Micro-dissezione dell'organo dello smalto da incisivo dei ratti esposti a tossici ambientali

Riepilogo

Comprensione dello smalto formazione e possibili alterazioni richiede lo studio di ameloblast attività. Qui, descriviamo un metodo affidabile e coerenza per micro-dissezionare organi di smalto contenente Adamantoblasti fase di secrezione e di maturazione che possono essere utilizzato per ulteriori quantitative e qualitative procedure sperimentali.

Abstract

Difetti dello smalto derivanti da condizioni ambientali e modi di vita sono le preoccupazioni di salute pubblica a causa della loro alta prevalenza. Questi difetti derivano da attività alterata delle cellule responsabili della sintesi di smalto denominato ameloblasts, che presentano in organo dello smalto. Durante l'Amelogenesi, ameloblasts seguire una sequenza specifica e precisa di eventi di proliferazione, differenziazione e morte. Un ratto incisivi in continua crescita è un adatto modello sperimentale per studiare ameloblast fasi di attività e differenziamento in condizioni fisiologiche e patologiche. Qui, descriviamo un metodo affidabile e coerenza per micro-sezionare organo dello smalto dei ratti esposti a tossici ambientali. Gli epiteli dentali micro-dissecato contengono Adamantoblasti fase di secrezione e di maturazione che possono essere utilizzati per esperimenti qualitativi, quali le analisi immunohistochemistry e ibridazione in situ , così come per analisi quantitative come RT-qPCR, RNA-seq e Western blotting.

Introduzione

Molti i difetti inerenti allo sviluppo dello smalto possono derivare dall'esposizione a tossici ambientali e/o stile di vita inadeguato^1,2,3,4. Caratterizzazione di interrompere gli eventi e le molecole di amelogenesis utilizzando la procedura descritta attualmente promuoverà l'uso dei difetti dello smalto risultante come marker precoce di esposizione alle sostanze tossiche diverse e può aiutare a ricostituire la storia di salute della ogni paziente durante il periodo perinatale quando lo smalto è sintetizzato^1,2. Sintesi dello smalto possono essere diviso in quattro fasi principali a seconda ameloblast attività⁵. Il primo passo raggruppa la proliferazione dei precursori delle cellule e pre-ameloblast. Durante il secondo passaggio, ameloblasts differenziato secernere proteine di matrice dello smalto (EMPs), principalmente amelogenina, enamelina e ameloblastin, che determinano lo spessore dello smalto finale. Così, qualsiasi interruzione della sintesi di EMP conduce ai difetti quantitativi dello smalto. Dopo la deposizione dello spessore dello smalto completo, inizia la fase di maturazione. Durante questa fase, crescita di cristalliti di apatite in larghezza e spessore permette lo smalto raggiungere il più alto rapporto di mineralizzazione, trovato in un tessuto biologico, fino al 96% in peso. Eventi endocrini che si verificano durante il lead di fase di maturazione a qualitativa dello smalto i difetti. Infine, ameloblasts entra in una fase di post-maturazione, anche chiamato pigmentazione nei roditori e apoptosi durante l'eruzione del dente rendendo i difetti dello smalto (se qualsiasi) irreparabile e irreversibile, quindi difetti forniscono potenziale registrazione retrospettiva di ameloblast sottolinea. Nei roditori, Amelogenesi segue una sequenza di eventi con la particolarità che loro incisivi crescono continuamente, che li rende un modello adatto per studiare il processo generale di amelogenesis simile. Così, qualsiasi interruzione di Amelogenesi provoca alterazioni della qualità dello smalto e/o quantità, a seconda l'intervallo di tempo dell'evento endocrini. In questo senso, l'esposizione alla diossina, piombo e sostanze chimiche endocrina (EDCs) come il bisfenolo A (BPA), genisteina e vinclozolin, hanno dimostrato di generare smalto hypomineralizations^{1,2,3 ,6,7,8}. Asimmetriche macchie opache bianche sono stati identificati sugli incisivi dei ratti esposti a una dose BPA della basso-dose durante il periodo fetale e il primo mese dopo la nascita¹. Questi difetti dello smalto in ratti ed in quelli di incisivo molare umano hypomineralization (MIH), condividono caratteristiche cliniche, strutturali e biochimiche simili. MIH è una patologia dello smalto dentale recentemente descritto, per cui l'eziologia rimane ancora poco chiara^9,10 , nonostante molti fattori causali essendo stato supposto^{9,10,11 ,12}.

