Sensille unique Recordings pour Locust Palp sensilles basiconiques

Résumé

Cet article décrit un protocole détaillé et très efficace pour les enregistrements de sensille unique de la basiconica de sensilles sur les palpes des insectes pièces buccales.

Résumé

Les palpes de pièces buccales de Criquet pèlerin sont considérés comme des organes gustatifs classiques qui jouent un rôle important dans le choix des aliments d’un criquet, en particulier pour la détection des signaux chimiques non volatile par l’intermédiaire de sensilles chétiformes (précédemment nommé sensilles terminales (ou sensilles huppés). Il y a maintenant de plus en plus évident que ces palpes ont également une fonction olfactive. Un récepteur odorant (LmigOR2) et une protéine de liaison odorant (LmigOBP1) ont été localisés dans les neurones et les cellules accessoires, respectivement, dans le basiconica de sensilles des palpes. Sensille unique enregistrement (SSR) est utilisé pour enregistrer les réponses des neurones de récepteur odorant, qui est une méthode efficace de dépistage actifs ligands sur les récepteurs spécifiques odorant. SSR est utilisé dans les études fonctionnelles des récepteurs odorants dans des sensilles palpe. La structure de la basiconica de sensilles située sur le dôme des palpes diffère quelque peu de la structure de celles sur les antennes. Donc, lorsque vous effectuez une SSR provoquée par les substances odorantes, quelques conseils spécifiques peut être utile pour l’obtention de résultats optimaux. Dans cet article, un protocole détaillé et très efficace pour un SSR de palp insectes sensilles basiconiques est introduit.

Introduction

Animaux ont développé une gamme d’organes chemosensoriels qui détectent les signaux chimiques exogènes. Chez les insectes, les plus importants organes chemosensoriels sont les antennes et les palpes. Sur ces organes, plusieurs types de poils chemosensoriels, appelés chemosensoriels sensilles, sont innervés par les neurones chemosensoriels (SCSN) dans les poils. Notes de sensilles chemosensoriels reconnaissent les signaux chimiques spécifiques par le biais de transduction d’un signal de stimulus chimiques à des potentiels électriques qui sont ensuite transférées jusqu’au système nerveux central^1,,^2,3 .

SCSN exprimant divers récepteurs chemosensoriels [p. ex., récepteurs odorants (ORs)], ionotropiques récepteurs (IRs) et les récepteurs gustatifs (GRs) sur leurs membranes, qui codent des signaux chimiques exogènes liés à différents types de chémosensation ^4,5,6. La caractérisation des notes de stratégie est essentielle pour l’élucidation des mécanismes moléculaires et cellulaires d’insecte chemoreception. Maintenant seule sensille enregistrement (SSR) est une technique largement utilisée pour la caractérisation d’insecte notes dans les sensilles de nombreux insectes, y compris les mouches⁷,⁸de papillons, coléoptères⁹, pucerons,¹⁰,¹¹de criquets, et ¹²de fourmis. Cependant, peu d’études ont appliqué un SSR à insectes palpes^{13,14,15,16,17}, parce que les structures particulières de leurs sensilles font une enregistrement électrophysiologique difficile¹⁸.

Des essaims de criquets pèlerins (Orthoptera) causent souvent des dommages aux cultures grave et une perte économique¹⁹. Les palpes sont censées jouer un rôle important dans le choix des aliments des criquets^{20,21,22,23,24}. Deux types de sensilles chemosensoriels sont étudiés par un microscope électronique à balayage (SEM). En général, 350 sensilles chétiformes et 7-8 sensilles basiconiques sont observées sur chaque dôme du criquet pèlerin palpes¹⁸. Sensilles chétiformes sont des sensilles gustatives qui détectent les signaux chimiques non volatile, tandis que sensilles basiconiques ont une fonction olfactive, détection de signaux chimiques volatils.

Palpes de Criquet pèlerin, les diamètres des sockets cheveux des sensilles basiconiques (env. 12 µm), sont beaucoup plus élevées que celles des sensilles chétiformes (ca. 8 µm)^18,25. La paroi cuticulaire de le basiconica de sensilles sur les palpes est beaucoup plus épaisse que celle des sensilles¹⁸. En outre, le dôme de la palpe a fluide contenu dans une cuticule très flexible. Ces caractéristiques font qu’une pénétration avec une microélectrode et une acquisition de bons signaux électrophysiologiques est plus difficile que pour les sensilles. Dans cet article, un protocole SSR détaillé et très efficace pour locust palp sensilles basiconiques est présente avec une vidéo.

