El percebe Balanus improvisus como modelo Marina - cultivo y expresión del gen

Resumen

El percebe Balanus (Amphibalanus) improvisus es un modelo para el estudio de osmoregulación y antifouling. Sin embargo, natural desove estacional produce una fuente impredecible de larvas de cyprid. Aquí, se describe un protocolo para el cultivo de todo el año de B. improvisus , incluyendo la producción de larvas. Se ilustra el uso de percebes cultivadas en estudios de expresión génica.

Resumen

Percebes son crustáceos marinos con un adulto sésil y larvas planctónicas, nadan libremente. El percebe Balanus (Amphibalanus) improvisus es particularmente relevante como modelo para los estudios de mecanismos osmoregulatoria debido a su extrema tolerancia a la salinidad baja. Es también ampliamente utilizado como un modelo de solución de biología, en particular en lo referente a investigación de antifouling. Sin embargo, natural desove estacional produce una fuente impredecible de larvas de cyprid de estudios. Se describe un protocolo para el cultivo de todo el año de B. improvisus se ha desarrollado y una descripción detallada de todos los pasos en la línea de producción (es decir, el establecimiento de cultivos adultos en paneles, la recogida y cría de larvas de percebe y la administración de la alimentación de adultos y larvas). La descripción también proporciona una guía de solución de problemas y analiza los parámetros críticos (por ejemplo, la eliminación de la contaminación, la producción de alimentos de alta calidad, mano de obra necesitada y la importancia del agua de mar de alta calidad). Cada lote de cultivo sistema máximo rinde aproximadamente 12.000 nauplios y puede ofrecer cuatro lotes en una semana, por lo que puede producir hasta casi 50.000 larvas por semana. El método utilizado para cultura B. improvisus es, probablemente, en gran medida también aplicable a otros invertebrados marinos con swimminglarvae libre. Los protocolos se presentan para la disección de varios tejidos de adultos, así como la producción de RNA de alta calidad para estudios de expresión génica. También es descritos como cultos adultos y criados cyprids puede ser utilizado en una amplia gama de diseños experimentales para examinar la expresión génica en relación con factores externos. El uso de percebes cultivadas en la expresión génica se ilustra con estudios de posibles roles osmoregulatoria de Na⁺⁺ ATPasa de k y aquaporins.

Introducción

Percebes son crustáceos marinos con un adulto sésil y larvas planctónicas, nadan libremente. La mayoría de las 1.200 especies de percebes habita aguas poco profundas y muchas están a menudo expuestos a baja salinidad. Una especie, el Bahía Percebe Balanus (Amphibalanus) improvisa (B. improvisus), puede tolerar agua casi dulce y Charles Darwin describió esta especie de un pequeño arroyo en el estuario del río de la Plata en Uruguay¹. La salinidad de tolow tolerancia extrema hace B. improvisus un modelo particularmente relevante para los estudios de mecanismos osmoregulatoria^2,3. Este Percebe prefiere condiciones salobres, pero es capaz de vivir en aguas con salinidades de alrededor 1.6 psu a tan alto como 40 psu⁴. Es la especie de Percebe único encontrada en el salobre mar Báltico. B. improvisus se cree para originar de la costa este del continente americano, pero hoy se encuentra en todo el mundo debido a la dispersión por el envío de⁵. Es un organismo importante de ensuciamiento se encuentra comúnmente en rocas, muelles y cascos de barco y por lo tanto es de interés general para la comprensión de los mecanismos de biofouling en construcciones en aguas marinas y salobres^6,7.

Similar a la mayoría otras percebes, B. improvisus es hermafrodita con intercambio de ideas; reproducción se produce por apareamiento entre individuos vecinos usando un pene alargado y fertilización interna. El periodo reproductivo es principalmente de mayo a septiembre. B. improvisus tiene siete estadios larvarios pelágicos (seis nauplios seguidos por un cyprid etapa⁸). Las portillas del huevo fertilizado en una larva Nauplio que nadan libremente y se alimenta en la columna de agua de hasta varias semanas antes de mudar en una larva de cyprid de no alimentación. El cyprid utiliza señales múltiples para encontrar un sitio adecuado para asentarse y entonces sufre metamorfosis en sésiles Percebe juvenil⁹. Las especies pueden ser cultivadas en el laboratorio y tiene una duración de 1 a 2 años en el mar (2-3 años en cultivo de laboratorio). En promedio, B. improvisus crece a 10 mm de diámetro (con un máximo de alrededor de 20 mm) y alcanza una altura máxima de unos 6 mm (aunque pueden crecer más alto bajo condiciones de hacinamiento). La especie puede ser identificada por su concha hasta calcáreo liso (blanco o grisáceo), la base calcárea radialmente con motivos de la placa de shell y la forma de las placas tergal^1,10.

El percebe B. improvisus tiene varias características ventajosas como modelo para estudios de osmoregulación, centrándose en los mecanismos moleculares y fisiológicos así como las interacciones ecológicas y consecuencias evolutivas. Es también ampliamente utilizado como modelo para las investigaciones de colocar biología, en particular en lo referente a investigación de antifouling y los mecanismos involucrados^7,11,12,13. Sin embargo, natural desove estacional produce una fuente impredecible de larvas de cyprid de estudios. La capacidad de este Percebe a través de su ciclo de vida de la cultura todo el año es, por lo tanto, un activo importante para permitir que varios tipos de estudios moleculares y mecanicistas. Además, su presencia en aguas marinas/salobres en todo el mundo permite una combinación de campo y estudios experimentales. Cría controlada puede también producir familias de conocidos pedigríes para cultivo a largo plazo¹⁴, y un tiempo de generación de unos pocos meses puede permitir la evolución experimental a largo plazo. También hay un genoma proyecto y transcriptomas varios disponibles, y estos recursos han sido utilizados para la clonación de varios genes (por ejemplo, genes de importancia en la osmoregulación)^2,3.

El objetivo de este protocolo es describir cómo establecer y mantener una cultura de los balanos B. improvisus durante todo el año para realizar estudios de expresión génica en adultos o las larvas de este organismo. Rittschof et al. ¹⁵ describe brevemente un método para el cultivo de percebes de la liberación de nauplios a la solución de cyprids para la especie Balanus amphitrite. El protocolo ha sido adaptado para el cultivo de todo el año de B. improvisus en el laboratorio de investigación marina de Tjärnö (Suecia), y se contornea una descripción detallada de todos los pasos en la cadena de producción, incluyendo la producción y cría de la barnacla las larvas, así como la administración de alimento para las larvas y adultos. Para tener una visión general del procedimiento completo, vea la figura 1. El uso del sistema de cultivo se ejemplifica con algunos montajes experimentales comunes e ilustrado en los estudios de genómica funcional de Na⁺⁺ ATPasa de k y aquaporins, dilucidar sus posibles funciones en osmoregulación^{2, 3}. A veces es esencial para examinar la expresión de genes en tejidos específicos, y algunos de los fundamentos de la disección de Percebe serán cubiertos. Con un buen suministro de agua de mar de alta calidad, el cultivo de los balanos B. improvisusy potencialmente muchas otras especies, debería ser posible en laboratorios marinos en todo el mundo.

