Herstellung von Gradient Nanopattern durch thermische Nanoimprinting Technik und Screening der Reaktion des menschlichen koloniebildenden Endothelzellen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Fertigung der gradient Nanopattern Platten über thermische Nanoimprinting und die Methode der screening-Antworten der menschlichen endotheliale Vorläuferzellen in Nanostrukturen. Durch den Einsatz der beschriebenen Technologie ist es möglich, ein Gerüst zu produzieren, die Zelle Verhalten durch physikalische Reize bearbeiten können.

Zusammenfassung

Nanotopography finden sich in unterschiedlichen extrazellulären Matrizen (ECMs) um den Körper und ist bekannt als wichtige regulatorische Maßnahmen auf zelluläre Reaktionen haben. Allerdings ist es schwierig, das Verhältnis zwischen der Größe einer Nanostruktur und die Reaktionen der Zellen aufgrund der mangelnden richtigen Screening-Tools bestimmen. Hier zeigen wir die Entwicklung von reproduzierbaren und kostengünstige gradient Nanopattern Platten für die Manipulation von zellulären Antworten. Mit anodische Aluminiumoxid (AAO) als ein master-Form, gradient Nanopattern Platten mit Nanopillars der zunehmenden Durchmesserbereiche [120-200 nm (GP 120/200), 200-280 nm (GP 200/280) und 280-360 nm (GP 280/360)] wurden durch eine thermische Prägung Technik hergestellt. Diese Gradienten Nanopattern Platten wurden entwickelt, um die verschiedenen Größen des Nanotopography in das ECM zu imitieren und wurden verwendet, um die Reaktionen des menschlichen koloniebildenden Endothelzellen (hECFCs) Bildschirm. In diesem Protokoll beschreiben wir Schritt für Schritt Verfahren der Herstellung von gradient Nanopattern Platten für Zelle engineering, Techniken der hECFCs aus dem menschlichen peripheren Blut zu kultivieren und Kultivierung von hECFCs auf Nanopattern Platten.

Einleitung

Vor kurzem hat die Reaktion der Zellen durch die physische Stimulation der Oberflächentopographie im Bereich der Zelle engineering^1,2,3,4angestrahlt wurden. Daher konzentriert sich stärker auf dreidimensionale Nanostrukturen auf der Zelle Oberfläche Anlage⁵. Es wurde berichtet, dass der Integrin, das die Oberfläche Anerkennung Gerät der Zelle ist, die körperliche Anregung angetrieben durch die Mikro-Nano-Strukturen der ECM durch Mechano-Transduktion⁶überträgt. Diese mechanische Stimulation reguliert Zelle Verhalten durch Kontakt Leitung⁷ und induziert Zellskelett Reorganisation, Form, neben der fokalen Adhäsionen und Steifigkeit der Zellen⁸zu ändern.

Menschlichen endotheliale Vorläuferzellen (hEPCs) im Körper arbeiten eng mit der Mikroumgebung von den umliegenden ECM-⁹. Dies bedeutet, dass der physikalische Zustand des ECM als ein wichtiger Parameter für die spezifische Zellmatrix Adhäsion Komplexbildung wirkt soviel Blut fließen¹⁰Schubspannung abgeleitet. Es wird berichtet, dass die Oberfläche Nanotopography verbessert die in-vitro- Netzwerkbildung umfangreiche Kapillarrohr hEPCs¹¹ und, dass ein ECM/Bio löslicher Faktor System kombiniert ermöglicht hEPCs, dysfunktionalen Substrate zu erkennen und fördert die Wunde heilen^12,13. Dennoch ist das Verhältnis von ECM und hEPCs nicht klar.

Obwohl viele Forscher versucht zu klären, die Beziehung zwischen Zell-Reaktionen und körperliche Signale von verschiedenen Substraten^14,15,16, verwendet diese Studien nur die feste Größe von einer Nanostruktur oder Nanopatterns mit unregelmäßigen Arrangements, die eine Beschränkung auf die Beziehung zwischen der Größe der Zelle und Nanostrukturen Verhalten aufzuklären haben. Das Problem hier ist ein Mangel an geeigneten Werkzeugen für das screening von zellulärer Reaktionen, die bestehende mühsam und iterative Ansätze zu finden, die optimale Größe der Nanostruktur ersetzen können. Daher ist eine einfache Technik für das screening von Zelle Reaktionen auf körperliche Reize ohne Wiederholung erforderlich.