Protocole

1. préparation des Instruments et des insectes

1. Préparation de tungstène électrodes et des stimuli solutions
   1. Fixer un nouveau fil de tungstène (diamètre de 0,125 mm, longueur 75 mm) dans un micromanipulateur et aiguiser dans une solution de nitrite (NaNO₂) sodium 10 % (p/v) dans une seringue à 10 V fourni par une source d’alimentation pendant environ 1 min avec un stéréomicroscope (grossissement de 40 X).
   2. Tremper le fil de tungstène affûté à plusieurs reprises dans la solution₂ NaNO de 10 %, environ 4 mm 5 V < 1 min (Figure 1 a).
   3. Examiner le diamètre de la pointe de tungstène affûté fréquemment sous le stéréomicroscope jusqu'à ce qu’il fait assez beau pour pénètrent la cuticule d’une sensille olfactive palpe du criquet pèlerin (Figure 1 b).
   4. Préparer les solutions de stimulation. Diluer chacun de la substance chimique stimulus dans l’huile minérale. Diluer 1-nonanol et acide nonanoïque à des dilutions de 10 %. Diluer le E-2-hexénal et hexanal à 10^-2, 10^-3, 10^-4et 10^-5.
   5. Préparer les tubes transportant les stimuli de Pasteur : insérer des bandes de papier filtre (longueur de 2 cm, largeur de 0,5 cm) dans les tubes de Pasteur, ajouter les solutions de stimulation dilué (chaque 10 µl) pour les bandes de papier filtre et puis branchez les tubes de Pasteur avec pointes de pipette (1 ml).
2. Préparer l’insecte
   1. Arrière criquets (Locusta migratoria) avec des plantules de blé frais dans des conditions surpeuplées à une humidité relative de 60 %, une température de 28-30 ° C et une photopériode de 18:6 h (lumière : obscurité). Choisissez 1 à 3-jour-âgé de 5^ème stade larvaire des larves de Criquet pèlerin et retirer les antennes avec des ciseaux fins pour éviter toute interférence lors de l’enregistrement.
3. Préparer le titulaire du palpe maxillaire locust
   1. Utiliser une lame de verre (25 mm x 75 mm) comme la base du palpe maxillaire porte (MPH). Attacher un morceau de plastique (1 mm de hauteur, 10 mm de largeur et 35 mm de longueur) à un coin de la lame de verre avec un ruban adhésif double-face et enfin fixer une lamelle couvre-objet (18 x 18 mm) sur le dessus de la pièce en plastique avec adhésif double-face. Placer un petit morceau de ruban de caoutchouc rouge sur la lamelle couvre-objet comme une couche anti-dérapante. La pièce en plastique et le couvercle en verre constituent la plateforme pour le palp locust. La hauteur de la plate-forme est d’environ 1,5 mm.
   2. Installer un fil de tungstène (de 0,125 mm de diamètre, longueur de 36 mm) à une distance de 1,5 mm parallèle à l’intérieur bord du quai. Fixer les deux extrémités du fil sur la plateforme avec un ruban adhésif double-face.

2. préparation des palpes maxillaires Locust

1. Couper un tube à centrifuger (1,5 ml) verticalement en deux et couper le bas. Placer le pèlerin dans le tube de préparation. Quitter la région ventrale et la tête du pèlerin exposé. Fixer l’ensemble à la lame de verre avec un ruban adhésif double-face (Figure 2 a).
2. Tirez le palpe maxillaire droite sur la plate-forme.
3. Mettre le fil de tungstène au quatrième segment de la palpe. Placez mastic adhésif de chaque côté du fil de tungstène, environ 2 mm de la palpe maxillaire (Fig. 2 a et 2 b).

