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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

L'identificazione delle interazioni fisiche tra geni ed elementi regolatori è impegnativo ma è stata facilitata dai metodi di cattura conformazione del cromosoma. Questa modifica del protocollo 4C-seq mitiga bias PCR riducendo al minimo eccessiva amplificazione dei modelli di PCR e massimizza la mappability di letture incorporando un passo di digest di aggiunta degli enzimi di limitazione.

Abstract

L'identificazione di elementi regolatori per un gene target dato pone una sfida tecnica notevole a causa della variabilità nelle misure di posizionamento e di effetto di elementi regolatori ad un gene dell'obiettivo. Alcuni progressi compiuti con il pronostico di bioinformatica dell'esistenza e la funzione delle modificazioni epigenetiche prossimale associata con l'espressione di gene attivato utilizzando siti di legame del fattore di trascrizione conservata. Gli studi di cattura di conformazione cromatinica hanno rivoluzionato la nostra capacità di individuazione dei contatti fisici della cromatina tra sequenze e anche all'interno di un intero genoma. Acquisizione di conformazione cromatinica circolare accoppiato con sequenziamento di nuova generazione (4C-seq), in particolare, è progettato per scoprire tutte le possibili interazioni fisiche della cromatina per una data sequenza di interesse (Belvedere), ad esempio un gene bersaglio o una regolamentazione Enhancer. Attuali strategie di 4C-seq direttamente sequenza all'interno il punto di vista ma richiedono numerose e punti di vista diversi da sequenziare contemporaneamente per evitare le sfide tecniche della divisa base chiamata (imaging) con successiva generazione di piattaforme di sequenziamento. Questo volume di esperimenti potrebbe non essere pratico per molti laboratori. Qui, segnaliamo un metodo modificato del protocollo di 4C-seq che incorpora sia un digest di ulteriori degli enzimi di limitazione e passaggi di amplificazione qPCR-basato che sono progettati per facilitare una maggiore acquisizione di sequenza diverse letture e ridurre il potenziale per Bias di PCR, rispettivamente. Il nostro metodo modificato di 4C è favorevole al laboratorio di biologia molecolare standard per la valutazione della architettura della cromatina.

Introduzione

L'identificazione di elementi regolatori per l'espressione genica è stata facilitata dal progetto Enciclopedia di DNA Elements (ENCODE) che globalmente annotati attività funzionale per l'80% del genoma umano1,2. L'identificazione dei siti per in vivo associazione di fattore di trascrizione, ipersensibilità di DNaseI e istone epigenetici e modifiche di metilazione del DNA in tipi cellulari individuali ha spianato la strada per l'analisi funzionale del candidato normativo elementi di espressione genica. Armati di questi risultati, dobbiamo affrontare la sfida di determinare l'interconnessione funzionale tra elementi regolatori e geni. In particolare, qual è la relazione tra un gene target dato e sua enhancer(s)? Il metodo di cattura (3C) conformazione cromatinica si rivolge direttamente questa domanda di identificazione fisiche e probabile che interazioni funzionali, tra una regione di interesse e candidato interagendo sequenze attraverso eventi acquisiti nella cromatina fisso3 . Come la nostra comprensione delle interazioni della cromatina è aumentato, tuttavia, è chiaro che l'indagine di loci candidati preselezionati è insufficiente per fornire una comprensione completa delle interazioni gene-enhancer. Ad esempio, codifica usato il metodo di copia carbone (5C) cattura conformazione cromosomica ad alta produttività per esaminare una piccola porzione del genoma umano (1%, pilota set di 44 loci) e segnalato complesso interconnettività dei loci. Geni ed esaltatori di sapidità con interazioni identificate una media di 2 – 4 diversi partner interagenti, molti dei quali erano centinaia di kilobasi distanza di spazio lineare4. Inoltre, Li et al. usato analisi delle interazioni della cromatina di Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) per analizzare le interazioni promotore intero genoma e trovato che il 65% dei siti di RNA polimerasi II legame erano coinvolti nelle interazioni della cromatina. Alcune di queste interazioni è derivato in complessi di grandi dimensioni, del multi-gene spanning centinaia di kilobasi di distanza genomica contenente, in media, 8-9 geni ogni5. Insieme, questi risultati evidenziano la necessità di imparziale intero genoma metodi per interrogare interazioni della cromatina. Alcuni di questi metodi sono esaminati a Schmitt et al. 6.

Metodi più recenti per gli studi di cattura di conformazione cromatinica accoppiato con generazione sequenziamento (Hi-C e 4C-seq) attiva la scoperta di sequenze sconosciute che interagiscono con una regione di interesse6. Specificamente, cromosoma circolare conformazione cattura con sequenziamento di nuova generazione (4C-seq) è stata sviluppata per identificare loci interagendo con una sequenza di interesse in un modo imparziale7 mediante sequenziamento del DNA dalla cromatina catturata prossimale per la regione di interesse nello spazio 3D. Brevemente, la cromatina è fisso per preservare le interazioni proteina-DNA nativo, spaccati con un enzima di restrizione e successivamente legato in condizioni diluite per catturare biologicamente rilevanti "grovigli" di loci interagenti (Figura 1). I collegamenti trasversali sono invertiti per rimuovere la proteina, lasciando così il DNA disponibile per ulteriore scissione con un secondo enzima di restrizione. Una legatura finale genera cerchi più piccoli di loci interagenti. Primers per la sequenza di interesse vengono quindi utilizzati per generare una libreria amplificata di sequenze sconosciute dai frammenti circolare, seguite da sequenziamento di nuova generazione a valle.

