מאתר למעי הגס הדיסטלי, מודל הרומן של הסחה קוליטיס בעכברים C57BL/6

Summary

מאתר למעי הגס דיסטלי מספק מודל מאתר הסחה האנושי קוליטיס, קוליטיס בעיקר לימפוציטית קטע המעי הגס נכללו הנחל צואה.

Abstract

הסחה קוליטיס (DC) הוא מצב קליני תכופים המתרחשים אצל חולים עם קטעי המעי נכללו הנחל צואה כתוצאה enterostomy להסיט. האטיולוגיה של המחלה נשאר מעורפל אבל נראה שונים של מחלות מעי דלקתיות קלאסית כמו קוליטיס ומחלת קרוהן. במחקרי לפענח את המנגנונים הקשורים pathophysiological המובילים להתפתחות של מחלה זו יש כבר את מימושן היעדרה של מודל מאתר המתאים. פרוטוקול זה יוצר מודל מאתר של DC המקל על הלימוד התפקיד של מערכת החיסון ביחסיו עם microbiome בפיתוח של DC. במודל זה באמצעות בעלי חיים C57BL/6, דיסטלי חלקי המעי הגס אינם נכללים הנחל צואה על-ידי יצירת למעי הגס הדיסטלי, מפעילה את התפתחות קל עד בינוני דלקת מקטעי מעי שלא נכללו מתרבה נגעים סימן ההיכר של האדם DC עם תגובה דלקתית מערכתית מתונה. בניגוד לדגם עכברוש, מספר רב של מודלים מאתר מהונדס גנטית על רקע C57BL/6 הינם זמינים. השילוב של בעלי חיים אלה עם המודל שלנו מאפשר את התפקידים פוטנציאלי של ציטוקינים בודדים, נוגדנים או קולטנים של מולקולות ביו (למשל, אינטרלויקין (IL)-17; IL-10, כימוקין CXCL13, כימוקין רצפטורים CXCR5, CCR7 ו sphingosine-1-פוספט הקולטן 4) לפנות לבדיקה בפתוגנזה של DC. הזמינות של זנים העכבר congenic על רקע C57BL/6 במידה רבה מקלה על העברת הניסויים להקים את התפקידים של סוגי תאים נפרדים מעורב האטיולוגיה של DC. בסופו של דבר, המודל מציע את ההזדמנות כדי להעריך את ההשפעות של התערבויות מקומיים (למשל, שינוי של microbiome המקומי או טיפול אנטי דלקתי מקומי) על חסינות הרירית בקטעים המעי הנגוע, שאינן מושפעות ו- הומאוסטזיס המערכת החיסונית מערכתית.

Introduction

בשנים האחרונות, מספר ניכר של קוליטיס שאינן זיהומיות ישויות שונות ממחלות מעי דלקתיות קלאסית (IBDs; כלומר-, או קוליטיס ulcerosa קרוהן) יש כבר קליניות, histopathologically מאופיין אצל בני אדם. המנגנונים הקשורים pathophysiological המובילים להתפתחות של צורות אלה קוליטיס אינם לגמרי מובנים חלקית כי המתאים מודלים בעלי חיים נדירים. קוליטיס הסחה הוא אחד הישויות הללו תיאר לאחרונה. למרות שהמונח הוטבע בשנת 1980 על ידי Glotzer¹, התיאור הראשוני של הפנוטיפ דומה ניתנה בשנת 1972 על-ידי Morson². המחלה מתפתחת ב 50 91% מהחולים עם הטיית enterostomy, בעוצמתה קליני משתנה^3,4. לאור השכיחות שנתי של 120,000 חולי למעי הגס ב ארצות הברית של אמריקה, ישות מחלה זו מהווה בעיה בריאות חשובה.

