Colture organotipiche tridimensionale degli organi sensoriali uditivi e vestibolari

Riepilogo

Colture organotipiche tridimensionale dell'utricolo murino e coclea in otticamente deselezionare collagene gel morfologia del tessuto innata di riserva, consentono per stimolazione meccanica attraverso la regolazione della rigidità di matrice e consentono il recapito della virus-mediata del gene.

Abstract

Gli organi sensoriali dell'orecchio interno sono difficili da studiare nei mammiferi a causa della loro inaccessibilità di manipolazione sperimentale e osservazione ottica. Inoltre, anche se le tecniche di cultura esistenti consentano perturbazioni biochimiche, questi metodi non forniscono un mezzo per studiare gli effetti della forza meccanica e rigidità dei tessuti durante lo sviluppo degli organi sensoriali dell'orecchio interno. Qui descriviamo un metodo per coltura organotypic tridimensionale dell'utricolo murino intatto e coclea che supera queste limitazioni. La tecnica per la regolazione di una rigidità di matrice tridimensionale qui descritto consente la manipolazione della forza elastica opposte la crescita del tessuto. Pertanto, questo metodo può essere utilizzato per studiare il ruolo delle forze meccaniche durante lo sviluppo dell'orecchio interno. Inoltre, le culture consentono il recapito della virus-mediata del gene, che può essere utilizzato per esperimenti di guadagno e perdita di funzione. Questo metodo di cultura conserva le cellule ciliate innate e sostenere le cellule e serve come alternativa potenzialmente superiore alla tradizionale cultura bidimensionale degli organi sensoriali uditivi e vestibolari.

Introduzione

Lo studio della maggior parte degli aspetti dello sviluppo dei mammiferi dell'organo è stato facilitato dai sistemi in vitro . Due metodi principali sono ora utilizzati per la coltura di organi sensoriali vestibolari: digalleggiante¹ e aderente² preparazioni. Entrambi i metodi consentono l'indagine della cellula ciliata vulnerabilità³ e rigenerazione^1,4 in vitro. Inoltre, hanno i ruoli inerenti allo sviluppo della tacca^5,6, Wnt^7,8e fattore di crescita epidermico del recettore (EGFR)^9,10 segnalazione cascades nell'orecchio interno stata stabilita, in parte, attraverso l'uso di colture in vitro di epiteli sensoriali. Tuttavia, la differenziazione e la crescita delle cellule sono controllati, non solo attraverso la segnalazione di morfogeni, ma anche attraverso segnali fisici e meccanici, ad esempio Contatti intercellulari, la rigidità della matrice extracellulare e stretching meccanico o costrizione. Il ruolo di tali stimoli meccanici è difficile da indagare nel orecchio interno in via di sviluppo in vivo. Inoltre, metodi esistenti di cultura digalleggiante ed aderente non sono adatti per questo tipo di studi in vitro. Qui descriviamo un metodo per coltura organotypic tridimensionale in collagene gel di rigidità variabile. Questo metodo in gran parte conserva l'architettura in vivo degli organi sensoriali cocleari e vestibolari e consente l'indagine sugli effetti della forza meccanica su crescita e differenziazione¹¹.

Perché stimoli meccanici sono conosciuti per attivare eventi molecolari a valle, come l'ippopotamo signaling pathway^12,13,14,15, è importante essere in grado di coniugare lo stimolo meccanico con manipolazioni genetiche e biochimiche. Il metodo di cultura qui descritto consente la consegna virus-mediata del gene e pertanto può essere utilizzato per studiare sia meccaniche che molecolare segnalazione durante lo sviluppo di orecchio interno¹¹.

Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dalla cura degli animali e uso comitati della Rockefeller University e della University of Southern California.

1. (opzionale) preparazione di collagene soluzione da tendini di vista

Nota: Collagene sono soluzioni sono disponibili in commercio. Seguire le istruzioni del produttore per la preparazione del gel.