Protocolo

1. colección de percebes adultos en el campo para comenzar un nuevo reproductores

1. Implementar paneles transparentes de termoplástico (poli metil metacrilato) (110 x 110 x 1,5 mm³) en ≈ 1 – 3 m de profundidad en aguas tranquilas para recoger percebes adultos del campo. Marcos de uso que pueden tener varios paneles (figura 2A), perfore 2 agujeros (con un diámetro de 6 mm) en las esquinas superiores de cada panel y attachthepanelstotherackusingcableties. Así, thepanelswillhangverticallyin el agua.
   1. Cuando el establecimiento de percebes ha ocurrido (identificados como pequeños puntos blancos duros en los paneles), dejar los paneles durante al menos 2-3 semanas para asegurarse de que los percebes son grandes suficiente (5 mm) para ser transferidos al laboratorio sin tener seco o dañado.
2. Poner los paneles en el laboratorio cuando se cubren con colocado B. improvisus que han alcanzado un tamaño de ca. indiameter de 5 mm.
   Nota: El tiempo para los adultos desarrollar a 5 mm en el campo es altamente dependiente de la disponibilidad de alimento y la temperatura. Normalmente, esto toma aproximadamente 3 semanas en el laboratorio de investigación marina de Tjärnö (58.87 ° N, 11.14 ° E). Comúnmente, los paneles para los nuevos reproductores generalmente son desplegados a finales de junio y recogidos a finales de agosto.
3. Limpiar antes de introducir los paneles en el centro de la cultura, otros organismos de los paneles. Es más importante eliminar otras especies de percebes. Tenga en cuenta que es importante limpiar con frecuencia los paneles para eliminar contaminantes especies durante el cultivo, ya que esto aumentará significativamente las posibilidades de supervivencia de los reproductores.
4. Coloque los paneles en posición vertical sobre el borde en un soporte con ranuras fresadas en una bandeja de polietileno (400 x 400 x 20 mm³) (figuras 2 y 2E). Las ranuras en el stand son 15 mm de separación.
5. Para preparar las bandejas, hacer un puerto de entrada en la base y un puerto de salida en la parte superior en el lado opuesto de cada bandeja. Conecte el puerto de entrada de cada bandeja para un depósito de 100 L que contiene aproximadamente 30 L de agua con una entrada de agua de mar abierto a 20 ° C para permitir un flujo a través a una velocidad de ca. 2 L por minuto.
   Nota: Hasta 8 bandejas fueron conectados a un único depósito de 100 L.
6. Conecte el depósito de 100 L para agua de mar control de temperatura (20 ° C) (p. ej., proporcionada por una bomba de calor el intercambio de calor de la agua de mar entrante).
   Nota: El percebe B. improvisus puede crecer y reproducirse en una salinidad marina completo (30 – 35 psu); sin embargo, la reducción de la salinidad a ca. 25 psu mediante la adición de agua dulce para el depósito de 100 L aumenta la producción de larvas de la cultura.

2. a partir de las nuevas generaciones de adultos de Cyprids cultivadas

1. Cubos de construcción de los paneles termoplásticos de abrirán en la parte superior por cintas de 5 paneles utilizando una cinta no tóxico, resistente al agua.
2. Coloque el cubo en una bandeja pequeña (en caso de fugas) y llenarlo con agua de mar (25 psu). Mantener el agua a temperatura ambiente (ca. 20 ° C). Añadir aproximadamente 200 cyprids en la parte superior del cubo.
3. Alimentación de los juveniles con 100 mL de Skeletonema marinoi cada otro día (ver paso 5) mientras que en el cubo.
   Nota: Percebes menores pueden tener dificultades con la ingestión de Artemia salina (ver paso 3) ya que son grandes y, por tanto, difíciles de tragar para un Percebe recién colocado.
4. Cambie el agua 1 x una semana.
5. Después de 2 semanas, cuando los paneles contienen juveniles bastante establecidos de al menos 5 mm de diámetro, desarmar el cubo y poner los paneles con los juveniles de bandejas con flujo throughseawater y después de eso, los percebes de la alimentación con nauplios de a. salina .

3. cultura de nauplios de Artemia salina como alimento para adulto de percebes

1. Establecer un sistema de cultivo para a. salina utilizando una botella de plástico de 1.5 L donde el bottomis cortado y se coloca la botella boca abajo en un soporte e iluminado desde el lado. Ajuste el cuello de botella en un tubo de silicona con una pinza y coloque una bomba de aireación (figura 2D).
2. Para eclosionar los huevos, añadir unos 15 mL de los huevos de reclinación seco de Artemia a 1 L ofseawater.
   Nota: Artemia huevos traman en las larvas Nauplio después de 24 – 48 h. Para retrasar la eclosión de los nauplios de a. salina (p. ej., durante los fines de semana), se puede apagar la luz para reducir ligeramente la temperatura.
3. Para cosechar los nauplios de Artemia , apague la aireación y oscurecer la parte superior de la botella con papel de aluminio (o similar p. ej., una lata)... Iluminar que la parte inferior de la botella para 10 minutos Hatched Artemia nauplii nadará hacia la luz. Los quistes no eclosionados se hundirán hasta el fondo, y cáscaras de quiste flotará en la superficie.
4. Abra la abrazadera en la parte inferior. Recoja la fracción intermedia como una población densa de los nauplios de la natación.
   Nota: Todos los días (excepto los fines de semana), 1 L de la suspensión densa de nauplios de Artemia se agregó manualmente al depósito 100 L conexión a las bandejas con los percebes adultos. Evitar cualquier alimentación con cáscaras vacías del quiste, ya que no proporcionan la nutrición y principalmente resultado de la necesidad de limpiar la cultura a intervalos más frecuentes.