3. seul sensille Recordings

1. Placer la préparation du palpe maxillaire locust sous un microscope à un faible grossissement (X 100). Ajustez la position de la préparation jusqu'à ce que le palpe est perpendiculaire à l’électrode d’enregistrement (Figure 3 a).
2. Insérer l’électrode de référence (électrode de tungstène) dans le œil de Criquet pèlerin à l’aide d’un micromanipulateur. Déplacer l’électrode d’enregistrement (électrode de tungstène) proche du palpe maxillaire avec le micromanipulateur (Figure 3 b et 3C).
3. Ajuster le dispositif d’administration odeur à environ 1 cm de la palpe maxillaire (Figure 3 b).
4. Ouvrez le logiciel d’enregistrement Auto Spike 32. Définissez les paramètres d’enregistrement comme suit : l’échelle de l’enregistrement sur 500 µV ; le niveau de coupure haute du filtre sur 300 Hz, le faible niveau de coupure sur 200 Hz ; et le pretrigger sur 10 s.
5. Connecter l’électrode d’enregistrement pour un 10 x amplificateur AC/DC universel.
6. Passer au microscope à un fort grossissement (X 500). Insérez l’électrode d’enregistrement dans la base d’une sensille basiconiques sur le palpe maxillaire et réglez délicatement l’électrode d’enregistrement afin d’obtenir de bonnes pointes spontanées (Figure 3D).
7. Ouvrir le contrôleur de stimulation afin d’offrir un flux d’air continu à 20 ml/s. régler l’heure de la stimulation à 1 s. signaux d’enregistrement pour 10 s, à partir de 10 s avant le début de l’impulsion de stimulus.
8. Un amplificateur d’AC/DC universel 10 x permet d’amplifier les signaux. Nourrir les signaux dans les 4 IDAC. Analyser les signaux avec le logiciel Auto Spike 32. Des signaux AC sont passe-bande filtré entre 200 à 300 Hz. utilisation Auto Spike 32 pour distinguer les amplitudes de crête à creux de bruits. Calculer les réponses des neurones comme l’augmentation des fréquences de potentiel d’action (pointes par seconde) sur la fréquence spontanée. Effectuer une analyse statistique en utilisant GraphPad Prism 7.

Résultats

Deux sous-types de sensilles (pb1 et pb2) sur le palpe maxillaire de Criquet pèlerin sont identifiées basées sur la dynamique de réponse différente à des substances chimiques odorantes (10 % 1-nonanol et 10 % d’acide nonanoïque). Les neurones en pb1 produisent significativement plus de pics pour 1-nonanol qu’à l’acide nonanoïque tandis que les neurones en pb2 sont significativement que moins activés par 1-nonanol par rapport à l’acide nonanoïque (F...

Discussion

Insectes s’appuient sur les palpes pour détecter les odeurs de nourriture, et leurs palpes sont censées jouer un rôle important dans la spéciation^13,27. Les palpes sont de simples organes olfactifs et suscitent un intérêt croissant comme un modèle attrayant pour l’exploration de le neuromoléculaire réseaux sous-jacents chémosensation²⁸.

Insecte labellar et palpe SSRs ont été réalisées avec succ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tungsten wire	ADVENT	W559504	Used for making the electrode and fixing the palp
NaNO2	Sigma-aldrich	563218-25G	Used for sharpening the tungsten wire
AC Power Supply	Syntech	A2-70	Providing the voltage in sharpening the tungsten wire
Stereoscope	Motic	SMZ-163	Used for observing the sharpening of tungsten wire
Microscope	Olympus	W-51	Used for observing the sensilla on locust maxillary palp
Intelligent Data Acquisition Controller	Syntech	IDAC-4	Real-time on screen display of all signals before and during recording
Stimulus controller	Syntech	CS-55	Used for controlling the stimulus application
Electronic micromanipulator	C.M.D.T	CFT-8301D	Used for minor movement of the recording electrode
Micromanipulator	Narishige	MN-151	Used for minor movement of the reference electrode
Speaker	EDIFIER	R101T06	Connected with IDAC-4 and providing sound for the signal
Magnetic base	PDOK	PD-101	Used to hold the electrode, and stimulus delivery tube
Vibration Isolation Table	TianHe	HAP-100-1208	Used for isolating the vibration from the equipment
Glass slide	CITOGLAS	ZBP-407	Used for making the base for the MPH
Blu-tack	Bostik	Blu-tack-45g	Fixing the tungsten wire
Pasteur tube	YARE	WITEG	Placing the filter paper containing stimuli solutions