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要約

非イオン性界面活性剤相分割手法を用いた細菌のリポタンパク質の濃縮は、TLR の試金で直接使用したり、他のアプリケーションの説明します。詳細さらなるステップは、質量分析法による構造解析の N 末端トリプシン lipopeptides を準備します。

要約

リポ蛋白は、細胞膜の重要な構成要素と哺乳動物の生得の免疫反応の強力な活性剤です。細胞生理学と免疫学にその重要性にもかかわらず多くの新しいリポ フォーム、合成方法、および宿主免疫能に関する様々 な形態の影響について発見される遺跡します。リポタンパク質に関する徹底した研究を有効にするには、このプロトコルを記述する細菌のリポタンパク質濃縮法と N 末端トリプシン lipopeptides のマトリックス支援レーザによる構造決定のための準備脱離イオン化飛行時質量 (MALDI-TOF MS)。プロトコルにはリポタンパク質の抽出と濃縮細菌の細胞膜から分割設立 Triton X-114 段階で拡大して、リポ蛋白の収率を増加させる、非リポタンパク質の汚染物質を除去する追加の手順が含まれていて、純度。リポタンパク質は、Toll 様受容体 (TLR) 試金で一般に使用され、最初 MALDI-TOF さん・・・による N 末端構造を特徴づける重要なは、N 末端の濃縮濃縮された疎水性ペプチドを分離する手法を提案します。lipopeptides ナトリウム Dodecyl 硫酸塩ポリ アクリルアミド ゲル電気泳動 (SDS-PAGE) によって分離されている MALDI-TOF MS さんのリポタンパク質の直接分析に適したニトロセルロース膜に転送されますその場で消化トリプシン、順番にポーラー由来ペプチドを削除する洗浄し、最後にクロロホルム-メタノールで溶出します。洗浄溶液からより極 trypsinized ペプチドの MS と相まって、このメソッドは、リポ蛋白質を識別して単一の実験でその N 末端を特徴付けるのための機能を提供します。意図的なナトリウム付加体形成より多く構造的に有益な断片化スペクトルを促進するツールとしても採用することができます。最終的には、リポタンパク質の濃縮とその N 末端構造の決定は、細菌蛋白質のこのユビキタス クラスのより広範な調査が許可されます。

概要

細菌のリポタンパク質は、節約された N ターミナル脂質修飾システイン細胞膜の表面に球状タンパク質ドメインをアンカーによって特徴付けられます。彼らは普遍的に、典型的なゲノム1内のすべての細胞遺伝子の 2 ~ 5% を構成する細菌で配布されます。リポタンパク質はさまざまな養分吸収、シグナル伝達、細胞プロセスで重要な役割を再生、タンパク質複合体の維持およびアセンブリ細胞エンベロープ構造健全性2。病原性細菌のリポタンパク質は病原性因子3,4として機能します。感染中は、Toll 様受容体 (TLR) 2 によって N 末端 lipopeptides の認識は侵入病原体を削除する自然免疫応答を誘発します。N 末端のアシル化状態に応じてリポタンパク質一般に代替 TLR2 ヘテロ二量体複合体によって認識されます。TLR2 TLR1 は、TLR2 TLR6 バインド無料リポペプチド α-アミノ酸テルミニ間の N アシル化 lipopeptides を認識しています。炎症性サイトカイン3,4の分泌を誘発するのにバインドされた後、シグナル伝達経路は収束します。

以前、グラム陽性細菌由来のリポ蛋白だったおよびグラム陰性菌からの diacylated triacylated、節約された N ターミナル システイン残基のアミド結合脂肪酸の有無が異なると考えた。この仮定は、Lnt、triacylated リポ蛋白5を形成するグラム陰性 N アシル転移酵素にグラム陽性菌ゲノムのシーケンスのオルソログ遺伝子の欠如によって支えられました。しかし、最近の研究は明らかにグラム陽性フィルミクテス門その欠如lntでリポ triacylation として、ペプチド、lyso とN -アセチル フォーム6,7 と呼ばれる 3 つの新規 N ターミナル リポタンパク質構造 ,8。これらの調査結果はまだ発見の可能なリポ蛋白フォーム、様々 な形態を伝えるこれらの小説のリポタンパク質の作り方について基本的な質問どのような生理学的な目的や利点と一緒にについて問題を提起します。さらに、彼らは明らかに、リポ蛋白質の構造を予測するためのゲノム科学の現在できないことを示しています。確かに、リポタンパク質 N アシル基転移酵素は、腸球菌セレウス菌、lyso フォーム リポタンパク質9から点灯と呼ばれるの新しいクラスが最近わかりました。これは実験的、非常に疎水性とその分子構造の特性評価に利用可能な限られた方法のために挑戦することができますリポ蛋白の構造を確認する必要を示します。