Hier beschreiben wir eine Methode in unsere früheren Berichte^17,18,19 , um ein gradient Nanopattern zu produzieren, in denen der Durchmesser der angeordneten Nanopillars schrittweise erhöht. Darüber hinaus beschrieben wir auch, wie man pflegen und analysieren das Verhalten von hECFCs auf gradient Nanopattern Platten zu ermitteln, die Wirkung von physikalischen Reize auf die Zellen. Eine milde Anodisierung, stufenweisen Ätzen und Anti-sticking Layer Beschichtungsverfahren dienten gradient AAO Schimmel zu fabrizieren. Durch die Annahme einer thermisches Prägung Lithographie-Technik, wurden identische Polystyrol gradient Nanopatterns auf eine kostengünstige und einfache Weise hergestellt. Mit Farbverlauf Nanopatterns ist es möglich, festzustellen, welche Größe der Nanostruktur hat einen großen Einfluss auf Zelle Verhalten in einem Experiment. Wir erwarten, dass dieser gradient Nanopattern hilfreich sind für das Verständnis der Mechanismen der Interaktion zwischen Blut abgeleitet hECFC oder andere Zellen und Nanostrukturen in verschiedenen Größen.

Protokoll

Diese Studie wurde von der Institutional Review Board Universitätsklinik Korea Anam (IRB Nr. genehmigt ED170495). Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki und ihrer späteren Änderungen durchgeführt.

1. Vorbereitung von Aluminium (Al) Substrat durch Elektropolieren

Vorsicht: Elektropolieren Lösung ist ätzend und giftig. Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung einschließlich Nitril-Handschuhe, Schutzbrille und Kittel. Führen Sie diesen Schritt in einer Dampfhaube.

1. Elektropolieren Lösung durch Mischen Ethyl Alkohol (C₂H₅OH, 99,9 %) ansetzen und Perchlorsäure (HClO_4, 60 %) in einem 1 L-Doppelmantel-Becher (C₂H₅OH:HClO₄ = 4:1).
2. Schließen Sie den Doppelmantel Becher an einen Thermostaten und stellen Sie die Temperatur bei 7 ° C. Setzen Sie den Doppelmantel-Becher auf einen Magnetrührer. Lassen Sie die Lösung unter Rühren für mindestens 30 Minuten, bis die Temperatur auf 7 ° C sinkt.
3. Tauchen die hochreine Al-Platte (99,999 %, 20 × 50 × 1 mm³) und Kohlenstoff Gegenelektrode in das Elektropolieren Lösung mit Krokodilklemmen und Kupferdraht. Passen Sie die Position der Al-Platte und Kohlenstoff Gegenelektrode gegeneinander antreten.
   Hinweis: Es ist notwendig, die Clips sorgfältig zu installieren, so nicht die Lösung zu berühren. Beim Kontakt mit der Lösung können Verunreinigungen fließt aus den Clips die Al-Platte verunreinigen.
4. Die Al-Platte mit dem Pluspol und Kohlenstoff Gegenelektrode zum Minuspol verbinden, von einem Gleichstrom (DC) Stromversorgung.
5. Schalten Sie den Magnetrührer und gelten Sie eine Spannung von 20 V. Maintain dieser Zustand für 4 min.
6. Schalten Sie den Magnetrührer und lassen Sie den Strom für weitere 6 Minuten fließen.
   Hinweis: Der statische Zustand entfernt die meisten Verunreinigungen und Rauheit von der Al-Platte und der dynamische Zustand verbessert die Endqualität des Elektropolieren.
7. Schalten Sie die Stromversorgung und trennen Sie die Al-Platte aus dem Clip manuell zu. Gründlich waschen Sie die Al-Platte mit entionisiertem Wasser, alle restlichen Lösung zu entfernen.
8. Trocknen Sie die Al-Platte mit Stickstoff und Store unter Schutzgas. Führen Sie diese Trocknung am Ende aller Experimente in Schritt 1 und 2.
   Hinweis: Achten Sie beim Druckluft injiziert, Luftstrom aus dem polierten Teil auf die gegenüberliegende Seite. Im umgekehrten Fall können Verunreinigungen nicht poliert Teil entfliehen und verunreinigen die Al-Platte.

2. Herstellung von Gradient AAO Schimmel mit Phosphorsäure Elektrolyt

Vorsicht: Methylalkohol und seine Dämpfe sind okuläre giftig. Kontinuierliche Exposition gegenüber Chrom kann zu schweren Chrom-Vergiftung führen. Führen Sie diesen Schritt in einer Dampfhaube.