המטרה הכוללת של פיתוח פרוטוקול זה היה לספק מודל DC מאתר זה מסתמכת על גורם קוליטיס דומה כי ראיתי בוושינגטון האנושית ואת זה מתרבה התכונות histopathological של המחלה האנושית. לעומת דגמים אחרים מאתר קוליטיס, קוליטיס אינדוקציה במודל שלנו אינה דורשת מהונדסים בעלי חיים (למשל, העכברים הטרנסגניים IL-7, N-קדהרין עכברים שלילי דומיננטי או עכברים TGFβ^{- / -} ), היישום של כימית מעצבן חומרים (למשל, לתוספי סולפט נתרן (DSS) - קוליטיס המושרה, או חומצה sulfonic trinitrobenzene (TNBS) - induced קוליטיס) או ההעברה של אוכלוסיות תאים מסוים בעכברים לקוי מערכת החיסון (כמו העברת^גבוהה CD45RB מודל של קוליטיס) (לסקירה, ראה⁵). לעומת דגמים אחרים, המערכת החיסונית שלם של מודל DC שלנו מאפשרת הערכה של מנגנון אימונולוגי מעורב בפיתוח DC. המגבלה של דלקת הרירית את פלח המעי נשלל מאפשר הערכה של השלכה שלה על חסינות הרירית בחלקים אחרים מערכת העיכול, על הומאוסטזיס החיסון בתאים חיסוניים אחרים של מערכת העיכול (למשל , Mesenteriale הלימפה ותיקונים של פייה), וביום של הומאוסטזיס המערכת החיסונית של האורגניזם כולו. בסופו של דבר, המודל שלנו מהווה כלי המתאים עבור חוקרים את מנגנוני שליטה גירויים דלקתיות מקומיים שמקורם שינויים בסביבת המקומי הרגיל הן microbiome המקומי כמו גם אנטיגנים מסולקים.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הרשות וטרינרי ממשלתי (לדנציג Landesamt Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei מקלנבורג-מערב פומרניה, (LALLF M-V)).

1. לפני הניתוח טיפול והכנה של החיה

1. עם ההגעה במתקן של בעלי חיים, חלק חיות (C57Bl/6) לקבוצות גודל דומה, לכלוא כל קבוצה ביחד ולשמור קבוצות קבועה לאורך כל הניסויים.
   הערה: השתמש חיות מאותו המין. הממצאים המתוארים התקבלו עם עכברים זכרים.
   הערה: אם זכר בעלי חיים משמשים, קבוצות כלוב יחד מתחיל כאשר הם בגיל 7 שבועות, כך ניתן ליצור היררכיה, ובכך למזער את הסיכון של התנהגות אגרסיבית במהלך הניסויים.
2. לפחות שבוע לפני הניתוח, לעבור אנרגיה גבוהה (> 14 MJ/kg) וחלבון גבוהה (> 20%) להאכיל המכיל את כל יסודות קורט חיוניים וויטמינים (לפרטים, ראה רשימת חומרים).
   הערה: מבטיח כל העכברים שוקלים לפחות 25 g כאשר הניתוח מבוצע.
3. זירוז אלחוש, שיכוך כאבים באמצעות הזרקת בקרום הבטן של קטאמין (i.p. 87 מ"ג/ק"ג), חריגות השירותים הווטרינריים הידרוכלוריד (i.p. 13 מ"ג/ק"ג). המתן עד העכבר סובלנית גירוי מכני, למשל הבוהן זפת, ללא תגובה מוטורית.
4. אבטח את העכבר narcotized עם קלטות במצב פרקדן על אנדרליי חום מוצב השולחן מבצע, המבטיח של אובדן חום גוף מהמם מיצוב במהלך מבצע והימנעות יציב.
   הערה: אנדרליי חום צריך טמפרטורת פני שטח של 36 ° C עד 40 מעלות צלזיוס; טמפרטורת הפעלה החדר צריך להיות 21 ° C.