1. Eutanasia: 5-10 topi di giovane adulto (3-5 settimane) di qualsiasi ceppo di tipo selvaggio con anidride carbonica in conformità del protocollo approvato dai pertinenti istituzionale Animal Care e uso Comitato¹⁶. Raccogliere le code e disinfettarle immergendo in etanolo al 70% per un minimo di 4 ore a temperatura ambiente.
   Nota: Incubazione per oltre 48 h dovrebbe essere evitato, in quanto provoca disidratazione del tessuto in eccesso e ostacola il processo di estrazione del tendine.
2. Togliere la pelle da ogni coda introducendo un taglio longitudinale con un bisturi e ritraendo tutta la pelle con il forcipe. Trasferire le code dalla pelle in una capsula Petri 100 mm riempito con etanolo al 70% pulito e tagliarli in segmenti di 10 mm.
   Nota: Gettare le parti più sottili delle code, che sono difficili da manipolare.
3. Usando il forcipe, fissare ogni segmento della coda fino in fondo la capsula di Petri e utilizzare un secondo paio di una pinzetta per estrarre i tendini dalla coda uno alla volta. Fibre tendinee individuali dovrebbero emergere con una resistenza minima.
   Nota: Vecchio, noioso forcipe #5 funzionano bene per questo passaggio.
4. Preparare 100 mL di soluzione di acido acetico in acqua sterile di grado molecolare 0,1% (in volume) e aggiungere 10 mL della soluzione a una capsula di Petri sterile 100 mm. Trasferire i tendini per la capsula di Petri e lasciare per 1 h a temperatura ambiente per denaturare il collagene I.
5. Utilizzare un paio di forbici bisturi o iridectomy sterile con punte smussate, curve per tritare il tendine in frammenti di 1-2 mm. Trasferire i tendini macinati in una provetta sterile da 50 mL e aggiungere acido acetico 0,1% per portare il volume a 50 mL.
   Nota: Utilizzare quattro o cinque con code per ogni 50 mL di acido di raggiungere un collagene concentrazione di 2.0-2.5 mg/mL.
6. Refrigerare il collagene soluzione a 4 ° C per un minimo di 48 h per facilitare la denaturazione di proteine complete. Vortice Vortex da tavolo impostato alla massima velocità per 1 minuto due volte al giorno.
7. Misurare la concentrazione di proteina della soluzione usando il dosaggio di acido bicinconinico, regolare il collagene ho concentrazione a 2.0-2.5 mg/mL aggiungendo 0,1% soluzione di acido acetico e archivio a 4 ° C.
   Nota: Collagene soluzione può essere conservata per uno o due anni.
8. (Opzionale) Centrifugare il collagene soluzione a 2.000 x g per 1 h a 4 ° C e uso la frazione superiore traslucida (circa la metà del volume), per raggiungere otticamente chiaro collagene gel nella sezione 4.