1. Primäre Anodisierung
   1. Um 1 L Phosphorsäure Elektrolyt vorzubereiten, laden Sie 590 mL entionisiertem Wasser in einer Glasflasche.
   2. Fügen Sie 400 mL Methylalkohol (CH₃OH, 99 %) und 10 mL Phosphorsäure (H₃PO₄, 85 %) in der Glasflasche. Mischen Sie die Lösung gut durch Schütteln manuell oder mit magnetischen rühren.
   3. Gießen Sie 500 mL des Elektrolyten in ein 1 L Doppelmantel Becherglas. Tauchen Sie die polierte Al Platte und Carbon Gegenelektrode in die Lösung mit Krokodilklemmen und Kupferdraht.
   4. Gießen Sie zusätzliche Elektrolyt um die Begrenzung des Elektropolieren ca. 2-3 mm über die Oberfläche der Lösung zu finden.
      Hinweis: Wenn Anodisierung mit der Begrenzung des Elektropolieren berühren die Lösung durchgeführt wird, neigt die Al-Platte, während die Anodisierung brennen.
   5. Installieren Sie eine vertikale Welle auf einem U-Form-Sockel. Befestigen Sie eine obenliegende Rührer und Laufrad mit Metall-Klammern. Positionieren Sie den Propeller des Laufrades am unteren Ende der beiden Elektroden. Die Rotationsgeschwindigkeit des obenliegenden Rührers zwischen 200 und 300 u/min eingestellt.
   6. Schließen Sie den Doppelmantel Becher an einen Thermostaten und stellen Sie die Temperatur bei-10 ° C. Lassen Sie das System für mindestens 1 h unter Rühren, bis die Temperatur auf-10 ° C sinkt.
      Hinweis: Verwenden Sie nicht Wasser als Kühlmittel. Da das Wasser bei niedrigen Temperaturen gefriert, wird die Zirkulation nicht normal funktionieren. Es wird empfohlen, eine Mischung aus Wasser und Ethylalkohol bei einem Verhältnis von 1:1 als Kühlmittel verwenden.
   7. Wenden Sie eine Spannung von 195 V unter Rühren für 16 h.
      Hinweis: Wenn der Strom mehr als 50 steigt mA innerhalb 2 oder 3 Stunden nach Anlegen der Spannung, die Wahrscheinlichkeit, dass die Verbrennung erfolgt ist sehr hoch. Sofort beenden Sie den Prozess und ersetzen Sie die Al-Platte durch eine neue. Wenn dieses Problem wiederholt auftritt, überprüfen Sie, daß es keine Anomalie in der Temperaturregelung des Thermostaten. Wenn es keine Anomalie gibt, Ändern des Elektrolyts.
   8. Beenden Sie das Netzteil und manuell trennen Sie die Al-Platte aus dem Clip. Waschen Sie die eloxierte Al-Platte mit entionisiertem Wasser, alle restlichen Lösung zu entfernen.
2. Aluminiumoxid-Radierung
   1. Bereiten Sie Chromsäure Radierung Lösung durch Auflösen von 9,0 g Chromoxid (CrO-₃) und 20,3 mL Phosphorsäure (H₃PO₄, 85 %) in 500 mL entionisiertem Wasser vor.
   2. Gießen Sie die Radierung Lösung in 1 L Doppelmantel Becherglas. Stellen Sie die Temperatur bei 65 ° C.
   3. Tauchen Sie die eloxierte Al-Platte in der Radierung Lösung für mindestens 10 h unter Rühren. Verschließen Sie die Spitze des Bechers mit Alufolie.
   4. Spülen Sie die geätzte Al-Platte mehrmals mit entionisiertem Wasser.
3. Sekundäre Anodisierung
   1. Legen Sie die gleichen Versuchsbedingungen als Schritt 2.1.1 zu 2.1.7.
   2. Laden der geätzten Al-Platte an der Anode des Systems und einer Spannung von 195 V 6 h. Dann schalten Sie die Stromversorgung und trennen Sie die Al-Platte aus dem Clip manuell zu. Waschen Sie die eloxierte Al-Platte mit entionisiertem Wasser.
      Hinweis: Wenn die Zeit des Waschens verzögert wird, erhöht die Porengröße der AAO unbeabsichtigt aufgrund der verbleibenden Phosphorsäure.
4. Gradient Pore Verbreiterung
   1. Bereiten Sie eine immer größer werdende Porenlösung durch 5,765 g Phosphorsäure in 500 mL entionisiertem Wasser auflösen. Gießen Sie die Lösung in ein Becherglas 1 L Doppelmantel.
   2. Verbinden Sie den Doppelmantel-Becher mit Thermostaten und stellen Sie die Temperatur auf 30 ° C. Stellen Sie eine lineare Bewegung Bühne senkrecht neben den Becher. Befestigen Sie eine Halterung auf den beweglichen Teil der linearen Phase.
   3. Legen Sie den beweglichen Teil der linearen Phase in die Ausgangsposition. Befestigen Sie den Clip an der Halterung und laden Sie die eloxierte Al-Platte zu.
   4. Manipulieren Sie die Position der Platte Al manuell so, dass die Al-Platte direkt über der Oberfläche der Lösung kommen wird.
      Hinweis: In diesem Schritt sollte die Al-Platte berühren nicht die Lösung. Die Pore Erweiterung Prozess beginnt, sobald die Al-Platte die Lösung erreicht.
   5. Allmählich Tauchen die Al-Platte in die Lösung mit einer Geschwindigkeit von 4,86 µm/s 120 min um eine 35 mm AAO Form mit einer Größe von 120 gradient machen nm auf 200 nm (GP 120/200). Starten Sie im Moment, den die Al-Platte die Oberfläche der Lösung berührt, eine Stoppuhr.
   6. Um GP 200/280 und GP 280/360 Formen bilden, Tauchen Sie die gesamte Fläche des GP 120/200 Schimmel in die Pore Lösung für 2 oder 4 h, bzw. Erweiterung.
   7. Spülen Sie die gradient Al-Platte mit entionisiertem Wasser mehrmals.