2. מבצע דיסטלי למעי הגס

1. לגלח את השיער בבטן. לפני תחילת הניתוח, לחטא את השדה מבצע שלוש פעמים באמצעות אלכוהול 70% של iodophor. לעטוף את שדה הפעולה כדי להבטיח תנאים אספטי.
2. לבצע פתיחת בטן החציוני של 15 מ מ על-ידי אם את שרירי הבטן ואת של הצפק לאורך לינאה אלבה, ובכך למזער את אובדן דם.
3. להשתמש מלקחיים atraumatic דה-בייקי שני, משוך בזהירות את המעי האטום, ileum מסוף, עולה ואת המעי הגס של חלל הצפק.
   הערה: הקפד להגביל באופן מכני מניפולציה של המעי כדי למנוע פגיעה במבנים מצע המעי העליון.
4. לזהות את הקוטב cecal, עולה המעי הגס ו המעי הדק (דמויות 1a ו 1b).
   הערה: זיהוי נכון של הגס עולה הוא מהותי עבור מיקום נכון של למעי הגס. במקרים בהם האנטומיה של האזור ileocecal רב-משמעי, הנוכחות של טלאים של פייה מזהה המעי הדק, הנוכחות של צואה בנוי המאפיינת את המעי הגס.
5. להשתמש בסרגל כדי לקבוע את המיקום של למעי הגס בעתיד. זה צריך להיות ממוקם 20 מ מ דיסטלי לשסתום ileocecal עבור למעי הגס דיסטלי.
6. עושים חתך 3 מ מ השני בקיר הבטן ברבע העליון נכון. משוך על קטע המעי הגס שזוהה קודם לכן דרך החתך כדי ליצור לולאה, נזהר שלא לעוות את הלולאה.
7. להעביר בזהירות קליבר 22 גמיש הזרקה דרך לפדר האחורי. . שמור על עצמך שלא יגרמו נזק למבנים וסקולרית מצע המעי העליון.
8. לחזור המעי חלל הצפק.
9. לתקן את שני הקצוות של הצינור הגמיש על העור באמצעות תפרים פשוטים, בתפר resorbable (למשל, polyglactin 910 או polyfil 4-0 1/2 c).
10. לפני סגירת את פתיחת בטן, לבצע החייאה נוזלים באמצעות זריקה בקרום הבטן של 0.5 מ ל 0.9% תמיסת מלח.
11. סגור של הצפק, השכבה שריר בתפר רצוף באמצעות בתפר resorbable (למשל, polyglactin 910 או polyfil 4-0 1/2 c). סגור את העור בתפר רצוף באמצעות בתפר resorbable (למשל, polyglactin 910 או polyfil 4-0 1 / 2c).
12. פתח את לולאת המעי הגס יהיו exteriorized על ידי ביצוע של חיתוך של סכומי ביניים באמצעות מספריים משובחים. למנוע כל פגיעה מצע המעי. לא transect המעי הגס לחלוטין.
13. לתקן כל הפתיחה למעי הגס באמצעות שלושה תפרים מלא-עובי יחיד הצפק, העור באמצעות a monofil, תפר שנספג (למשל, polydioxanone או monofil, 6-0 3/שמיניות). הלולאה מביא, שהוא הקצה פונקציונלי-למעי הגס, ואת הלולאה efferent, אשר פיסטולה ריריות, מופרדים באופן ברור בנקודה זו (איור 1 c).
    הערה: זמן הפעולה צריכה להיות פחות מ-20 דקות כדי להגביל הפסדים תרמיים של נוזלים.
14. לאחר סיום הניתוח, לחיטוי מכשירים באמצעות פתרון נטולת אלדהיד לחיטוי באמבט אולטראסוני לפי ההוראות של היצרן.

3. המזויפים מבצע (Colotomy)

1. בצע שלבים 1.1. דרך 2.4.
2. להשתמש בסרגל כדי לקבוע את מיקום colotomy בעתיד. Colotomy שנמצאת באותו המרחק מן השסתום ileocecal כמו למעי הגס ב קבוצת הניסוי.
3. פתח את המעי הגס לפחות שני שלישים והיקפו באמצעות מספריים משובחים.
4. סגור colotomy עם שכבה אחת, מלא-עובי קטע התפר באמצעות a monofil, שנספג תפר (למשל, polydioxanone, monofil, 6-0 3/שמיניות).
   הערה: זמן הפעולה צריך להיות פחות מ-20 דקות בשביל מנתח experimented, הגבלת הפסדים תרמיים של נוזלים.
5. בצע שלבים 2.10. , 2.11. 2.14.

4. לאחר הניתוח טיפול

1. לחזור חיות הכלובים. מספקים אווירה היטב מחוסמת של 37 ° C (למשל, עם מנורת אינפרא-אדום) עד עכברים ער לגמרי. לאחר מכן, לשמור על עכברים בסביבת טמפרטורה, לחות-מוסדר (21 ° C; 30% ± 10% לחות יחסית). לאפשר גישה חופשית מזון ומים לשתיה. כדי להקל על ספיגת נוזלים, לספק הזנה בבעלי חיים ספוגי מים נוספים.
2. מתחילים כאבים לאחר הניתוח על ידי הזרקת 0.1 מ"ג/ק"ג גוף במשקל הבופרנורפין ספורטינג כאשר בעלי חיים מראים תגובת גירוי מכני. להיות זהירים כדי למנוע דיכאון בדרכי הנשימה.
3. תוספת שתייה עם 1 מ"ג/מ"ל טרמדול עבור המשך כאבים במהלך השבוע לאחר הניתוח הראשון.
4. כדי לפצות על צריכת הנוזלים ירד עקב צמצום הניידות, לספק משטח מוצק לשתות בכלוב בשבוע הראשון לאחר הניתוח.
5. שוקל החיות והתנהגות בעלי חיים ציון מדי יום במהלך השבוע הראשון, בכל יום שני במהלך שארית החודש הראשון, בכל יום שלישי במהלך החודש השני באמצעות התוצאה חומרת המחלה המתוארים Kleinwort. et al. ⁶.

