動マイクロ見た使用できます、骨切り術を作成します。骨切り術領域で見たから任意の金属チップを避けるようにしてください
。
9. フラッシュ 2 つの骨折した皮質間骨チップを削除する滅菌食塩の 2 mL で慎重に骨切り術ギャップ
。
10. 吸収性縫合糸の連続縫合を用いた筋肉の適応 (材料の表 を参照してください)。それから非吸収性縫合 (材料の表 を参照) を使用して、肌を調整します。噛み傷を避けるため、傷の頭蓋部に縫合線を配置しないでください
    。 注: は皮膚接着剤を使用しない、またはクリップ マウスは通常傷の原因からそれを削除するのでさらに肌にダメージを与える
。
11. 消毒剤で外科の領域をきれいにし、そのケージ モニターにマウスにマウスを置くとそれまで供給十分な熱を (例えば 赤外光によって) は完全に目を覚まし。 手術後水、食物摂取量と体重を監視。動物は痛みや苦痛のないことを確認します。術後 3 日まで飲料水を介してすべてのマウスに鎮痛を提供します
    。 注: 最大 4 つの動物のグループで収容されるマウスします
。
12. 監視マウス ' 手術後日 1 に 5 の活動。その経過中にマウスは作動肢に体重を支える必要があります。それ以外の場合、マウスはさらに解析から除外する必要があります
。

3。Mri 検査の手順と画像解析

1. MRI スキャンのプロシージャ、する前に 2.1 と 2.3 の手順でプロトコルに従ってマウスを anaesthetize し、して、呼吸速度が約 100 サイクル/分の右後肢で創外固定器を挿入、カスタムメイドの取り付け装置 ( 図 1 B、C) に慎重にマウス。
   1. これは骨折治癒を妨げることがありますので、曲がるか、またはこの手順中に、創固定器の圧縮を避けることを確認します
      。 注: MRI スキャン早く動物のケアと実験的プロトコルに応じて、術後 3 日も実施できます
   。
2. MRI 装置導入のための温度制御クレードル上にマウスを置きます。剛 4 要素の先頭のコイル マウント デバイスに接続します
。
3. 11.7 t 営業専用高電界小動物 MRI システムを用いた MRI の取得データ
   ​ 注: ネジに直交の大腿骨骨付き、MRI データ集録ジオメトリを配置します。 プロトン密度脂肪抑制マルチ スライス東証シーケンス (PD 東証) を適用することによって
   1. 取得データ集録パラメーターを使用して: エコー/繰り返し時間テ = 5.8 ms/TR 2,500 ミリ秒、解像度 Δr を = = 52 × 52 × 350 µm³ の視野 (FOV) =20 × 20 mm ²、および帯域幅 Δω = 150 KHz
   。
   2. 注: 22 スライスの総収集時間は 36 分
4. 画像解析ソフトで取得したデータを開きます。0.35 mm ³ × 0.05 × 0.05 ボクセル サイズを入力します。次のように半自動しきい値設定法とその強度に基づく破壊カルス (骨、軟骨、線維性組織/骨髄) のさまざまな組織をセグメント化します。
   1. をクリックして、" 新しいラベル フィールドの編集 " をクリックして " 追加材料 " にマテリアルの名前を変更 " カルス "。使用して骨膜からハイポ強烈な信号に基づいて周囲の組織からカルス領域を区別、" なげなわ " ツール
   。
   2. クリック " 材料に追加 "。クリックして " 追加材料 " にマテリアルの名前を変更 " 軟骨 "。軟骨をセグメントを使用して、" のしきい値 " ツールと " 現在材料のみを選択 " から " カルス "。クリックして " 軟骨 "、" 材料に追加 "。これらの手順を繰り返します " 骨 " と " 骨髄/線維組織 " です
   。
5. 画像解析ソフトを利用したデータをセグメンテーションする組織に基づく骨折に対する大腿骨の 3 D 復元を生成します。クリックして " 生成表面 "、適用 " なし " の " スムージング タイプ " クリック " 表面表示 ".
   注: 非常に小さな、超強烈な en の周辺骨折の野の ds は骨から軟部組織への移行のための成果物になる可能性があります。これらの分野は、さらなる分析から除外すべき。骨折治癒を表す軟骨組織の軟骨段階でカルスの破壊の途中でハイパー激しいエリア。軟骨内骨化段階で骨切り術ギャップから遠位骨折カルスでハイポ激しい分野と癒しの段階の後で全破壊カルス中で同じ強度のエリア新たに形成された骨カルス組織を表します。これらの領域には、ハイポ強烈な信号があるが、成熟した骨 (皮質) からの信号強度はさらに低いです。しきい値処理後は、骨組織と軟骨組織破壊カルスでの信号の強さは骨髄として残りの組織や線維組織をマークします。組織の分割の値: 3.4 5.4 範囲骨髄/線維組織、骨の組織 (成熟皮質、骨、骨カルス組織を含む) 1 3.3 (成熟皮質に正規化された信号強度) の範囲内でセグメント化と5.5 6.2 の範囲内軟骨カルス
。
6. 、必要な場合は、MRI スキャンを骨折治癒経過中に縦繰り返します。軟骨のカルスの開発を監視し、手術後 10、14、21 日にマウスをスキャンする
   。 注: タイム ポイントは動物のケアと実験的プロトコルに依存可能性があります
。