(3) Ablagerung von Anti-Sticking Layer auf Farbverlauf AAO Schimmel mit selbst-zusammengebauten monomolekularen Film

Hinweis: Führen Sie Schritte 3.2.1 zu 3.3.3 in einem Handschuhfach. Schließen Sie eine Vakuumpumpe und trockenem Stickstoff-Gas-Injektor für das Handschuhfach. Legen Sie alle Proben, Reagenzien und Apparate in der Glove-Box vor der Entfeuchtung. Wiederholen Sie Evakuierung und Stickstoff Gas Einspritzzyklus mehr als dreimal, um ausreichend Feuchtigkeit aus dem Handschuhfach zu entfernen. Lassen Sie die trockenen Stickstoff fließen durch das Experiment.

1. Hydroxyl-Änderung der AAO Schimmel mit Piranha-Behandlung
   1. Gießen Sie 140 mL Schwefelsäure (H₂SO₄, 95 %) in ein Becherglas Polytetrafluorethylen (PTFE). Fügen Sie 60 mL Wasserstoffperoxid tropfenweise (H₂O₂, 30 %). Lassen Sie es für 30 min, bis die Lösung abgekühlt ist.
      Vorsicht: Extrem vorsichtig sein beim Piranha-Lösung machen. Ab dem Zeitpunkt der Zugabe von Wasserstoffperoxid die Lösung kräftig kocht und erzeugt hohe Temperaturen. Führen Sie das Experiment in einer Dampfhaube.
   2. Eintauchen die AAO-Form in die Lösung für 30 s mit einer nichtmetallischen Pinzette.
   3. Spülen Sie die AAO Form mehrmals mit entionisiertem Wasser. Die Form in entionisiertem Wasser für 30 min einweichen und steckte es in Methylalkohol für weitere 30 Minuten.
      Vorsicht: Wenn die verwendete Piranha-Lösung zu verwerfen, verdünnen Sie die Lösung mit reichlich Wasser aus dem Wasserhahn.
   4. Trocknen Sie vollständig die AAO Form unter Vakuum für 3 h.
2. Vorbereitung von 20 × HDFS Stammlösung
   Hinweis: HDFS ist die Abkürzung (Heptadecafluoro-1,1,2,2, - Tetrahydrodecyl) Dimethylchloro-Silan
   1. Füllen Sie ein Drittel der Flasche 1 L n-Hexan mit Molekularsieben. Verschließen Sie die Flasche mit Paraffin Film und speichern Sie es unter trockenem Stickstoff für 24 h.
   2. Filtern Sie die 200 mL n-Hexan mit einer Glasspritze und 0,2 µm PTFE Spritze Filter.
   3. Gießen Sie die 80 mL von gefilterten n-Hexan in eine 100 mL Flasche. 2 mL HDFS hinzugeben.
3. Selbst-zusammengebauten monomolekularen Film Ablagerung
   1. 57 mL von gefilterten n-Hexan in einen 100-mL-Becherglas zu laden. Die AAO-Form in das Lösungsmittel eintauchen.
   2. N-Hexan zu 2,9 mM HDFS Lösung fügen Sie 3 mL der Stammlösung HDFS hinzu. Warten Sie 10 Minuten für die Reaktion auf fortfahren.
   3. Übertragen Sie die AAO Schimmel auf frische n-Hexan. Schließen Sie und versiegeln Sie alle Flaschen Reagenz. Schließen Sie das Stickstoff-Ventil, dann Proben aus dem Handschuhfach herausziehen.
      Hinweis: HDFS ist extrem empfindlich gegenüber Feuchtigkeit. Speichern Sie alle Reagenzien, die in einem Exsikkator HDFS enthalten.
   4. Genießen Sie die AAO Schimmel in 60 mL Methoxynonafluorobutane (C₁₀H₆F₁₈O₂, 99 %). Ultraschall reinigen die AAO-Form in einen Becher für 10 s pro einmal physisch entfernen adsorbiert HDFS Moleküle. Wiederholen Sie den Reinigungsvorgang 10 mal.
      Hinweis: Verfügbarmachen der AAO-Schimmel, Ultraschall für eine lange Zeit ohne Unterbrechungen wird die Oxidschicht beschädigt.
   5. Trocknen Sie vollständig die AAO Form unter Vakuum für 24 h.
      Hinweis: Ein erfolgreich abgelegten Anti-sticking-Layer ist besonders wasserabweisend und monatelang stabil, wenn Sie in einem Exsikkator gespeichert. Das Protokoll kann hier angehalten werden.