リポ蛋白質 N 末端構造決定と同様に、宿主の免疫応答の誘導に関する研究を容易にするには、我々 は細菌性リポ蛋白質を浄化し、トリプシンの N 末端を準備するためにいくつか説明したプロトコルを適応しています。MALDI-TOF MS6,10、11,12による解析のための lipopeptides。リポタンパク質は、汚染の非リポタンパク質を削除し、リポタンパク質の収穫を増加するための最適化を使用してメソッドを分割設立 (界面活性剤またはテキサス州 114 と今後は呼ばれる) Triton X-114 位相を用いた濃縮されています。これらの脂蛋白質は SDS ページによって更に精製、TLR の試金で直接使用するために適しています。MALDI-TOF MS の硝酸セルロースの膜にリポ蛋白の転送はトリプシン消化効率の良いその場の足場を提供し、洗浄、および高の結果、膜表面からその後溶出精製 N 末端 lipopeptides。ニトロセルロースは検体の取扱いを容易にし、リポタンパク質9,10 と同様に不可欠な膜蛋白質13,14から高疎水性ペプチド シーケンス カバレッジを向上させる示されています。.このメソッドは単一の実験の N 末端構造決定と同時に精度の高いタンパク質同定の中間洗浄ソリューションを解析するので、極性に基づくペプチドを分留の付加的な利点.このプロトコル一意に機能意図的なナトリウムは、MS/MS Nアシル化状態の構造の割り当てを支援中に dehydroalanyl イオンに向かって親イオン化を促進するために形成を付加物します。N 末端は、リポタンパク質の TLR の認識に関連する最も変数とキーの両方の機能です。一緒に取られて、このプロトコルが精製と簡単に実験の全体的な目標に応じて適応 MALDI-TOF 質量分析法による構造決定の個々 の段階でのリポタンパク質に集中的に、再現性のある研究をできました。

プロトコル

1. セル成長および換散

  1. 遅い指数段階 (外径600 1.0 1.5) に 15 mL のトリプシン大豆のスープ (TSB) または同じようなリッチ メディアの細菌を成長します。遠心分離によって細胞を収穫、トリス緩衝生理食塩水/EDTA (TBSE) で 1 回洗浄しプロトコルは、または使用するまで凍結します。
    注: TBSE: 20 mM トリス塩酸 (HCl)、pH 8.0、130 mM 塩化ナトリウム (NaCl) と 5 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA))。リポ蛋白の発現と修正は、(例えば酸味、塩分、成長媒体) の成長条件と成長段階15によって影響があります。細胞の成長は望ましい、しかし 15 mL スケールが過剰なバイオマスは、リポタンパク質収量を減らすことができます、セルのリポタンパク質の 1 つの準備のため推奨です。1 つ 15 mL 準備は一般的に 2 ~ 4 の最適な読み込みのために十分なサンプルを生成標準 SDS ページのミニ ゲルの車線。
  2. 800 μ L TBSE 1 mM フェニルメチル フッ素 (PMSF) と 0.5 mg/mL リゾチーム細胞を再懸濁します。スクリュー キャップと o リング 2.0 mL スレッド微量遠心チューブにソリューションを転送し、37 ° C で 20 分間インキュベート
    注: 特定の種はリゾチームによる溶解に感受性がないです。換散の支援するためには、適切な酵素を置き換えてください。
  3. チューブに 〜 800 μ L 0.1 mm ジルコニア ・ シリカ ビーズを追加し、30 の 5 サイクルの圧力式ホモジナイザーの最大速度 (7,000 rpm) で揺することによって細胞を混乱させる各サイクル間氷の上残り 2 分、それぞれ s。
  4. (ビーズと切れ目のない細胞の餌) に 4 ° C で 5 分間 3000 × g で遠心分離機のサンプルです。新しい 2.0 mL 遠心チューブに上清を転送して氷の上。
  5. 残りのペレットに TBSE 200 μ L を追加し、追加のサイクルのホモジナイザーに戻ります。(上記) 遠心し、(800-1000 μ L の総ボリュームあるべき) 以前の上澄みで上清を組み合わせます。