2. dissezione degli organi vestibolari e uditivi

1. Eutanasia topi incinti di qualsiasi ceppo con anidride carbonica in conformità del protocollo approvato dai pertinenti istituzionale Animal Care e uso Comitato¹⁶. Estrarre e decapitare gli embrioni.
   Nota: LFNG-CreER^T2/tdTomato topi possono essere utilizzati per consentire l'etichettatura permanente di sostegno le cellule su esposizione a 4-hydroxytamoxifen¹⁷.
2. Sterilizzare tutte le superfici di lavoro e strumenti per la dissezione, tra cui due paia di pinze #5 e un coltello di capelli¹⁸, di pulirli con etanolo al 70%.
3. Dividere ogni testa in due metà con l'introduzione di un taglio longitudinale con un bisturi sterile o utilizzando due paia di pinze #5. Estrarre le ossa temporali, che contengono le orecchie interne¹⁹e inserirli in 15 mL di soluzione salina bilanciata di Hank ghiacciata (HBSS) in una capsula di Petri 60mm. Tenere il piatto sul ghiaccio.
   Nota: Embrioni in una gamma di livelli da E13.5 a E18.5 sono stati utilizzati con successo.
4. (Opzionale) Lavare le orecchie interne agitando delicatamente in una provetta conica da 50 mL contenente 30 mL HBSS ghiacciata e sostituendo l'HBSS tre o quattro volte. Tenere il tubo sul ghiaccio.
   Nota: Questo passaggio limita la possibile contaminazione della coltura del tessuto e porta rapidamente la temperatura a 4 ° C, che impedisce la morte delle cellule e di degradazione del tessuto.
5. Utilizzando due coppie di una pinzetta #5, separare le orecchie interne dall'osso temporale e trasferire le orecchie, tre o quattro alla volta, in una capsula di Petri 60 mm riempito con HBSS ghiacciata.
6. Sezionare gli organi sensoriali vestibolari.
   1. Orientare il lato mediale di orecchie fino e individuare il utricle. Con due paia di pinze #5, rimuovere la cartilagine che circonda gli organi vestibolari. Delicatamente recidere il nervo vestibolare, la connessione tra l'utricolo e sacculo, canali semicircolari, come mostrato nella Figura 1. Tirare delicatamente il utricle e l'annesso Ampolle dei canali semicircolari superiori e orizzontali dall'orecchio.
      Nota: Questo metodo può essere utilizzato su orecchie interne delle fasi E16.5 - E18.5. Conservare i frammenti di cartilagine per sezione 3 riportata di seguito.
7. Sezionare la coclea.
   1. Rimuovere il tessuto cartilaginoso che circonda l'organo dell'udito con due paia di pinze #5. Come mostrato nella Figura 1, delicatamente di interrompere la connessione tra la base coclea e il saccule.
      Nota: Per fasi E13.5 - e 14.5, ammorbidiscono la cartilagine prima della dissezione trattando l'interno orecchie con 0,25% collagenosi in soluzione tampone fosfato salino (PBS) per 5 min a temperatura ambiente. Conservare i frammenti di cartilagine per sezione 3 riportata di seguito.
8. Utilizzando una pipetta da 200-µ l munito di una punta larga antiaderente, trasferire la utricles e coclee ad una capsula di Petri 30 mm riempito con terreno di coltura costituito da DMEM/F12 completati con 33 mM DGlucosio, bicarbonato di sodio di 19 mM, 15 mM 4(2hydroxyethyl)- 1piperazineethanesulfonic acido (HEPES), glutamina di 1 mM, 1mm nicotinammide, 20 mg/L fattore di crescita epidermico, fattore di crescita dei fibroblasti di 20 mg/L, 10 mg/L insulina, transferrina 5,5 mg/L e selenito di sodio 5 µ g/L.
9. Mantenere i preparativi utricolo per fino a 3 h a 37 ° C in un incubatore di coltura del tessuto gassificato con 5% di anidride carbonica per permettere la guarigione dei tagli nell'epitelio introdotto durante la dissezione. Preparazioni di coclea devono essere trasferiti direttamente sul gel di collagene 10 min dopo la dissezione.
   Nota: Poiché la dissezione viene eseguita in HBSS ghiacciata, non c'è nessuna necessità di pre-riscaldare il mezzo di crescita a 37 ° C.

3. (facoltativo) regolare collagene mi Gel rigidità con l'aggiunta di concentrazioni variabili di condrociti

Nota: Il metodo per l'isolamento dei condrociti è stato modificato da Gosset et al. ²⁰

1. Preparare una soluzione di 1% di collagenasi I a sterile 1X PBS e archivio aliquote di 100-200 µ l a-80 ° C. Scongelare il ghiaccio quando necessario, evitando più cicli di gelo-disgelo.
2. Utilizzare una pinzetta per raccogliere i pezzi di cartilagine lasciati dalla dissezione dell'apparato uditivo e vestibolare dalle orecchie di 10-12. Tessuti connettivi e orecchio interno separati dalla cartilagine. Trasferire la cartilagine a una capsula di Petri 30mm e aggiungere 300 µ l di terreno di coltura sterile.
3. Usare le forbici di lama o iridectomy un bisturi sterile con punte curve smussate per tritare il tessuto per realizzare pezzi di cartilagine circa 0,5 mm di lunghezza.
4. Aggiungere collagenosi io al medium con cartilagine per ottenere una concentrazione di enzima finale dello 0,25%. Trasferire il piatto in un'incubatrice di tessuto-coltura a 37 ° C, gasati con 5% di anidride carbonica. Pipettare vigorosamente utilizzando una pipetta da 1.000 µ l ogni 20 min fino a pezzi di cartilagine dissociano e non sono più distinguibili nella soluzione, quindi incubare per altri 20 minuti.
   Nota: In caso di preparazioni il utricle, condrociti isolamento può essere eseguita durante passaggio 2,9; si impiegano circa 2 ore (3-4 giri di pipettaggio).
5. Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL e regolare il volume a 10 mL con PBS 1X sterile. Centrifuga a 800 x g per 5 min a 4 ° C. Rimuovere il supernatante e risospendere le cellule in 10 mL di PBS 1X sterile. Centrifugare a 800 x g per 5 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante.
   Nota: È fondamentale per lavare le cellule due volte; qualsiasi collagenosi rimanente saranno a digerire il collagene che mi gel.
6. Utilizzando una pipetta da 200-µ l, aggiungere 100 µ l di terreno di coltura per il pellet cellulare e pipettare delicatamente per risospendere. Contare le celle utilizzando un emocitometro e mantenerli il priore di ghiaccio da utilizzare.
7. Per aumentare la rigidità del gel, aggiungere condrociti al collagene neutralizzato I gel soluzione (sezione 1) e mescolare velocemente per distribuire le cellule in tutto il gel prima della solidificazione.
   Nota: Il modulo elastico del collagene mi gel (una misura della rigidità), aumenta linearmente con il numero dei chondrocytes aggiunto¹¹. La relazione è descritta dalla funzione lineare determinata sperimentalmente E = 206· NC + 15, in cui E è il modulo elastico in Pascal e Nc è il numero di condrociti in milioni. Per un protocollo dettagliato per gel misure di rigidezza consultare l'originale articolo¹¹.