4. Herstellung von Gradient Nanopattern-Platten durch thermische Prägung

Hinweis: Führen Sie Schritte 4.2 bis 4.7 in einem Reinraum.

1. Schneiden Sie eine 1,1 mm dickem Polystyrol-Platte auf eine Größe von 2,9 mm breit von 3,7 mm lang mit einem Printed Circuit Board (PCB) Cutter.
2. Schneiden Sie die AAO Form 35 mm von der Unterseite mit einem Nipper. Markieren Sie den probennamen und Herstellungsdatum auf der Rückseite.
3. Eine 8.0" Wafer mit einer kleinen Dosis von Ethylalkohol zu reinigen. Setzen Sie die Polystyrol-Platten auf dem Wafer, dann montieren Sie die AAO-Form.
4. Setzen Sie die Unterfolie in der Schublade des thermischen Imprinter. Legen Sie die Oberfolie auf die Dichtung.
5. Setzen Sie die Wafer auf die Unterfolie. Legen Sie die Dichtung auf dem Wafer. Stellen Sie sicher, dass es kein Staub auf dem Wafer.
6. Schließen Sie die Schublade des thermischen Imprinter. Anwenden von 165 ° C Hitze und 620.52 kPa Druck für 100 s.
7. Die Probe auf Raumtemperatur abkühlen. Drehen Sie vorsichtig die Polystyrol-Platte um die AAO Form zu lösen.

5. die Sterilisation und hydrophilen Modifikation der Gradient Nanopattern Platten

1. Legen Sie die Nanopattern-Platten auf einen quadratischen Teller. Gießen Sie 100 mL 70 % Ethylalkohol und UV-Licht für 30 min aussetzen.
2. Trocknen Sie die Nanopattern-Platten mit Stickstoff. Übertragen Sie die Nanopattern-Platten auf eine Sauerstoff-Plasma-Generator.
3. Die Kammer zu evakuieren, bis 1,33 erreicht PA. Dann Spritzen Sauerstoff mit einer Rate von 30 cm3/min gelten eine Hochfrequenz-Leistung von 60 W. Maintain Sauerstoffplasma für 90 s.
   Hinweis: Es wird empfohlen, plasmabehandelte Nanopattern Platten innerhalb von 14 Tagen zu verwenden.
4. Legen Sie die Nanopattern-Platte am unteren Rand der Zelle Kulturschale mit einem Tropfen Toluol.
5. Die Proben in einem Beutel verschließen und mit Niedrigtemperatur-Plasma Sterilisator sterilisieren.