4. recogida y cría de larvas de Percebe

1. Limpiar los paneles con percebes adultos por suavemente rociándolas con agua dulce y, si es necesario, eliminar cualquier suciedad de los paneles usando un cepillo de dientes suave y conchas de percebes. También, limpiar las bandejas (sin percebes) y tubos en caliente (75 º C) agua dulce.
2. Colocar un tamiz de 90 μm plancton-red pegada al extremo de un tubo de PVC cortado (16 cm de diámetro, 15 cm de altura) en una bandeja de polietileno (30 x 20 x 10 cm³) con un puerto de desbordamiento. Recoger las larvas B. improvisus en el tamiz de la noche a la mañana (figura 2C).
   Nota: El tamiz se coloca justo debajo de la abertura de salida de la bandeja de los paneles de Percebe para recibir el agua limpiado y filtrar los nauplios. Las larvas permanecieron en el tamiz, mientras el agua de mar desbordó la bandeja pequeña. Esta bandeja pequeña asegura que el tamiz nunca deshidratado.
3. Coloque un cubo de 30 L en un baño de agua donde la temperatura se mantiene a 26 ° C usando calentadores de tanque de peces de acuario (figura 2E). Aireación y agitación son asegurados por burbujeo de aire a través del sistema.
4. Llenar la cubeta con 20 litros de agua de mar filtrado (0.2 μm; 25 psu). Añadir 1 L al cubo de una mezcla 60/40 de las microalgas 2 diatomeas, marinoi S. y C. gracilis (ver paso 5). Esto le dará una densidad inicial de aproximadamente 5 x 10⁴ diatomeas por mL en el cubo.
   Nota: Las larvas nauplios de Percebe están fototáctica positiva. Los cubos fueron hechos de plástico blanco opaco con tapa que deja pasar algo de luz. Durante el invierno, la sala era iluminada durante el día (8:00 – 17:00), pero oscuro durante la noche. Durante el verano, la luz exterior entró en la habitación durante la mayor parte del día.
5. Transferir lo recaudado B. improvisus nauplios a un plato de cristalización (300 mL; 50 mm de altura y 90 mm de diámetro).
6. Iluminar el plato de al lado, que atraerá a las larvas a la fuente de luz. Recoger los nauplios de Percebe que se reúnen en la luz entrante con una pipeta y transfieren a otro plato de la cristalización. Retire cualquier resto larvas de Artemia .
7. Transferencia de las larvas B. improvisus nauplios en un vaso con 1 L de agua de mar filtrado.
8. Contar el número de nauplios por agitando el vaso suavemente para obtener una suspensión uniforme de las larvas y luego tomar cinco muestras de 1 mL de diferentes lugares en el vaso. Transferir cada muestra en una microplaca para una inspección visual con un estereomicroscopio. Contar el número de nauplios en cada una de las cinco muestras y agregan para arriba.
9. Multiplique al número contado por 200 (1.000 mL/5 mL) para estimar cuántos miles de larvas se encuentran en la totalidad de la taza. Si hay muchas larvas Nauplio en el vaso, diluir la muestra hasta que la densidad es a más de 14.000 larvas/L (generalmente en el rango de 11.000-12.000 larvas/L).
10. Añadir 1 L de B. improvisus nauplios a un cubo, añadiendo aproximadamente 11.000-12.000 larvas por cubo.
    Nota: Asegúrese de no añadir más nauplios, ya que esto resultará en escasez de alimentos en relación con las larvas y, por lo tanto, aumentar la mortalidad.
11. Después de 3 días, recoger los nauplios de Percebe en un tamiz de 90 μm. Luego limpio el cubo (con 75 ° C agua dulce), llenar con agua de mar filtrada, agregar un nuevo feed de diatomeas (la misma cantidad que al principio) y finalmente agregar los nauplios otra vez. Cyprids empiezan a aparecer después de 6 días (± 1 día).
12. Recoger cyprids primero con un tamiz de 90 μm (diseñado en punto 4.2 anterior). Luego separar los nauplios Percebe no muda y cyprids con un tamiz μm 320 encima de un tamiz μm 160. B. improvisus nauplios se acumulará en el 320 μm tamiz y cyprids en el tamiz de 160 μm.
    Nota: Las larvas de cyprid pueden ser almacenadas a 10 ° C en un plato la cristalización en la oscuridad para su uso posterior, hasta ca. 6 días. Sin embargo, el almacenamiento puede afectar la calidad y el rendimiento de las larvas de percebe, experimentos que comparan diferentes tratamientos idealmente deben utilizar larvas del mismo lote (y similar tiempo de almacenaje) para evitar confusión de efectos¹⁶.

5. cultivo de microalgas como alimento para las larvas Nauplio de Percebe

Nota: Las algas fueron cultivadas en 3 diferentes tipos de culturas: () Banco de culturas, que son para el mantenimiento a largo plazo de las cepas que se utilizaban para la inoculación del escalamiento-para arriba; (ii) Inicio culturas, que son el primer paso en la escala; y finalmente (iii) la cultura de la producción, que es la escala de la producción final de grandes cantidades de algas como Percebe.

1. Especies de diatomeas de la orden de la cultura colección de algas y protozoos (PACC) para ser utilizado como alimento para las larvas Nauplio de Percebe. La 2 especie marinoi Skeletonema (cepa 1077/5 de la CCAP) y Chaetoceros simplex var gracilis (1085/3 de la tensión CCAP) dan buenos resultados como alimento.
2. Filtrar todo agua de mar para ser utilizado en los cultivos de algas, usando un sistema de filtro de cartucho con un tamaño nominal de poro de 0,2 μm. (el agua de mar filtrada es también para la incubación de los huevos de a. salina y el cultivo de las larvas Nauplio de barnacle). Autoclave el agua de mar filtrada para los cultivos de algas (a 105 ° C durante 5 minutos).
3. Preparar un medio para el cultivo de microalgas, utilizando agua de mar esterilizada enriquecida con solución de f/2 de Guillard que contiene nutrientes inorgánicos, metales traza y vitaminas (véase Guillard 1975¹⁷ para la receta detallada). Además, preparar una solución de silicato (Na₂SiO₃), pero mantener esto separado de enriquecimiento f/2 para prevenir una precipitación sólida.
   Nota: Las concentraciones de la solución madre de enriquecimiento y de la solución madre de silicato se prepararon para ser utilizado como una adición de 1 mL de cada uno a 1 L de agua de mar.
4. Autoclave todo el equipo utilizado en el cultivo de algas a 120 ° C para tubos de ensayo de Autoclave Tapón Tornillo de 20 min con 1 mL de enriquecimiento f/2 y 1 mL de solución de silicato. Agregar las soluciones de silicato y enriquecimiento a theseawater cuando el material de vidrio esterilizado y líquidos se hayan enfriado a temperatura ambiente.
5. Crecen cultivos stock de microalgas en tubos de ensayo de 40 mL con tapones de rosca.
   1. Llenar los tubos de ensayo con unos 30 mL de agua de mar enriquecido. Inocular los cultivos con una pipeta Pasteur estéril con aproximadamente 1 mL de un cultivo 2 semana de edad. El tapón es entonces equipado pero no apretado, para permitir un intercambio de gases. Si está disponible, la inoculación debe llevarse a cabo en una cabina de flujo laminar para reducir el riesgo de contaminación.
      Nota: El objetivo de los cultivos stock es mantener culturas algas sobre una base a largo plazo y servir como inóculo para iniciar cultivos. Cultivos stock nuevamente se inocularon cada 2 semanas.
   2. Exponer la nueva cultura común a una luz blanca con una intensidad de ca. 25-50 µmole m^-2s^-1 (con un ciclo de luz-oscuridad de h 16:8). Hacia las antiguas culturas stock una baja intensidad de luz como una copia de seguridad. Deseche cualquier culturas stock 2 semana de edad.
6. Para el escalamiento a la cultura de la producción de algas, inocular los cultivos de inicio de la cultura común y crece en 500 mL Erlenmeyerflasks.
   1. Matraces de Erlenmeyer de autoclave 4 pipetas y tapones de algodón con 300 mL de agua de mar filtrado de (0.2 μm) y 4 tubos de ensayo con 0,3 mL de enriquecimiento f/2 y 4 con soluciones de silicato. Enfriar el enriquecimiento f/2 y el silicato a la temperatura ambiente y añadir las soluciones a los matraces de Erlenmeyer. Les inocule con ca. 1 mL del cultivo stock 2 semana de edad.
      Nota: Preparar 2 frascos con S. marinoi y 2 con C. simplex.
   2. Ponga los frascos sobre una mesa temblorosa en una intensidad de luz de 50 µmole m^-2s^-1. Cuando las culturas de inicio tienen poblaciones densas de algas (de color amarillo-café), están listos para utilizarse como inóculo para los cultivos de producción que el percebe las larvas con el alimento.
7. Crecen cultivos de producción en botellas de policarbonato de 4 L con tapones de silicona con 2 puertos perforados provistos de tubos de vidrio.
   1. Conecte el tubo de vidrio 1 llegando a la parte inferior de la botella a una bomba de aire a través de un tubo de silicona, equipado con un filtro de 0.2 μm. Asegúrese de que el segundo tubo de vidrio termina justo debajo del tapón de silicona y se llena de algodón para permitir la salida de aire inyectado.
   2. Cada semana, relleno 4 L botellas con autoclave y agua de mar filtrada les junto con los tapones. Además, la prueba de autoclave 4 tubos con 4 mL de las soluciones de silicato y enriquecimiento f/2.
   3. Después de enfriar, añadir las soluciones de silicato y enriquecimiento f/2 a las botellas y luego los inocular con la mitad del volumen de las culturas de la puesta en marcha en los matraces de Erlenmeyer.
   4. Coloque las cuatro botellas de 4 L en una intensidad de luz de 50 – 100 µmole m^-2s^-1.
   5. Cosecha los cultivos de producción después de ca. 1 semana; entonces son lo suficientemente densos para ser utilizado para la alimentación del Percebe las larvas Nauplio.
      Nota: Las culturas de producción tienen una vida útil de aproximadamente 2 semanas, que significa que hay 8 botellas de producción activa en cualquier momento.