2. テキサス州 114 フェーズ分割によるリポタンパク質の濃縮

  1. 逆解析による混合 〜 15 分毎、1 時間氷上インキュベートし、4% (巻/巻) 冷たい TBSE の界面活性剤の等しい量を追加することによって最終濃度 2% (巻/巻) のテキサス州 114 を界面活性剤で上清を補完します。
    注: ときに冷やして、上澄みと界面活性剤になります混和性。
  2. 37 ° C の水浴にチューブを転送し、相分離を誘発する 10 分間インキュベートします。Bi 一過性の分離を維持するために室温で 10 分間、10,000 × g でサンプルを遠心します。
  3. 優しくピペットの上部の水相をオフし、破棄します。元のボリュームにチューブを補充する低い界面活性剤相に冷たい TBSE を追加し、ミックスに反転します。氷上で 10 分間インキュベートします。
  4. 37 ° C の水浴にチューブを転送し、相分離を誘発する 10 分間インキュベート、室温で 10 分間、10,000 × g で遠心分離します。
  5. 3 分版の合計に対して手順 2.3 2.4 をもう一度繰り返します。上層の水相を削除し、破棄します。
  6. 界面活性剤相に冷たい TBSE の 1 ボリュームを追加して (管の下部に表示されます)、抽出の過程で形成された沈殿したタンパク質のペレットを削除します。不溶性タンパク質を餌に 2 分 16,000 x g で 4 ° C で遠心分離機します。
    注: サンプル単相のままする必要があります。相分離が発生すると、再サンプルを冷やすし、再び遠心分離します。ペレットが非リポタンパク質の汚染物質の一般的構成の詳細な分析を保持できます。
  7. すぐに 100% アセトンの 1250 μ L を含む新鮮な 2.0 mL 遠心チューブに上清を転送します。粘性があるため先端からサンプルを洗う徹底的に上下ピペットします。逆解析による混合し、蛋白質を沈殿させるのに-20 ° C で一晩インキュベートします。
  8. 管の向きに注意してリポタンパク質ペレットを室温で 20 分間 16,000 x g でサンプルを遠心します。リポタンパク質管の外の壁に沿って薄く、白い膜が形成されます。
  9. 100% アセトンで 2 回ペレットを洗浄します。アセトンをデカントし、乾燥空気サンプルを許可します。
  10. 10 mm トリス-HCl、pH 8.0 または標準的な塩化物イオンと SDS ページ サンプル バッファー16 20 40 μ L を追加し、沈殿したリポタンパク質が付いている壁に対して上下にピペッティングして徹底的に再懸濁します。リポタンパク質を取り除くためピペット チップ、チューブの側面をこすり。
    注: リポタンパク質は Tris バッファーでは分解しないが、懸濁液を形成します。
    1. 使用するまで-20 ° C でリポを保存します。