6. Anbau von hECFCs

Hinweis: Führen Sie alle sandbacken Verfahren bei 4 ° C, sofern nicht anders angegeben.

1. Vor das periphere Blut zu isolieren inkubieren MONONUKLEÄRE Zellen (PBMCs) die Kollagen-beschichtete 12-Well-Kulturschale bei 37 ° C für 1 h.
2. Waschen Sie die 12-Well Kulturschale mit 1 × sterile Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
3. Sammeln Sie 50 mL des menschlichen Blutes mit einem Heparin-Inhibitor-Rohr.
4. 6 mL hydrophil Polysaccharid-Lösung in eine 15 mL-Tube und fügen Sie 8 mL Blut der hydrophil Polysaccharid-Projektmappe hinzu.
   Hinweis: Langsam pipette das Blut in die hydrophil Polysaccharid-Lösung.
5. Zentrifugieren Sie das Rohr auf 1020 X g für 20 min. zu die Zellen zu Pellets.
6. Ernten Sie der undurchsichtige Zellschicht, und übertragen Sie auf eine neue 15 mL Tube.
7. Fügen Sie 10 % fetalen bovine Serum (FBS)-enthaltenen PBS und Zentrifugieren Sie das Rohr auf 1020 X g für 10 min. zu die Zellen zu Pellets.
8. Entfernen des Überstands und Lyse der Erythrozyten Puffer. Halten Sie für 5 min auf Eis.
9. Fügen Sie 10 % FBS enthaltenen PBS und Zentrifugieren Sie das Rohr auf 1020 X g für 5 min zu die Zellen zu Pellets.
10. Entfernen Sie den überstand zu und fügen Sie 10 % FBS enthaltenen PBS. Zentrifugieren Sie das Rohr auf 1020 X g für 5 min zu die Zellen zu Pellets.
11. Den überstand zu entfernen und fügen Sie 1 mL der Endothelzellen Erweiterung Medium ergänzt mit 10 % FBS. 8,0 × 10⁶ Samenzellen pro Bohrloch für jedes Gericht mit Kollagen beschichtet.
12. Ändern Sie das Kulturmedium täglich für 1 Woche. Ändern Sie das Kulturmedium dann alle 2 Tage.
    Hinweis: hECFCs finden Sie nach Kultur Tag 10-14. hECFCs zeigen typische Kopfsteinpflaster-ähnliche Morphologie und bilden eine Kolonie, die in Phasenkontrastmikroskopie beobachtet werden kann. Immunfluoreszenz-Färbung des vaskulären endothelialen Cadherin (CD144) und von-Willebrand-Faktor (vWF) kann auch zur Charakterisierung von der hECFCs nach weiteren Zelle Ausbau erfolgen.
13. Um die hECFCs zu pflegen, nutzen Sie Endothelzellen Erweiterung Medium mit 5 % FBS und Penicillin/Streptavidin bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 5 % CO₂ergänzt. Ersetzen Sie das Medium einmal pro Tag.
14. Wachsen Sie nach hECFC Induktion die Zellen Durchgang 7 für weitere Experimente.

7. Zell-Aussaat und Kultur auf den Gradient Nanopattern Platten

Hinweis: Schritt 7 beschreibt die Kultur der hECFCs auf der gradient Nanopattern Platte, aber andere Quellen der Zelle können auch verwendet werden.

1. Bestreichen Sie die Steigung Nanopattern Platten mit 1 mL 0,1 % Protein Beschichtungslösung mit PBS-Puffer für 10 min bei Raumtemperatur.
   Hinweis: Die 0,1 % Protein-Beschichtung deckt nicht die Nanopillar-Funktionen.
2. Machen Sie eine hECFCs Suspension aus der Kulturschale, indem eine Zelle teilen Standardmethode mit Trypsin.
3. Verdünnen Sie die Zellsuspension zur Erreichung der gewünschten Mündung. Samen der hECFCs auf den gradient Nanopattern Platten und flache Kontrolle (z. B. 1,0 × 10⁴ Zellen/cm²).
   Hinweis: Wenn hECFCs auf 1,0 × 10⁴ Zellen/cm² gradient Nanopattern Platten ausgesät werden, erreicht die Zelle Konfluenz in der Regel zu 70-80 % nach 2 Tagen.
4. Kulturzellen Sie auf flachen oder Farbverlauf Nanopattern Platten für 2 Tage im Inkubator.