Un altro importante smalto hypomineralization patologia a causa di fattori ambientali è fluorosi dentale (DF), che è la conseguenza di assorbimento eccessivo di fluoro (> 0,1 mg/kg/giorno)^13,14. La principale fonte di fluoro è l'acqua potabile che viene completato o naturalmente arricchita con fluoro. Fluoruro è anche spesso prescritto per prevenire la carie dentale, ma la dose profilattica è solo il 50% inferiore rispetto il tossico uno (≤ 0.05 mg/kg/giorno). MIH e DF, due frequenti patologie derivanti dall'esposizione a fattori ambientali, possono presentare caratteristiche comuni che devono essere caratterizzato a causa il potenziamento degli effetti hypomineralizing di fluoro combinato con altre sostanze tossiche come interferenti endocrini² o amoxicillin¹⁵.

Micro-dissezione dell'organo dello smalto del ratto contenenti Adamantoblasti a stadi diversi di differenziazione aiuterà a comprendere il meccanismo d'azione di molecole capaci di interferire con attività ameloblast e causare i difetti dello smalto essere diagnosticata dopo l'eruzione dei denti. In altre parole, la caratterizzazione dei cambiamenti di composizione di matrice smalto gene espressione e smalto a causa di tossici ambientali permette la ricostituzione della storia di esposizione a sostanze tossiche e facilita il controllo di sicurezza ambientale per pubblico salute.

Protocollo

Tutti gli animali utilizzati nel presente studio sono stati effettuati conformemente agli orientamenti per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del Ministero francese dell'agricoltura (A-75-06-12).

1. animale esposizione alle sostanze tossiche

1. Prima di eseguire questo protocollo, ottenere la necessaria approvazione istituzionale ed essere sicuri di rispettare tutte le linee guida di cura degli animali.
2. Applicare la struttura del protocollo ricerca permettendo la costituzione di diversi gruppi sperimentali al fine di verificare l'impatto della molecola studiata su ameloblast secrezione fase e la fase di maturazione ameloblast. Qui, quattro gruppi di ratti maschii di Wistar sono stati costituiti a seconda della loro esposizione al fluoruro (NaF) in combinazione o non con BPA (Figura 1A)². Tutti gli animali sono stati osservati e sezionati il giorno 65 (Figura 1B).

2. dissezione di Hemi-mandibole dai ratti adulti

1. Eutanasia ratti da CO₂ asfissia, facoltativamente seguita dalla decapitazione alla testa separata dal resto del corpo. Esporre i ratti di CO₂ per 5 min in un box dedicato¹⁶.
2. Rimuovere tutta la pelle dalle labbra inferiori usando un bisturi #11 al fine di ottenere un facile accesso agli incisivi inferiori.
3. Con il bisturi stesso, fare un'incisione tra i due incisivi inferiori con una leggera pressione e la mandibola sarà diviso in due metà.
4. Tagliare l'articolazione mandibolare temporale con un bisturi per staccare la mascella e tenere hemi-mandibola con pinzette bene.
5. Tagliare i tessuti molli circostanti con un bisturi e rimuovere tutti i muscoli, tendini e legamenti con una spatola fino a quando l'osso è completamente pulito.

3. isolamento del incisivo^17,18

1. Radersi con attenzione l'osso inserendo la lama parallela all'asse longitudinale principali dell'incisivo. Partono dalla cresta ossuta vicino alle punte dell'incisivo (estremità prossimale) fino alla fine dell'incisivo Ansa cervicale. Il movimento di incisione procede da prossimale a distale direzione.
2. Effettuare un primo taglio distalmente al ciclo cervicale con il bisturi per rimuovere il gonion di hemi-mandibola e permettere che toglie l'incisivo facilmente senza danneggiare il ciclo cervicale o la fase secretiva del Adamantoblasti (linea rossa in Figura 2).
3. Fare un secondo taglio sotto il secondo molare e inserire il bisturi tra l'osso e la superficie mediale dell'incisivo. Quando tutto l'osso basale è sollevato, ruotare verso l'esterno l'incisivo e toglierlo con attenzione per evitare smalto tessuto dell'organo compromettere con pinzette bene.