3. SDS-PAGE、ウェスタンブロッティング、およびプロトコルが Ponceau s 染色

  1. 標準的な方法16を使用して SDS ページによる独立したリポタンパク質。
    注: 適切なゲル アクリルアミドの割合は、その使用目的とリポタンパク質のサイズによって異なります。ここでは、 e. フェカリスリポタンパク質分離された 10% 以上トリス-グリシン ゲル大腸菌小さい Lpp17リポタンパク質の 16.5% トリス トリシン ゲルが使用されていた。
  2. 標準的な電気的ブロッティング法プロシージャを使用してニトロセルロース転送膜にリポ蛋白を転送します。
    注: Bjerrum シェーファー ニールセン バッファー プラス 0.1 %sds を使用して半乾燥の転送は、25 V、1.3 で行われた 15 分18mA。また、ブロッティング (PVDF) される可能性があります、しかし、それは後の手順で膜から疎水性 lipopeptides の効率的な溶出を減らすことがニトロセルロースより疎水性よりは。
  3. 硝酸セルロースの膜を Ponceau S 溶液 (0.2% (w/v) Ponceau S 5% 酢酸) でカバーしてコンテナーに転送します。ロック 5 分間優しくまたは赤ピンクのバンドが表示されるまで。
  4. Ponceau S 溶液を捨て、dH2過剰な削除する O 染色と硝酸セルロースの膜を慎重にすすいでください。
    注: Ponceau ステンド帯域が急速にすすぐ。バンドが表示されなくなった場合は、染色の手順を繰り返します。
  5. きれいなかみそりの刃を持つバンドと微量遠心チューブへの転送を切除します。DH2O にバンドを完全にすすぐの 1 mL で 3 回洗浄します。
    注: プロトコルはここで一時停止することができます。使用するまで-20 ° C で水で覆われて切除のセクションを格納します。
  6. きれいなかみそりの刃ときれいな表面にセクションを転送、0.5 mL 低蛋白結合遠心チューブに個小片のおよそ 1 mm x 1 mm. 収集にニトロセルロース ストリップをサイコロします。
  7. 出来立ての 50 mM 重炭酸アンモニウム (NH4HCO3)、0.5 mL で 2 回部分を洗浄し高速液体クロマトグラフィー (HPLC) グレード水で pH 7.8。

4. トリプシン消化、硝酸セルロースの膜、MALDI ターゲット、およびデータ集録の沈着からリポペプチド抽出

  1. 50 mM NH4HCO3、pH 7.8 HPLC グレードの水でトリプシンの 20 μ g/mL の溶液の 20 μ l 硝酸セルロースの部分を再懸濁します。ミックスする渦は、すべての作品が、トリプシン溶液によって完全に覆われていることを確保するため簡単にスピンします。蒸発を防ぐために、ダイジェスト 37 ° C で一晩インキュベート パラフィン フィルムを使用してチューブの蓋をカバーします。
  2. スピン 30 s や削除ピペッティングによる液体のための 16,000 x g でサンプル。
    注: これはトリプシンの親水性ペプチド MALDI-TOF 質量分析法によるタンパク質の同定を後で調べることが削除されます。
  3. HPLC グレードの水に 0.5% トリフルオロ酢酸 (TFA) の 50 μ L を追加します。渦の回転のすべての部分は、ソリューションによって覆われていることを確認する簡単にサンプルを。室温で 10 分間インキュベートします。ピペッティングで液体を削除します。
    注意:TFA は吸入すると有害です。注意して処理し、化学の発煙のフードを使用します。皮膚との接触を避けてください。
  4. 手順 4.3 10% アセトニ トリル HPLC グレードの水の 50 μ L を繰り返します。
    注意:アセトニ トリルは吸入すると有害です。注意して処理し、化学の発煙のフードを使用します。皮膚との接触を避けてください。
  5. 手順 4.3 20% アセトニ トリル HPLC グレードの水の 50 μ L を繰り返します。
    注: これは緩く、ニトロセルロースにバインドされている任意の緩やかな疎水性ペプチドを削除します。
  6. 溶出が緊密にバインドされた lipopeptides をクロロホルム-メタノール (2:1、v/v) に溶解したて 10 mg/mL α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸 (CHCA) マトリックスの 15 μ L を追加し、断続的なボルテックスを室温で 10 分間インキュベートします。
    1. または、追加 15 μ L クロロホルム-メタノール溶出が lipopeptides と後で行列と混ぜます。2, 5-ジヒドロキシ安息香酸 (DHB) など、他の行列は、不満足な結果が特定のリポペプチド コンポジションの場合 CHCA に代わるものとしてテスト必要があります。
      注意:クロロホルム、メタノール、吸入すると有害。注意して処理し、化学の発煙のフードを使用します。皮膚との接触を避けてください。
    2. オプション:ナトリウムを促進する付加体を形成、1 mM の最終的な集中に炭酸水素ナトリウム水溶液 (NaHCO3) とクロロホルム - メタノール CHCA のソリューションを補完します。
  7. サンプルを簡単にスピンします。ピペット、新しい低蛋白結合遠心チューブに液体を慎重に転送します。このソリューションは、N 末端 lipopeptides の大部分を含まれます。
    注: 硝酸セルロース部分的または完全に分解するかもしれないことクロロホルム-メタノール溶液中。これは MS の結果、マイナス影響を及ぼさない、リポペプチド リターンを高めるに代替手段として使用することがあります。PVDF 膜は同じように分解しません。
  8. 洗練された鋼 MALDI ターゲットに CHCA で溶出した lipopeptides の 1 μ L を入金します。
    注: クロロホルム-メタノールは迅速に、結晶の CHCA と lipopeptides を残して蒸発されます。オプション 2 番目 1 μ L 分注は、サンプル濃度を増加する同じ場所上に堆積することができます。クロロホルム-メタノールはターゲットに沈着後大幅に広がる可能性があり、よう、注意が必要サンプルがターゲットの混合を避けるために。預金、各サンプルの複数のスポットを撮影することをお勧めします。
  9. すぐに質量分析に進みます。特に場合は、スポットは、2 番目の層は、スポットの外側の縁に、lipopeptides をプッシュ可能性がありますサンプルでは、2 つの層は、リポペプチド信号のためのスポットのすべての領域をスキャンします。
    注: 推奨される開始レーザー強度が 25%、信号を集録し、十分な信号対雑音比を達成するために複数のスペクトル (20 以上スキャン) の合計強度を高める必要があります。ここでは、スペクトルは MALDI-TOF TOF の計測器で得られた (材料の表を参照してください) リフレクター陽イオン検出 700-3500 m/z範囲にわたって工場構成楽器法を用いたします。ウシ血清アルブミン (BSA) のトリプシン ペプチド混合物と計測器が校正されました。