8. Beobachtung und Analyse

1. Rasterelektronenmikroskop (REM) Bildgebung
   1. HECFCs für Übernachtung auf flachen oder Farbverlauf Nanopattern Platten mit 2,5 % Glutaraldehyd bei 4 ° C kultiviert zu beheben.
   2. 1 % Osmium ausgefällt für 1 h bei Raumtemperatur zu behandeln. Waschen Sie Proben mit PBS.
   3. Proben mit Ethylalkohol von niedrigen zu hohen Konzentration (50 %, 70 %, 80 %, 90 % und 100 %) für 10 min pro jeden Schritt zu entwässern.
   4. Hexamethyldisilazane (HMDS) für 15 min bei Raumtemperatur zu behandeln. Danach waschen Sie Proben mit frischen HMDS und Proben unter dem Abzug mindestens 1 Tag bis die verbleibende HMDS vollständig verdunstet.
   5. Bestreichen Sie die Proben mit Platin Sputter Coater für 5 min und untersuchen Sie die Proben mit einer SEM
2. Getriebe-Elektronenmikroskop (TEM) Bildgebung
   1. HECFCs für Übernachtung auf flachen oder Farbverlauf Nanopattern Platten mit 2 % Paraformaldehyd und 2,5 % Glutaraldehyd Mischung mit PBS-Puffer bei 4 ° C kultiviert zu beheben.
   2. Führen Sie nach Fixierung mit 1 % Osmium ausgefällt und Proben, die mit der Methode in 8.1.3 zu entwässern.
   3. Proben in Epoxidharz einbetten. 60 nm dicke Schichten aus Blöcken und legen Sie einen Abschnitt auf einem TEM-Raster.
   4. Färben Sie den Abschnitt mit der Mischung aus 10 mg Uranyl Acetat in 100 mL Methanol und 0,1 mg Blei Citrat in 100 mL destilliertem Wasser. Bilder mit einem TEM zu erhalten.
3. Fluoreszenz-Färbung
   1. Beheben Sie hECFCs kultiviert auf flachen oder Farbverlauf Nanopattern Platten mit 4 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur 15 Minuten.
   2. Permeabilize und Proben mit 5 % Ziege Serum und 0,1 % Octylphenol bei Raumtemperatur für 30 min in PBS (PBST) ethoxylate zu blockieren.
   3. Inkubieren Sie Proben mit Anti-Human vinkulin primären Antikörper (1: 500 in PBST) bei Raumtemperatur 2 h. Spülen Proben dreimal mit PBST.
   4. Inkubieren Sie Proben mit Fluoreszenz-konjugiert Phalloidin (1:1, 000 in PBST), Fluoreszenz-konjugierten Sekundärantikörper (1:1, 000 in PBST) bei Raumtemperatur 2 h. Spülen Proben dreimal mit PBST.
   5. Inkubieren Sie Proben mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI, 1:1,000 in PBST) in 5 min bei Raumtemperatur.
   6. Fallen Sie 10 µL Eindeckmedium auf der Oberfläche der gradient Nanopattern. Das Eindeckmittel einem deckgläschen auflegen.
   7. Legen Sie die Probe auf dem Kopf stehend auf der Probe-Bühne und Abrufen von Bildern mit konfokale Fluoreszenzmikroskop.
4. Bildanalyse
   1. Übertragen Sie aufgenommenen Bilder von der hECFCs auf eine Bild-Analyse-System.
   2. Wählen Sie die zufällige Phalloidin Färbung Bild. Passen Sie den Schwellenwert und erstellen Sie ein binäres Bild, in dem Zellen vom Hintergrund unterscheiden.
   3. Zeichnen Sie die Konturen um Zellen manuell die Anzahl Filopodien pro Zelle zu Zelle Fläche und Umfang zu messen.
   4. Wählen Sie das zufällige Feld der vinkulin Färbung Bild. Passen Sie den Schwellenwert und erstellen Sie ein binäres Bild fokale Adhäsion Bereiche.
      Hinweis: Stellen Sie Bild Schwelle entsprechend um künstliche über - oder unter - Abfüllungen von fokalen Adhäsion Bereiche zu vermeiden.
   5. Die Anzahl der fokale Adhäsion der einzelnen Zellen.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt die SEM Bilder der vorgefertigten Gradienten AAO Formen je nach Art und Lage. Abbildung 2 zeigt SEM Bilder der gradient Nanopattern Platten mit regelmäßigen runden Nanopillars und Abbildung 3 ist Quantifizierung Daten der Nanopillar Durchmesser. In Tabelle 1 sind die Merkmale von vorgefertigten Nanopillars.