4. micro-dissezione dell'organo dello smalto sotto lente binoculare

1. Goccia 200 µ l di tampone fosfato salino (PBS 1X) sull'incisivo utilizzando una pipetta. Prendere l'incisivo con pinzette bene con la superficie labiale rivolto verso l'alto. Fare un bisturi segno tra l'incolore e le parti arancione del tessuto. Questo contrassegno corrisponde per la macchia bianca sottostante che è osservabile in seguito (Figura 2).
2. Raschiare, con un escavatore o strumento equivalente, la superficie delle cellule dal marchio bisturi alla estremità apicale corrispondente da secrezione Adamantoblasti di fase (incolore) e il marchio di bisturi alla punta dell'incisivo per l'Adamantoblasti di fase (arancione) di maturazione.
3. Rimuovere il tessuto di 2 mm corrispondono alla fase di transizione, come precedentemente descritto¹⁹. Non aprire l'incisivo durante la dissezione dell'organo dello smalto per evitare la contaminazione del mesenchima.
4. Tagliare il ciclo cervicale situato immediatamente nella parte apicale dell'incisivo (Figura 2) come descritto in precedenza²⁰.
5. Raccoglierlo in soluzione al 10% formalina o lisi per ulteriori indagini (Vedi Tabella materiali).

5. raccolta dei tessuti dell'organo dello smalto separati per ulteriori indagini

1. Goccia 200 µ l di tampone PBS 1 X sull'incisivo.
2. Con una lama per bisturi #11, attentamente staccare le cellule epiteliali dentale gradualmente nel buffer, separatamente per ogni fase con l'aiuto del marchio bisturi fatto in precedenza.
3. Per cella RNA e proteina estrazioni, mettere il tessuto in una soluzione di lisi che permette l'estrazione di proteine e di RNA (Vedi Tabella materiali).
   Nota: Preparare alta qualità RNAs girando il tessuto-escavatore nel tubo e poi rettifica le cellule fino ad ottenere un impasto omogeneo. L'impasto è pronto per l'estrazione di RNA e proteine secondo la procedura del produttore, che era precedentemente descritti^2,8,17. Di solito, circa 5-10 µ g totale RNAs e 150 µ g proteine totali sono stati ottenuti per ogni preparazione.
4. Per le analisi istologiche, immunohistochemistry (IHC) e l'ibridazione in situ (ISH), mettere lo strato delle cellule in formalina al 10% per 2 h, quindi conservare a 4 ° C in PBS 1X. Il tessuto può quindi essere incorporato in cera di paraffina o tessuto OCT per sezioni congelate.
5. Per le estrazioni di EMP, prendere l'incisivo con pinzette bene. Dopo una breve esposizione all'aria (lieve disidratazione), una macchia bianca sarà visibile intorno alla parte centrale della superficie labial dell'incisivo, che rappresenta l'inizio della mineralizzazione dello smalto. Questa macchia bianca corrisponde alla transizione- / presto-fase di maturazione di ameloblasts, così utilizzarlo come un indicatore per l'estrazione di EMPs²¹.

Risultati

Molti smalto difetti, come fluorosi dentale^12,13, possono derivare da condizioni ambientali a causa dell'assorbimento di fluoro eccessivo o smalto hypomineralization simili a MIH dovuto l'esposizione a qualche EDCs^{1, 7,22}. Questi difetti inerenti allo sviluppo dello smalto possono essere riprodotta sperimentalmente su ratti (

Discussione

Ameloblast alterata attività e/o interrotte ameloblast proliferazione, differenziazione e maturazione processi piombo per i difetti dello smalto irreversibile e, a sua volta, la caratterizzazione dei difetti dello smalto può aiutare a sviluppare la comprensione dell'alterata ameloblast attività durante amelogenesis. Così, gli studi su organo dello smalto isolato sono determinante per delucidare gli eventi patologici che conducono allo smalto difetti qualunque loro origine, ambientali o genetici.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bisphenol A	Sigma Aldrich, Saint Louis MO	239658
formalin 10%	Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO	HT5012
Tri-Reagent	Euromedex, France	TR118
RLT buffer	Qiagen, Les Ulis, France	74126	RNeasy Protect Mini Kit
Androgen receptor antibody	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)	sc-816	rabbit polyclonal antibody
PBS 10x	EUOMEDEX	ET330.A
Sodium fluoride (NaF)	Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO	S-1504
paraplast regular	Leica microsystems, Nanterre cedex, France	39601006	called was/parafin in the text
tissue OCT	VWR, Fontenay-sous-Bois, France	411243
Extra Fine Bonn Scissors - Straight/8.5 cm	PHYMEP , Paris, France	14084-08
Handle for Scalpel Blades - 12.5 cm	PHYMEP, Paris, France	10035-12
Curved Scalpel Blade	PHYMEP , Paris, France	10035-20
Dissecting Knife - Fine/Straight Tip	PHYMEP , Paris, France	10055-12
Circle Knife	PHYMEP, Paris, France	10059-15
scalpel blades n°11 Swann-Morton	VWR, Fontenay-sous-Bois, France	233-0024
binocular lens	Leica biosystems, Nanterre cedex, France	MZFLIII