4. Posizionare l'organo sensoriale uditiva o vestibolare in un collagene che mi Gel

1. In una provetta sterile di 1,5 mL, preparare collagene sono soluzione di polimerizzazione mescolando 160 µ l di PBS 1x 10 con indicatore di pH rosso fenolo, 133 µ l di idrossido di sodio M 0,34, 70 µ l di bicarbonato di sodio 0,9 M e 40 µ l di 1 M HEPES. Tenere il tubo sul ghiaccio.
   Nota: Questa ricetta fornisce la soluzione di polimerizzazione dovuta preparare 2 mL di collagene gel, ma possono essere scalato in base alle esigenze.
2. Mix 100 µ l di soluzione di polimerizzazione e 400 µ l di collagene soluzione su ghiaccio pipettando delicatamente su e giù in una provetta da 1,5 mL refrigerata. Per aumentare la rigidità del gel, aggiungere 50 µ l di terreno di coltura contenente condrociti e mescolare delicatamente, come descritto nella sezione 3.
3. Trasferire 500 µ l del collagene neutralizzato ho soluzione in una capsula di Petri 30mm refrigerati con un inserto di 10 mm con fondo di vetro o in un pozzetto di una piastra a 4 pozzetti.
   Nota: È fondamentale per conservare tutti i reagenti sul ghiaccio per evitare la polimerizzazione rapida e irregolare del collagene I.
4. Trasferire rapidamente le coclee o utricles al collagene neutralizzato ho soluzione e regolare gli organi alle loro posizioni desiderati con una coppia di una pinzetta o sterile capelli coltello¹⁸ .
   Nota: Collagene polimerizzazione diventa evidente dopo 1-2 min come la soluzione diventa torbida.
5. Dopo la soluzione intorno al tessuto ha polimerizzato, inserire la capsula di Petri o quattro pozzetti per 20 min a 37 ° C in un incubatore di coltura del tessuto gassificato con 5% di anidride carbonica per garantire la completa polimerizzazione.
6. Aggiungere 3 mL di medium di crescita supplementato con 0.5% siero bovino fetale (FBS) per ogni scatola di Petri o 500 µ l dello stesso mezzo per pozzetto di una piastra a 4 pozzetti. Mantenere la coltura a 37 ° C in un incubatore di coltura del tessuto gassificato con 5% di anidride carbonica. Se lo si desidera, è possibile integrare il medium di crescita con 10 µM 5-Etinil-2-deoxyuridine (EdU) per marcare le cellule proliferanti.
   Nota: Più alte concentrazioni di FBS possono essere utilizzate se lo si desidera.