6. diseño de estudios experimentales con percebes

1. Coloque los paneles con percebes juveniles o adulto en el acuario controlado donde se puede cultivar bajo identicalconditions. Esto se llama un experimento de jardín común, que, por ejemplo, puede utilizarse para entender adaptaciones locales o plasticidad fenotípica¹⁸, o para estudiar cambios de expresión génica en relación con factores externos (por ejemplo, salinidad, temperatura o pH).
   Nota: También es posible utilizar percebes recogidos directamente del campo de paneles. Una ventaja de la utilización de individuos criados en laboratorio es que efectos maternos pueden evitarse cuando se usa la siguiente generación de la prole.
   1. Exponer percebes a las condiciones ambientales específicas durante un intervalo de chosentime, seguido por la recolección de los adultos (p. ej., estudios sobre la expresión génica)².
2. Para los experimentos con larvas de cyprid para el estudio de la expresión de gen³, coloque el cyprids en acuarios controlados donde se pueden cultivar larvas bajo condiciones idénticas.
   1. La cyprids de la cosecha después de períodos de tiempo especificados por filtración con tamices (como se describe en el paso 4.7) y extracto de RNA según los protocolos siguientes (paso 8).

7. disección de percebes

1. Limpiar el espacio en el laboratorio donde se realizaban la disección y toma de muestras de ADN, bothbefore y entre los individuos, incluyendo todas las herramientas de disección. Esto se hace con cloro para el Banco (o etanol de 96% para el fórceps).
   Nota: Tubos con medios de fijación (etanol o con una solución de estabilización de RNA) se preparan de antemano.
2. Seleccionar a individuos hambrientos grandes y a corto plazo (no darles de comer durante 2 días antes de la disección). Limpie la carcasa del Percebe con un cepillo de dientes para reducir al mínimo el riesgo de contaminación de otras especies (p. ej., bacterias, algas) y enjuagar con agua.
   Nota: La razón para el hambre a corto plazo de los individuos antes de la disección evitar cualquier contaminación de ADN (por ejemplo, de quistes de Artemia en el intestino).
3. Coloque los percebes individuales sobre una superficie plana, ya sea conectada a un panel o suelta en un plato. Disecar los tejidos respectivos del adulto. Hay varias formas de disecar percebes, dependiendo de la finalidad del estudio.
   1. Método de disección A: fijación del Percebe todo lo antes posible.
      1. Quitar el percebe todo desde el panel mediante un bisturí, insertarlo en el percebe y cerca de la superficie del panel.
         Nota: En la mayoría de los casos, esta manipulación deja la placa basal casi intacto, no afectando el percebe dentro.
      2. Romper cuidadosamente la cáscara externa de un lado insertando fórceps (figura 3). Esto se hace para facilitar la intrusión de un medio de fijación dentro de la cáscara.
         Nota: Si la cáscara no se rompe en todos antes de colocar el percebe en un tubo de ensayo, puede llevar a un proceso de fijación más lento y una calidad inferior de ADN más adelante.
      3. Poner los percebes rotos en el tubo de ensayo que contiene una solución de almacenamiento de RNA o etanol. Deje el percebe en la solución durante al menos 24 h para su fijación. Cuando se fija el percebe, el animal puede ser sacado de los medios de fijación y coloca en una bandeja de disección. Los cirros, manto y soma (cuerpo) pueden separados entre sí y colocados en tubos separados para más extracciones de ADN o ARN.
         Nota: Es importante observar si existen laminillas de huevos con huevos fecundados dentro el percebe. Si está presente, estos deben ser removidos antes de proceder a las extracciones de ADN para evitar encontrar múltiples genotipos en la muestra.
   2. Método de disección B: quitar el percebe de la cáscara antes de su fijación.
      Nota: Este método no siempre resultar en el manto se muestra ya que se une al interior de la calcareousshell. Pero puede ser un método rápido para el muestreo de ADN de un individuo.
      1. Retire con cuidado, utilizando pinzas de disección, las placas tergal y scutal (figura 3) introducir la punta de las pinzas entre las placas tergal y scutal, agarrando la mano de una placa y tirando suavemente para eliminarlos.
      2. El asimiento de los cirros con fórceps y extracción del Percebe directamente hacia afuera y colóquelo directamente en etanol al 96% o estabilizar la solución para la fijación de la RNA...
         Nota: A veces, el manto será también degustar al mismo tiempo, como se ha visto como un epitelio delgado con pigmentación oscura (en B. improvisus). De lo contrario, el manto puede quitar desde el interior de la cáscara con un bisturí y, después de eso, colocar en etanol o estabilizar la solución de RNA.
         Nota: Las placas tergal y scutal (si intacto) pueden ser secadas y guardadas ya que son útiles para la identificación de las especies¹⁰. Una recomendación general, si hay alguna duda de las especies, es también fotografiar el percebe todo antes de inicializar la disección.