Diskussion

Herstellung von einem AAO oft weist Mängel wie Risse, unregelmäßige Formen von Poren und brennen. Der Hauptgrund für diese Mängel ist eine elektrolytische Zusammenbruch, die stark von der Art der Metall Substrate werden eloxiert und der Widerstandsfähigkeit der Elektrolyt²¹betroffen ist. Da der Widerstand des Elektrolyten abhängig von seiner Temperatur schwankt, ist die Beseitigung der Hitze kontinuierlich von Elektroden der kritische Punkt, die standortbezogene Temperatur des Elektrolyten ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Perchloric acid 60%	Daejung Chemicals & Metals	6512-4100
Ethyl alcohol, absolute 99.9%	Daejung Chemicals & Metals	4118-4100
Phosphoric acid 85%	Daejung Chemicals & Metals	6532-4400
Methyl alcohol 99.5%	Daejung Chemicals & Metals	5558-4400
Chromium(VI) oxide	Daejung Chemicals & Metals	2558-4400
Sulfuric acid 95%	Daejung Chemicals & Metals	7781-4100
Hydrogen peroxide 30%	Daejung Chemicals & Metals	4104-4400
n-hexane 95%	Daejung Chemicals & Metals	4081-4400
Toluene 99.5%	Daejung Chemicals & Metals	8541-4400
(heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrodecyl)dimethylchlorosilane	Gelest	SIH5840.4	Moisture sensitive
Methoxynonafluorobutane 99%	Sigma aldrich	464309
Collagen solution	Stemcell	#4902
Gelatin	Sigma aldrich	G1890	Protein coating solution
Ficoll-Paque	GE Heathcare	17-1440-03	Hydrophilic polysaccharide solution
EGM-2MV	Lonza	CC-3202	Endothelial cell expansion medium
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Phosphate buffered saline	Gibco	10010031
Fetal bovine serum	Gibco	12483-020
Paraformaldehyde	Sigma aldrich	P6148
Glutaraldehyde	Sigma aldrich	G5882-100ML
Osmium tetroxide	Sigma aldrich	201030-1G
Hexamethyldisilazane	Sigma aldrich	440191
Triton X-100	Sigma aldrich	X100-100ML	Octylphenol ethoxylate
Goat serum	Gibco	26050-088
anti-human vinculin primary antibody	Sigma aldrich	V9131
F-actin probe	Molecular Probes	A12379	Fluorescence-conjugated phalloidin
Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody	Molecular Probes	A11001	Fluorescence-conjugated secondary antibody
4',6-diamidino-2-phenylindole	Sigma aldrich	D9542
Mounting medium	DAKO	S3023
Anti-human vWF primary antibody	DAKO	A0082
Anti-human CD144 primary antibody	BD Biosciences	#555661
Eponate 12™ Embedding Kit, with BDMA	Ted Pella	18012	Epoxy resin
Uranyl Acetate, 25g	Ted Pella	19481
Lead Citrate, Trihydrate, 10g	Ted Pella	19312
Ultra pure aluminum plate	Goodfellow	26050-088
Polystyrene sheet	Goodfellow	ST313120
8.0" silicon wafer	Siltron	29-01024-03	Single side polished, 725 µm thick
Vacuum desiccator, 4.4 L	Kartell	KA.230
Vacuum pump	Vacuumer	V3.VOP100
Power supply	Unicorntech	UDP-3003
Magnetic stirrer	Daihan scientific	SL.SMS03022
Overhead stirrer	Daihan scientific	HT120DX
Circulator	Daihan scientific	WCR-P12
Linear moving stage	Zaber	A-LSQ300A-E01-KT07
Angle bracket, 90 degrees	Zaber	AB90M	Accessory of the linear moving stage
PMP forcep, 145 mm	Vitlab	67995	Nonmetallic tweezer
PTFE beaker, 250 mL	Cowie	CW007.25
Ultrasonic cleaner	Branson	B2510MTH
PCB cutter	Hozan Tool Industrial	K-110
Nanoimprint device	Nanonex	NX-2000
Oxygen plasma generator	Femto Science	CUTE
Low temperature sterilizer	Lowtem	Crystal 50
CO2 Incubator	Panasonic	MCO-18AC
Confoal laser scanning microscope	Carl Zeiss	LSM700
Scanning electron microscope	JEOL	JSM6701
Transmission electron microscope	Hitachi	H-7500