5. virale iniezioni nelle culture tridimensionale degli organi sensoriali uditivi e vestibolari

1. Sbrinare il virus desiderato sul ghiaccio e mescolare con soluzione di trypan blu in una provetta conica da 0,5 mL per ottenere una concentrazione di tintura finale dello 0,05%. Utilizzare tintura x 10-20 per evitare sostanziale diluizione del virus. Tenere il ghiaccio.
   Nota: L'adenovirus sierotipo 5 opere migliori per infettare cellule di supporto nell'utricolo¹⁹, considerando che virus adeno-associato Anc80 può infettare sia cellule ciliate e cellule di supporto il utricle e la coclea²¹.
2. Rompere la punta di un ago di vetro preparato su un estrattore micropipetta con forcipe fine pulito mentre osservando al massimo ingrandimento di un microscopio per dissezione di binocolo.
   Nota: È importante ottimizzare le impostazioni sulla levetta di regolazione dell'ago. Aghi con 9 - 12mm ancore e 20 - 30 µm aperture funzionano meglio.
3. Rimuovere una cultura di organo sensoriale dall'incubatrice. Inserire l'ago per il microinjector e riempirlo con 2-3 µ l di miscela colorante e virus. Fare avanzare l'ago nell'organo sensoriale, mentre l'osservazione sotto il microscopio per dissezione di binocolo.
4. Guidare delicatamente la punta dell'ago attraverso gli strati epiteliali e mesenchimali del tetto di una cultura utricular tridimensionale. Iniettare la miscela virale fino a riempire la cavità del utricle e ampolle con il colorante blu.
   Nota: Perché permette un facile accesso agli organi sensoriali, una capsula di Petri con fondo di vetro 10 mm è ottimale per le iniezioni.
5. Incubare a 37 ° C in un incubatore di coltura del tessuto gassificato con 5% di anidride carbonica.
   Nota: Quando la proteina fluorescente verde o rossa viene utilizzata il costrutto virale, la fluorescenza è apparente 24 h dopo la trasduzione virale.

Risultati

Organi sensoriali uditivi e vestibolari dalle orecchie embrionale, coltivate in 40-Pa collagene I gel che imita bassa rigidità condizioni embrionali¹¹, mantenere relativamente normali strutture tridimensionali (Figura 1) e mantenere le cellule ciliate e sostenere le cellule (Figura 2 e Figura 3). Anche se sostenere la densità delle cellule diminuisce di oltre il 30% (test

Discussione

I segnali molecolari che mediano crescita e differenziazione dell'orecchio interno durante lo sviluppo sono stati studiati estesamente^5,6,7,8,9,10. Tuttavia, le prove ottenute dal sistema utricular modello suggeriscono che meccanici spunti, percepiti attraverso giunzioni delle cellule e l'attivazione di segnalazione Hippo, an...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
#10 Surgical Blades	Miltex	4-110
#5 Forceps	Dumont	11252-20
100 mm Petri dish	Sigma	P5856-500EA
250 uL large orifice pipette tips	USA Scientific	1011-8406
30 mm glass-bottom Petri dish	Matsunami Glass USA Corporation	D35-14-1.5-U
4 well plate	Thermo Fisher Scientific	176740
4-Hydroxytamoxifen	Sigma	H7904
60 mm Petri dish	Thermo Fisher Scientific	123TS1
Acetic acid	Sigma	537020
Ad-GFP	Vector Biolabs	1060
Anti-GFP, chicken IgY fraction	Invitrogen	A10262
Anti-Myo7A	Proteus Biosciences	25-6790
Anti-Sox2 Antibody (Y-17)	Santa Cruz	sc-17320
Bicinchoninic acid assay	Thermo Fisher Scientific	23225
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit	Thermo Fisher Scientific	C10340
Collagenase I	Gibco	17100017
D-glucose	Sigma	G8270
DMEM/F12	Gibco	11320033
Epidermal growth factor	Sigma	E9644
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	16140063
Fibroblast growth factor	Sigma	F5392
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-97
Glutamine	Sigma	G8540
HBSS	Gibco	14025092
Hemocytometer	Daigger	EF16034F
HEPES	Sigma	H4034
Insulin	Sigma	I3536
Iridectomy scissors	Zepf Medical Instruments	08-1201-10
Microinjector	Narishige	IM-6
Nicotinamide	Sigma	N0636
PBS (10X), pH 7.4	Gibco	70011044
PBS (1X), pH 7.4	Gibco	10010023
Phenol Red pH indicator	Sigma	P4633
Pure Ethanol, 200 Proof	Decon Labs	2716
RFP antibody	ChromoTek	5F8
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium hydroxide	Sigma	S8045
Sodium selenite	Sigma	S5261
Tabletop vortex	VWR	97043-562
Transferrin	Sigma	T8158
Trypan blue	Sigma	T6146