8. ARN extracción para PCR cuantitativa

1. Poner adultos para ser utilizado para las extracciones de RNA en un RNA estabilizar solución incúbelos durante la noche (hasta 24 h) a 4 ° C y luego almacenarlas a-80 ° C.
   Nota: Cyprid larvas son preferentemente seco congelado, sin RNA más tarde directamente en-80 ° C, colocándolas en criotubos y luego sumergir los tubos brevemente (30 s) en nitrógeno líquido antes de almacenarlas a-80 ° C.
2. En el momento de la extracción de RNA, descongelar los percebes en el hielo y usarlos intacto o diseccionar a los tejidos que se utilizará (ver paso 7).
   Nota: debido a la alta diversidad genética entre individuos (≈ 3 – 5% variación codificación regiones; Rosenblad ALM et al., datos no publicados) es aconsejable poola número de individuos adultos, lo que minimiza el efecto de la variación de la secuencia entre individuos en el paso posterior de la qPCR.
3. Para la RNAextraction, añadir 350 μl de tampón de lisis suministrado con un kit de preparación de RNA en tubos de homogeneización con 2,8 mm de cerámica.
   Nota: Granos de cerámica proporcionan un mejor rendimiento del ARN frente a sonicación (Representante de resultados).
4. Un Percebe adulto (conjunto o tejidos) o recoger un mínimo de 20 larvas de cyprid con unas pinzas y colocar en tubos de homogeneización.
5. Proceder directamente a la interrupción y la homogeneización con un molino de grano.
6. Poner los tubos de homogeneización con la muestra y los granos en el soporte de molino de grano. Agitar ellos con una frecuencia de 4.0 m/s durante 20 s. Cool la muestra durante 1 min en hielo. Repetir x 2.
7. Preparar el RNA según el protocolo del kit de aislamiento de RNA comercialmente disponible.
   Nota: Debe realizarse una evaluación del riesgo (incluyendo la lectura de las hojas de datos de seguridad) antes de utilizar métodos de extracción de RNA, para identificar sustancias químicas peligrosas que requieren el uso de una campana de humos y otra ropa de protección, incluyendo guantes (p. ej., la adición de β-mercaptoetanol en el búfer de lisis durante la extracción de RNA se debe realizar en una campana de humos).
8. Cuantificar el ARN. Preparar una solución de trabajo y agregar un estándar y las muestras para un volumen total de 200 μl. Vortex por 2 – 3 s e incúbelos durante 2 minutos insertar los tubos en un fluorómetro y tomar lecturas.
9. Consulte las muestras de RNA para cualquier contaminación de proteína con un espectrofotómetro y comprobar su integridad del RNA con un sistema automatizado de electroforesis (Representante de resultados).
   Nota: Para los preparados de buena calidad, RNA recomienda tener una proporción de 260/280 nm de 2 – 2,2 y un ADN de alrededor de 1.8. Valores menores indican contaminación de proteína y que el procedimiento de extracción tiene que ser optimizado.

9. Gene expresión: cDNA síntesis y qPCR

1. Tratar la DNasa RNAwith obtenidos para eliminar cualquier remainingDNA antes de hacer el cDNA para qPCR.
   1. Compruebe la contaminación de ADN genómico mediante la adición de una muestra de RNA pero no de la transcriptasa reversa al preparar el cDNA. Si hay una amplificación por PCR del gen seleccionado en el cDNA sin transcriptasa inversa, existe contaminación del ADN en el ARN.
      Nota: Para que muestras para RNA-seq (RNA-secuenciación secuenciación de próxima generación de tecnología), el paso de DNasa es menos crítico. En particular, para las muestras con niveles bajos de ARN, el paso de DNasa puede omitirse para no perder demasiado el ARN en el proceso.
2. Realizar síntesis de cDNA usando una cantidad de ARN dentro del intervalo especificado en el comercial cDNA síntesis kit, pero por lo general, uso menos de 50 ng de RNA tratado con DNasa.
3. Diseño de cartillas de qPCR para que recuece a partes del gen de interés donde la identidad de secuencia entre individuos es tan alta como sea posible, pero la identidad de secuencia entre gene paralogs es tan baja como sea posible. Consulte las publicaciones correspondientes para las parejas de primer específicas utilizadas para estudios de expresión génica de Na⁺k⁺ ATPasa³ y aquaporins² (figura 5).
   Nota: Para este propósito, pueden utilizarse datos de la secuencia de RNA-seq de cientos de cyprids o varios adultos.
4. Cartillas de diseño para un gen para la normalización de los niveles de expresión (p. ej., actina). Son los iniciadores utilizados con éxito para la actinia, adelante: 5'-CATCAAGATCAAGATCATCGC-3' y hacia atrás: 5'-ATCTGCTGGAAGGTGGAC-3'.
   Nota: La actina es un gen de control habituales. Sin embargo, otros también se han sugerido como referencia y probado en percebes¹⁹. Además de actina, el uso de RPL8 36B4, EF1 y NADHd1 como referencia ha sido probado³. Se concluyó que no hay diferencias grandes en los niveles de expresión de los genes de referencia respectivos entre soma, cirros, adulto o cyprids.
5. Optimizar la temperatura de recocido para los cebadores diseñados mediante la adición de cantidades crecientes de cDNA (típicamente en el rango de 0.25 – 50 ng) de una mezcla que contiene el SYBR Green, polimerasa, dNTP y 0.3 μm de primer avance y retroceso.
6. Ejecutar protocolos de qPCR a diferentes temperaturas de recocido como sigue: una temperatura de desnaturalización inicial de 95 ° C por 3 min, un paso de desnaturalización a 95 ° C por 20 s, recocido a temperaturas de 55 a 63 ° C por 20 s y una elongación a 72 ° C por 30 s. En total, ciclo 40 ciclos PCR.
   Nota: Primer eficiencia debe mentir en la gama de 90-105% y se calcula como E = (10^(-1/slope)-1) x 100 donde la inclinación es la pendiente de la curva obtenida al trazar el valor de registro de las concentraciones de cDNA contra sus valores de ciclo umbral (Ct).
7. Realizar qPCR utilizando una cantidad adecuada de cDNA, generalmente 1-10 ng, usando el protocolo PCR descrito en el paso 3 con la temperatura de recocido óptimo encontrada.
   Nota: Sólo se utiliza la mayor cantidad de cDNA de genes que se expresan en cantidades muy bajas.

Resultados

Con el procedimiento descrito para el cultivo de percebes adultos de B. improvisus, hasta cuatro lotes de nauplios larvas pueden ser producidas por semana. Sería posible recoger las larvas Nauplio casi cada noche, pero esto requiere de más personas y la infraestructura (con muchos percebes en los reproductores, una cultura libera larvas continuamente). Un factor limitante adicional para la producción de larvas parece ser la disponibilidad de alimento de alta calidad, en particular con respecto a la diatomea Skeletonema. Máximo, cada lote del sistema de cultivo consiste en aproximadamente 12.000 nauplios, así que hasta 50.000 nauplios por semana puede ser cultivado. Sin embargo, algunas semanas puede haber hasta diez veces menos larvas producidas. Un adulto solo puede producir larvas hasta 7.000 por día¹⁴, que significa que 1 – 2 adultos están liberando larvas por cada lote. Dentro de una semana, unos 70-90% de los nauplios recolectados se convertirán en cyprids (rendimiento máximo aproximadamente 30.000 cyprids por semana,) que puede utilizarse para ensayos de asentamiento y los estudios moleculares.

Cabe destacar que existen variaciones en las características cyprid entre lotes, y en general, hay grandes variaciones entre lotes que dentro de los lotes. Por ejemplo, el éxito de adaptación en los ensayos de asentamiento varía entre 30 y 70% para los diferentes lotes. Probablemente, esto se debe a la variación genética individual entre los pares específicos de adultos liberando las larvas durante los períodos de muestreo diferentes. Por supuesto, se recomienda que experimentos repetidos (Replica biológica) deben incluir cyprids de un número de lotes si declaraciones más generales sobre los resultados deben ser hechas. La variación de lote a lote pone exigencias en el diseño experimental, donde se debe aplicar controles adecuados y normalizar en estudios de expresión génica. Sin embargo, incluso después de que se han implementado varios procedimientos de normalización estadística que reducen considerablemente la variación entre lotes, algunos efectos del lote son generalmente todavía aparentes (datos no publicados).