תוצאות

הניתוח הוא נסבל היטב הן את ניסיוני (למעי הגס) והקבוצות דמה (colotomy). התמותה Perioperative לא יעלה על 10% בעת ניתוח וניהול perioperative מבוצע כהלכה. בשבוע שלאחר הניתוח הראשון, הרזיה משמעותית נתפסת בשתי הקבוצות ניסיוני, שאם. חיות של קבוצת המזויפים להשיג שלהם נאדיר משקל בדרך כלל לקראת היום הר...

Discussion

המודל מאתר של DC הוצג פרוטוקול זה אמין מתרבה התכונות histopathological של האדם DC (למשל, פיתוח דה נובו של זקיקי הלימפה submucosa של מקטעי מעי מודלק, קריפטה קיצור הפחתות מספרי הטלפון הנייד גביע). מלבד יתרון זה, מודל זה הנגרמת על ידי גורם מפעילה דומה מאוד, מציג עם קורס קליני של בינוני עד סיכון מתון כ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Operation material
heat underlay, 6 watt	ThermoLux, Witte + Sutor GmbH	461265
Ethanol 70% (with methylethylketon)	Pharmacie of the University Hospital Greifswald
Wooden applicators, small cotton head onesided, wooden stick, 150 mm length	Centramed GmbH, Germany	8308370	for disinfection of operation field
Scissor	Aesculap (BRAUN)	BC064R
Atraumatic DeBakey forceps	Aesculap (BRAUN)	OC021R
Needle holder	Aesculap (BRAUN)	BM012R
Vasofix Safety i.v. cannula 22G	Braun Melsungen AG, Germany	4268091S-01
VICRYL Plus 4-0 violet braided; V-5 17 m 1/2c; 70 cm	ETHICON, Inc.	VCP994H
PDS II 6-0 monofil; V-18 13 mm 3/8c; 70 cm	ETHICON, Inc.	Z991H
BD Plastipak 1 mL (Syringes with needle with sterile interior)	BD Medical	305501
Triacid-N (N-Dodecylpropan-1,3-diamin)	ANTISEPTICA, Germany	18824-01	disinfection of surgical instruments in ultrasonic bath
Medications
ketamine 10%, 100 mg/mL (ketamine hydrochloride)	selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH	9089.01.00	87 mg/kg i.p.
Xylasel, 20 mg/mL (xylazine hydrochloride)	selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH	400300.00.00	13 mg/kg i.p.
NaCl 0.9%	Braun Melsungen AG, Germany	6697366.00.00
Buprenovet 0.3 mg/mL (buprenorphine)	Bayer, Germany	PZN: 01498870	0.1 mg/kg s.c.
Tramal Drops, 100 mg/mL (tramadol hydrochloride)	Grünenthal GmbH, Germany	10116838	1 mg/mL drinking water
Ceftriaxon-saar 2 g (ceftriaxone)	Cephasaar GmbH, Germany	PZN: 08844252	25 mg/kg body weight i.p.
metronidazole 5 mg/mL	Braun Melsungen AG, Germany	PZN: 05543515	12.5 mg/kg body weight i.p.
Food
ssniff M-Z Ereich	ssniff, Germany	V1184-3
Solid Drink Dehyprev Vit BIO, pouches	TripleATrading, the Netherlands	SDSHPV-75
Equipment
Nikon Eclipse Ci-L	Nikon Instruments Europe BV, Germany		light microscopy
VetScan HM 5	Abaxis, USA	770-9000	Veterinary hematology analyzer of 50 µl venous EDTA-blood
Bandelin SONOREX (Ultrasonic bath)	Bandelin electronics, Germany	RK 100 H	disinfection of surgical instruments
Software
NIS-Element BR4 software	Nikon Instruments Europe BV, Germany
GraphPad Prism Version 6	GraphPad Software, Inc.