結果

プロトコルの概略は、図 1で提供しています。テキサス州 114 によって腸球菌ATCC 19433 から抽出されたリポ蛋白濃縮率は図 2に示します。比較、また沈殿の蛋白分画の帯状の模様が表示されます。この画分からの蛋白質は非常に豊富なリポタンパク質 (表 1) 以外のタンパク質を汚染する MALDI MS によって確?...

ディスカッション

本プロトコルは、リポタンパク質特性の 2 つの明瞭な段階を記述: テキサス州 114 によって濃縮相 MALDI-TOF 質量分析法による分割と構造決定。テキサス州 114 抽出中に追加の遠心分離は高濃縮のリポタンパク質を生成するアセトンの沈殿物に続いて、このプロセス中に沈殿汚染タンパク質を削除します。各セル 15 mL 分の準備の規模を制限すると、いくつかのサンプルすることができます簡単に?...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

メレディス ・ ラボでの研究は、エバリー科学大学 (ペンシルベニア州立大学) によって提供されるスタートアップ資金によって支えられました。専門的技術的な助言とペンシルベニア州プロテオミクスと質量分析法による中核施設、大学公園、PA の質量分析法による分析を行った機器へのアクセス、博士タチアナ Laremore に感謝します

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Materials
0.01 mm Zirconia/silica beadsBioSpec Products110791012
Acetic acidEMDAX0073-9
AcetoneEMDAX0116-6
AcetonitrileEMDAX0142-6
Ammonium bicarbonateFluka Analytical09830
BioTrace NT NitrocellulosePALL Life Sciences66485
Bovine serum albumin (BSA) digest standardProteaPS-204-1
ChloroformAcros Organics423550025
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Fisher ScientificBP118
HPLC Grade waterEMDWX0008-1
LysozymeFisher ScientificBP535-1
MethanolSigma-Aldrich34860
Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF)Amresco0754
Pierce trypsin proteaseThermo Scientific90057
Ponceau SAcros Organics161470100
Protein LoBind Tube 0.5mLEppendorf022431064
Sodium bicarbonateSigma-Aldrich792519
Sodium chlorideMacron Fine Chemicals7581-06
Trifluoroacetic acid (TFA)Sigma-Aldrich299537
Tris-hydrochloride (HCl)Fisher ScientificBP152
Triton X-114Sigma-Aldrich93422
Tryptic soy broth (TSB)BD211822
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade)Sigma-AldrichC8982
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
MagNALyserRoche
Trans-Blot Turbo Transfer SystemBio-Rad
MALDI-TOF targetBruker Daltonics
Ultraflextreme MALDI-TOF-TOFBruker DaltonicsEquipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser

参考文献

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135 Triton X 114 Toll MALDI TOF N

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