Siguiendo el protocolo previsto, es posible obtener, en promedio, 500 ng de ARN de alta calidad desde tan poco como 20 cyprids, independientemente de la etapa de establecimiento de Percebe (tabla 1). La calidad del ARN se mide normalmente como la relación entre los picos de 18S y 28S (la posición esperada de los dos picos se indica en la figura 4). Sin embargo, en el caso de percebes y muchos otros artrópodos, 28S rRNA se descompone cuando se calienta (como parte del método de análisis) y migra junto con el pico de 18²⁰. Por esta razón hay, en principio, un solo pico de rRNA en este tipo de análisis para los percebes. Está claro de esta prueba (figura 4) que una homogeneización por granos de cerámica proporciona el ARN con la más alta integridad y es, por tanto, el método de elección. El ARN es suficiente en cantidad y calidad para generar bibliotecas de secuenciación de alta calidad para la secuencia, dando por resultado un promedio de 70 millones de lecturas por muestra (el número de lecturas, por supuesto, depende del nivel de multiplexación durante la secuenciación). La cantidad de ARN también es suficiente para el análisis de expresión de cDNA síntesis y qPCR de un gran número de genes.

La figura 5 muestra el resultado del análisis de qPCR de aquaporins y de Na⁺k⁺ ATPasa (NAK1) empalme variantes, donde se investigaron los cambios de expresión en respuesta a cambios en señales ambientales^2,3. Una comparación de la expresión relativa de largo y corto de empalme variantes de NAK1 muestra un doble aumento de mRNA NAK1 largo baja salinidad en relación con el NAK corto (figura 5A). Así, los datos indican que empalmar alternativo hace que la forma larga predominante bajo condiciones de baja salinidad. En el caso de aquaporins, es evidente que los dos paralogs transportar agua AQP1 y AQP2 Mostrar expresión diferencial (figura 5B). En particular, en el tejido del manto, es evidente que la AQP1 es substancialmente regula a salinidades más bajas, que no se ve de AQP2. En cambio, AQP2 muestra una expresión ligeramente mayor en salinidades más bajas, pero en el soma. Estos resultados proporcionan una base para las investigaciones de los roles funcionales de los diferentes transportadores de iones B. improvisus y aquaporins en osmoregulación de Percebe.

Figura 1 : Resumen de todo el procedimiento de cultivo, la extracción de RNA para estudios de expresión génica en los adultos. Para iniciar una nueva cultura, los paneles están Unidos a un marco y desplegados en el mar a 1-3 m de profundidad. Después de varias semanas, los paneles con adultos/juveniles se colocan verticalmente en racks en las bandejas en el laboratorio. Cada bandeja tiene cerca de 40 paneles con adultos. Con aproximadamente 100 adultos por grupo, en total ≈ 4.000 individuos adultos son cultivados por bandeja. Los percebes adultos son alimentados con Artemia y pueden mantenerse año-alrededor de. Las larvas Nauplio se recogen varias veces a la semana de la bandejas a través de una filtración a través de un tamiz. Los nauplios recolectados son transferidos a cubos a 26 ° C en un baño de agua y alimentados con microalgas. Nauplios se crían hasta que muda en no alimentación cyprids, que se recogen por filtración. Nuevos paneles se pueden establecer en el laboratorio por el asentamiento de cyprids en los paneles, o bien para proporcionar nuevos paneles para el año-alrededor de cultura o que se utilizarán para montajes experimentales específicos con condiciones externas alteradas. RNA se extrae entonces de juveniles/adultos al final del experimento o en puntos de tiempo específicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Imágenes de algunos pasos importantes en el procedimiento de cultivo. (A) esta imagen muestra los marcos con paneles para recoger nuevas poblaciones del campo. (B) esta imagen muestra los paneles con percebes adultos de B. improvisus en estantes que se colocan en bandejas. Los paneles se colocan unos 2 cm de separación. (C) esta imagen muestra las bandejas con el percebe paneles y el tanque de alimentación a la izquierda. De cada bandeja, hay una toma donde se colocan los tamices para la recogida de larvas Nauplio. (D) esta imagen muestra que la producción de Artemia de la alimentación para los percebes adultos. (E) esta imagen muestra la crianza de nauplios en cubos colocados en un baño de agua a 26 ° C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Descripción de los pasos de disección inicial de percebes adultos: quitar el cuerpo de su caparazón. (A) agarre una de las placas operculares insertando fórceps suavemente a través de la abertura. Tire suavemente para eliminar la placa y exponer el animal. (B) Tire del animal por el acaparamiento de la parte de soma justo debajo de los cirros. (C) este panel muestra la anatomía general de percebes de la bellota. El manto y potencialmente fertilizado los huevos (en el ovario) permanecen en la cavidad de la concha cuando el cuerpo se saca. Una nota sobre la anatomía del Percebe (para una cuenta más detallada, véase Anderson)⁹: las placas de pared de un Percebe pendiente hacia adentro, y juntos, forman un cono de volcán-como. Una abertura, la abertura, está cubierta por las dos placas operculares, que forman una puerta, u opérculo para cerrar la abertura. Percebes de bellota tienen generalmente una placa basal calcárea que se pega firmemente al substrato; sin embargo, algunas especies de percebes carecen de esta placa calcárea (p. ej., S. balanoides). Percebes segregan exoesqueleto de manto oscuro pigmentado (el caparazón). La superficie externa del manto de doble capa es calcificada para ser rígido, mientras que la superficie interna del manto no está calcificada y por lo tanto es flexible. Dentro de la abertura, los cirros están presentes en una posición retraída. Estos son los apéndices torácicos que percebes utilizan para la alimentación de la suspensión. Los ovarios se encuentran cerca de la base de los balanos, mientras que los testículos se encuentran en el soma. Esta figura ha sido adoptada de Panova et al. ²¹ y ha sido publicado con el permiso de Springer. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 : Determinación de la integridad del rRNA por electroforesis capilar. RNA fue preparado por dos métodos diferentes de homogeneización: sonicación (A) y (B) granos de cerámica. La unidad en el eje y, FU, soportes para unidades de fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5 : Expresión génica resultados de dos estudios diferentes de genes importantes para la osmorregulación en B. improvisus. (A) este panel muestra la expresión diferencial según lo medido por qPCR de variantes de empalme de la Na⁺k⁺ ATPasa NAK1 en respuesta a diferentes salinidades y pCO₂ niveles³. En el tratamiento de baja salinidad, aumenta la expresión de la isoforma larga (NAK1-L) en relación con el corto (ANOVA, P < 0.001). (B) este panel muestra la expresión de aquaporins en adultos de B. improvisus durante su exposición a diferentes salinidades². qPCR fue utilizado para determinar los niveles de expresión de Acuaporina en relación con la actina. Individuos adultos se incubaron en 3 diferentes salinidades (3, 20 y 33 PSU) durante 14 días. Para la preparación de RNA, el soma, cirros y manto de los adultos fueron separados. En ambas figuras, barras de error indican la desviación estándar. El ** y *** indican el nivel de significancia (ANOVA), 0.01 y 0.001, respectivamente. Estas cifras se han modificado de Lind et al. ^{2 , 3}. ambas figuras se publican con permiso de PLoS ONE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Fase de establecimiento	Cantidad total de RNA (ng)
Natación libre	512
Exploración: Búsqueda cercana	518
Cyprid adjunto	550
Nueva metamorfosis juvenil	832

Tabla 1: rendimientos de RNA. Esta tabla muestra la cantidad de RNA extraída con un kit de preparación de RNA de las piscinas de 20 individuos cyprid recogidos en diferentes etapas durante el proceso de liquidación.