結果

最初に、(図 2の例を参照してください), MRI スキャンの解析による手術の成功を確認できます。すべての 4 つのピンは大腿骨骨幹部の真ん中に位置する必要があります。骨切り術のギャップのサイズは 0.3 から 0.5 の間する必要があります mm。骨切り術のギャップのサイズは、これらの値から大きく異なる場合、マウスをさらに分析から除外すべ?...

ディスカッション

変更とトラブルシューティング:

本研究の主な目的は、軟骨骨折治癒プロセスの間に縦のカルス組織開発を監視する機能を持つマウスの大腿骨骨切り術、MRI 対応創外固定器の使用のためのプロトコルを記述するためだった。創外固定器の挿入のためのカスタムメイド取付デバイスのデザインは、繰り返しスキャン中に標準化された位置を確保しました。半自?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anaesthesia tube	FMI, Seeheim, Germany	ZUA-82-ANA-TUB-Mouse
Anaesthetic machine	FMI, Seeheim, Germany	ZUA-82-GME-MA
Artery forceps	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BH104R
Autoclave	Systec, Wettenberg, Germany	DX-150
Autoclaving packaging	Stericlin, Feuchtwangen, Germany	2301-04/06/10/12/16
Avizo software	FEI, Burlington, USA	-	Version 8.0.1
BioSpec 117/16 magnetic resonance imaging system	Bruker Biospin, Ettlingen, Germany	117/16
Bulldog clamp	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BH 021R
Carbon steel scalpel no. 11/15	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BA211/215
Ceramic mounting pin 0.45 mm	RISystem, Davos, Switzerland	HS691490
Clindamycin (300 mg / 2ml)	Ratiopharm, Ulm, Germany	-
Dressing forceps 115 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BD210R
Dressing forceps 130 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BD025R
Drill bit coated 0.45 mm	RISystem, Davos, Switzerland	HS820420
Durogrip needle holder 125 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BM024R
Foliodrape	Hartmann, Heidenheim, Germany	2513026
Frekaderm	Fresenius, Bad Homburg, Germany	4928211
Gigli saw 0.44 mm	RISystem, Davos, Switzerland	RIS.590.110.25
Hand drill	RISystem, Davos, Switzerland	RIS.390.130-01
Heating plate	FMI, Seeheim, Germany	IOW-3704
Hygonorm gloves	Hygi, Telgte, Germany	2706
Isoflurane	Abbot, London, UK	Forene
Micro forceps 155 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BD343R
Micro scissors 120 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	FD013R
Mouse FixEx L 0.7 mm	RISystem, Davos, Switzerland	RIS.611.300-10
Needle case for drills	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BL911R
Needle holder	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BB078R
Octenisept	Schülke, Norderstedt, Germany	121403
Osirix software	Pixmeo SARL, Bernex, Switzerland	-	Version 4.0
Oxygen, medical grade	MTI, Ulm, Germany	-
Resolon 5/0	Resorba, Nürnberg, Germany	88143
Saline 0.9%	Braun, Melsungen, Germany	3570350
Scalpel handle 125 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BB073R
Scissors 150 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BC006R
Sealer for autoclave packaging	Hawo GmbH, Obrigheim, Germany	HM500
Sterican 27 G	Braun, Melsungen, Germany	4657705
Sterile surgical blades no. 11/15	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BB511/515
Surgical gloves	Hartmann, Heidenheim, Germany	Peha-micron 9425712
Surgical light	Maquet SA, Ardon, France	Blue line 80
Syringes 5 ml	Braun, Melsungen, Germany	Injekt 4606051V
Tissue forceps 80 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	OC091R
Tramadol 25 mg/l	Grünenthal, Aachen, Germany	100mg/ml
Vasofix Safety	Braun, Melsungen, Germany	4268113S-01
Vicryl 5-0	Ethicon, Norderstedt, Germany	V30371
Visdisic eye ointment	Bausch & Lomb, Berlin, Germany	3099559