Discusión

La cultura de Percebe en el laboratorio de investigación marina de Tjärnö (Suecia) ha estado funcionando más de 20 años y se ha utilizado para los estudios en muchas áreas de investigación diferentes. Se han publicado más de 30 trabajos científicos que han utilizado el sistema de cultivo durante los últimos años, incluyendo estudios de antifouling^13,22, hidrodinámica²³, ecología química²⁴,^{16 el cambio climático} ,⁵de la biología evolutiva y biología molecular².

Para evitar la selección de ciertos individuos que están más adaptados al ambiente de laboratorio (individuos que podrían no ser representativas de la población salvaje), se recomienda recoger una reproductores nuevos en el campo cada año. Además, también es buena práctica para rejuvenecer la cultura anualmente, ya que hay aproximadamente 50-80% de la mortalidad en adultos durante un año normal. Sin embargo, si el objetivo es producir líneas puras o para estudios de evolución experimental, las familias sólo criados en laboratorio son para usarse.

Un buen momento para recoger B. improvisus en paneles en el laboratorio de investigación marina de Tjärnö es de junio a agosto porque en ese momento, hay un buen suministro de larvas cyprid en el mar. Revise los paneles semanal para ver cuando comienza el asentamiento de percebe y eliminar manualmente otros establecieron especies B. improvisus (por ejemplo, mejillones, tunicados, Briozoos, hidrozoos, nemertinos/tubeworms y otras especies de balanos) de la paneles (por ejemplo, con un cepillo de dientes). Alrededor de Tjärnö, hay tres especies de aguas someras Percebe presente (B. improvisus Semibalanus balanoidesy Balanus crenatus). Sin embargo, B. improvisus es el dominante sobresalía de superficies lisas durante julio – agosto. Balanoides S. tiene su período de asentamiento durante la primavera y prefiere principalmente substratos naturales (p. ej., piedras). B. crenatus puede ocurrir en los números bajos en los paneles durante el verano.

También es posible iniciar nuevas generaciones Percebe adulto de culto cyprids, que sería esencial si se han establecido ciertos linajes con características específicas, o en estudios de evolución experimental. La forma más conveniente para iniciar nuevas generaciones de adultos es colocar cyprids en los paneles termoplásticos en el laboratorio. Estos paneles con cyprids recién colocado también podrían utilizarse en tratamientos experimentales o para la exposición en el campo. En casos de emergencia, se pueden utilizar también adultos en desde un sitio cercano (por ejemplo, Idefjorden en el caso del laboratorio de investigación marina de Tjärnö) donde es común B. improvisus . Estos adultos ya establecidos son tratados de la misma manera como los adultos en los paneles, por lo tanto se colocan en bandejas y alimentados a través de la fluir-por sistema. Células de flujo pueden utilizarse también para establecer grupos especiales con percebes²⁵. Estas son cámaras de flujo con red a los lados en que el cyprids no conformarse, con paneles como la superficie del establecimiento solamente para las larvas del plancton.

Hay varios pasos que son fundamentales para la creación de una cultura de Percebe funcionamiento a largo plazo incluyendo todas las etapas de la vida. Los métodos utilizados para cultivo B. improvisus son probablemente, en gran medida, también aplicable a otros invertebrados marinos con larvas planctotróficas nadan libremente. Procedimientos de cultivo para algunas especies ya están bien describen (por ejemplo, mejillones azules y diferentes especies de ostras)²⁶, mientras que para otros invertebrados marinos, son sólo algunos ejemplos de cultivos a largo plazo que abarca toda la vida ciclo. Uno de los primeros intentos exitosos de percebes de la cultura (B. Anfitrite) fue realizado por Rittschof et al. ¹⁵. recursos financieros y personales a largo plazo deben estar en lugar antes de considerar establecer un Percebe facilidad de cultivo. El mantenimiento de este tipo de año-alrededor de Percebe cultura requiere al menos una persona trabajando medio tiempo. Puede haber cierto potencial para la futura automatización de algunos pasos en la cadena de producción, principalmente el cultivo de microalgas²⁷. Además, para tener éxito, es esencial tener acceso a grandes cantidades de agua de mar de alta calidad. El cultivo de microalgas, Artemia y percebes no implica ningún procedimiento de seguridad particular. Sin embargo, las pruebas de algunas sustancias antifouling o productos químicos tóxicos pueden necesitar precauciones especiales.

Los paneles se verificaron varias veces a la semana para contaminaciones. El agua de mar en la cultura fue bombeada desde una profundidad de 40 m en el fiordo de Koster fuera del laboratorio de investigación marina de Tjärnö y pasó a través de dos filtros de arena antes de entrar en el sistema de agua de laboratorio. Si ningún filtro del agua se ha hecho, sería mucho más contaminación en la cultura. Es esencial para limpiar regularmente los paneles en la cultura de detritos y otros invertebrados (e.g., Estolón-edificio hidroides y nemertinos depredadores) que entran en el sistema a través del suministro de agua de mar en el campo. Por ejemplo, si no las larvas se producción a pesar del hecho de que la cultura ha sido bien alimentado y parece estar en buenas condiciones, el problema podría ser la presencia de nemertinos que aparecen inhibir el acoplamiento. Naturalmente, muchos de los organismos contaminantes en el cultivo en el laboratorio de investigación marina de Tjärnö eran específicas para la costa oeste sueca, y otros tipos de contaminación de organismos a ser frecuente ya más de un desafío en otras áreas geográficas. En la costa oeste de Suecia, es raro encontrar contaminación por otras especies de percebes en los paneles. En ocasiones, el establecimiento de S. balanoides se ha encontrado, pero este es un problema muy marginal (a lo sumo, un S. balanoides contaminante para 10.000 B. improvisus muestras). La falta de contaminación de especies fue probablemente dependiente del régimen para establecer nuevas culturas durante el verano, cuando los larvaefrom B. improvisus eran altamente dominante. Además, también hubo un claro enriquecimiento de B. improvisus en los paneles ya que esta especie es selectiva para las superficies lisas¹³.

Es esencial eliminar percebes adultos muertos. Si se dejan las cáscaras vacías de los paneles, pueden llegar a ser un refugio para nauplios de Artemia , así como para diversas especies contaminantes. Además, se ha notado que personas muertas influyen en el bienestar de los vecinos particulares, probablemente con la liberación de compuestos tóxicos durante la descomposición. Una consecuencia adicional de la mortalidad de adultos es que algunos individuos se dejará solo y muy lejos de cualquier otro adulto para permitir el apareamiento (aunque percebes tienen el pene más largo en el mundo animal en relación con su tamaño)²⁸. Estos individuos sobrevivirán pero son improductivos para las larvas. Sin embargo, estos individuos adultos solitarios pueden eliminarse suavemente sin dañar la placa base y colocados horizontalmente cerca de otros para permitir el apareamiento. Percebes también pueden ser acoplados mediante la colocación de paneles con un adulto en cada uno pero lo suficientemente cerca para que pueda ocurrir el intercambio de ideas. De esta manera, líneas genéticas pueden ser producido¹⁴.

Es esencial para producir un alimento de alta calidad y para alimentar las culturas casi todos los días. Incluso unos pocos días sin alimento pueden ocasionar una disminución liberación de larvas. Pruebas anteriores de la composición de la dieta han demostrado que las diatomeas son esenciales para el crecimiento y supervivencia de nauplios de Percebe. Varias especies de diatomeas parecen adecuadas como alimentación, aunque las células solitarias o pequeños (menos de 10 μm de diámetro) pueden ser necesarias para la ingestión de los nauplios. La especie S. marinoi, simplex de C.y T. pseudonana ha demostrado ser adecuada alimentación nauplios B. improvisus , así como fácil de cultivar. Además, la calidad del alimento es generalmente más alta para el exponencial crecimiento de algas. También se ha divulgado que las diatomeas son esenciales para el establecimiento de culturas productivas de amphitrite B.¹⁵. Una teoría de la importancia de las diatomeas es que tienen un perfil único de ácidos grasos y son especialmente ricos en ácidos grasos altamente poliinsaturados 20:5²⁹. Se ha demostrado ciertos ácidos grasos son importantes para el buen desarrollo de las larvas de ostra³⁰.

Con los años, no han sido incidencias de enfermedades perjudiciales en el cultivo de Percebe. En muchos acuaculturas comerciales de invertebrados, como las ostras y los mejillones, las enfermedades son bastante comunes y pueden ser muy perjudiciales. Efectos perjudiciales de los virus también se han divulgado de las poblaciones silvestres. La ostra nativa en Francia fue reemplazada por la portuguesa ostra Crassostrea angulata en 1925, pero esta especie fue aniquilada por un iridovirus alrededor 1970³¹. Más recientemente, ha habido eventos de mortalidad masiva en el ostión Crassostrea gigas en las culturas en todo el mundo, que parece estar asociado con el herpesvirus herpesvirus 1³². No hay informes sobre agentes patógenos, bacterias o virus en los percebes se han publicado hasta ahora. Sin embargo, en el curso-proyecto del genoma de B. improvisus, se encontraron secuencias de virus (Alm Rosenblad et al., datos no publicados), pero con ningún vínculo aparente a los síntomas de enfermedades. Mezclas de antibióticos se han aplicado anteriormente a las culturas para minimizar el riesgo de infecciones bacterianas; sin embargo, este procedimiento está actualmente abandonado y hasta la fecha, esto no ha causado problemas de contaminación.

Si el agua de mar es calentado (como se describe anteriormente), un sobrecalentamiento puede ser el riesgo más serio en la línea de producción de cultura. Por supuesto, es difícil proteger contra el sobrecalentamiento, aunque los sensores y sistemas de alerta adecuados pueden ser utilizado (por ejemplo, envío de correo electrónico o mensajes de texto a personas responsables). Incidencias de este tipo en el pasado han provocado la matanza substancial de los adultos en la cultura. Esto puede, por supuesto, ser devastador y arruinar las inversiones a largo plazo de tiempo y dinero. En particular, esto sería catastrófico si se han establecido líneas genéticas puras. Para asegurar la longevidad de dichas líneas y seguro de pérdida accidental, sería conveniente desarrollar una metodología de criopreservación para percebes. Se ha reportado que las larvas de ostión pueden ser congeladas abajo y revividas con éxito parcial³³. Cryobanking también ha sido una valiosa herramienta para preservar los recursos genéticos de una amplia gama de especies³⁴. Incluso nauplios de B. Anfitrite se divulgan para sobrevivir congelación³⁵, y se encontró que 20% de los individuos abajo congelado transformado con éxito en cyprids³⁶. Aplicación de congelación para la sostenibilidad a largo plazo de las culturas hasta ahora no ha sido aprobada, pero de hecho esto sería necesario para el mantenimiento de las líneas seleccionadas; Esto sería un paso esencial para establecer firmemente B. improvisus en una potente Marina modelsystem.

Aquí, se presentó un protocolo para la disección de varios tejidos de adultos de B. improvisus (es decir, cirros, soma y la chimenea). Sin embargo, debe destacarse que también se pueden extraer otros tejidos. Por ejemplo, el tejido blando entre el manto exterior e interior de la especie base membranosa Tetraclita japonica formosana ha sido cuidadosamente aislado y utilizados para extracción de RNA y RNA-seq análisis del gene expresión³⁷. El protocolo de extracción optimizado contorno descrito aquí proporciona cantidades suficientes de ARN de alta calidad para la secuenciación de una cantidad mínima de material de partida. En primer lugar, la colección de larvas individuales directamente en los tubos de homogeneización minimiza cualquier pérdida durante el traslado de un tubo a otro. Además, entre los diferentes métodos de prueba, la homogeneización con granos de cerámica demostró para ser la producción más eficiente en términos de RNA e integridad, en comparación con homogeneización de sonicación o Maja. Cuando la planificación de la expresión génica o experimentos de genómica, uno tiene que tener en cuenta el reto de la alta variación genética en percebes, por lo menos para B. improvisus. Percebe tiene una diversidad genética en el rango de 3 – 5%, incluso en la codificación de las regiones (Alm Rosenblad et al., datos no publicados). Esto, por supuesto, pone demandas específicas en el diseño de cebadores para el análisis de qPCR, donde más conservan las regiones deben ser identificadas y utiliza como plantillas para imprimaciones para conseguir expresión consistente resultados betweenbatches. Regiones conservadas de genes de la blanco, como aquaporins y Na + / K + ATPasas, pueden identificarse mediante el estudio de la variabilidad de la secuencia de estos genes en el RNA-seq datos obtenidos de poblaciones de cyprids que contiene cientos de individuos. Para un análisis de genoma, ADN a ser muestreado. Sin embargo, obtener ADN de alta calidad de B. improvisus puede ser un desafío²¹.

En conclusión, la cultura de Percebe establecidos ha demostrado para ser instrumental en diferentes tipos de estudios experimentales. En particular, el todo-año-alrededor de la producción larvaria nos permite realizar experimentos sin estar limitado al período natural de desove (para B. improvisus, esto es durante el verano). Las larvas obtenidas se pueden utilizar para realizar una amplia serie de estudios experimentales, incluyendo el establecimiento de ensayos, ensayos de comportamiento, estudios de expresión de genes específicos, así como estudios de genoma transcriptoma.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plexiglas (poly-methyl methacrylate) panels	Plastic produkter, Bromma, Sweden		transparent glas
1.5 L PET bottle
Artemia	INVE Aquaculture, Belgium		We have tested different companies; this is really the best one
Skeletonema marinoi (CCAP strain 1077/5)	CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland	strain 1077/5
Chaetoceros simplex var. gracilis (CCAP strain 1085/3)	CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland	strain 1085/3
Millipore cartridge filter system	Millipore
cartridge with a nominal pore size of 0.2 µm	Millipore	cartridge CWSS01S03	High capacity for large volumes
polycarbonate bottle	Nalgene		autoclavable
RNA later	Qiagen	76106	Fixation solution to preserve RNA
TURBO DNA-free Kit	Invitrogen/Thermofisher Scientific	AM1907	DNAse kit to remove DNA from prepared RNA
iScript cDNA Synthesis Kit	Biorad	1708890	cDNA synthesis kit
SYBR Green supermix	Biorad	1708880	Dye for QPCR
RNeasy minikit	Qiagen	74104	RNA extraction of adults or many cyprids
Soft tissue homogenising CK 14, 2 ml tubes	Precellys	KT03961-1-003.2	Ceramic beads for homogenisation
RNeasy micro kit	Qiagen	74004	RNA extraction of few cyprids