Il protocollo presentato qui, che si concentra sulla preparazione del campione, fa due principali alterazioni al esistente 4C-seq metodi8,9,10,11,12. In primo luogo, utilizza un metodo basato su qPCR empiricamente determinare il numero ottimale di amplificazione cicli per passaggi di preparazione libreria 4C-seq e così riduce il potenziale per la parzialità PCR derivanti dalla eccessiva amplificazione delle librerie. In secondo luogo, utilizza un'ulteriore restrizione del digest passo nel tentativo di ridurre l'uniformità delle sequenze di note "esca" che ostacola accurata base chiamata dallo strumento di sequenziamento e, quindi, massimizza la sequenza unica, ben informativa in ogni lettura. Altri protocolli di aggirano questo problema mettendo in comune molte librerie di 4C-seq8 (12-15) con esche diverse sequenze e/o siti di restrizione, un volume di esperimenti che potrebbero non essere realizzabili da altri laboratori. Le modifiche qui presentate consentono un piccolo numero di esperimenti, campioni e/o replica per essere indicizzati e raggruppati in una sola corsia.

Protocollo

1. selezione degli enzimi di limitazione

  1. Identificare una regione di interesse (ad es., promotore del gene, polimorfismo a singolo nucleotide (SNP), enhancer) e ottenere la sequenza di DNA dai repository come centro nazionale per Biotechnology Information (NCBI).
  2. Identificare gli enzimi di limitazione del candidato (REs) per la prima digestione degli enzimi di restrizione (RE1) che non tagliare all'interno della sequenza di interesse, che producono l'estremità appiccicosa (termini di DNA con sporgenze) dopo RE digestione, e cui attività non sono inibiti da Metilazione di CpG.
    Nota: La risoluzione dei dati è determinata da RE1. Un enzima con una sequenza di riconoscimento di 6 coppie di basi (bp) produce, in media, circa 4 frammenti kilobasi (kb) di lunghezza, mentre produce un enzima con una sequenza di riconoscimento bp 4 frammenti circa 250 bp in lunghezza, consentendo più precisa identificazione di sequenze interagenti.
  3. Selezionare un RE1 da enzimi candidato identificati nel passaggio 1.2 che produce un "punto di vista" restrizione frammento almeno 500 bp lungo che include la regione di interesse o, in alternativa, una regione vicina.
    Nota: L'enzima selezionato deve essere suscettibile di primer design (vedi passo 2).
  4. Per la seconda digestione, identificare un enzima di restrizione (RE2) con una sequenza di riconoscimento bp 4 che produce estremità appiccicosa (termini di DNA con sporgenze) dopo RE digestione, la cui attività non è inibita da metilazione di CpG, e che taglia all'interno la restrizione frammento generato da RE1 a produrre un frammento di esca di 250 – 500 bp (Figura 1).
    Nota: L'enzima selezionato deve essere suscettibile di primer design (vedi passo 2).

2. progettazione e Test iniettori per la PCR inversa e l'efficienza di digestione qPCR

  1. Utilizzare uno strumento di disegno di primer come Primer3 (http://primer3.ut.ee) per disegnare primers inversa che sono dirette verso l'esterno verso le estremità del frammento esca (cioè., il primer 5' è una "retromarcia" primer, complementare al filo del positivo, mentre il primer 3' è una " Forward"primer, complementari al filamento negativo) e come vicino ai siti di restrizione possibile per ridurre al minimo l'amplificazione dell'esca non-informativo di sequenza e massimizzare l'efficienza PCR (Figura 2A).
    Nota: Gli iniettori dovrebbero essere previsto per avere minimo aspecifici amplificazione da DNA genomic da in silico pronostici PCR e non dovrebbero allineare altrove nel genoma tranne loro bersaglio designato con più di 16/18 identità9. Come schede di sequenziamento non sono incorporati negli iniettori PCR inversi, il sito di legame del primer è più flessibile rispetto a altri metodi di preparazione di 4C; primer deve temprare in modo ottimale nel raggio di 50 bp della fine del sito di restrizione corrispondente.
    1. Confermare la specificità degli iniettori di PCR inversi di amplificazione utilizzando il DNA genomico purificato (gDNA) come modello.
    2. Primer ottimale dovrebbe produrre alcuni prodotti quando si utilizza gDNA come un modello (vedi passo 11.2 per la descrizione dei prodotti attesi 4C). In caso di notevole amplificazione da gDNA, progettare nuovi primer. Se nessun set di primer accettabile è identificato, tornare al passaggio 1 e selezionare una nuova esca selezionando nuovi enzimi di restrizione.
  2. Disegnare primers qPCR per amplificare i frammenti 70 – 200 nucleotidi (nt) in lunghezza per monitorare l'efficienza di digestione di restrizione (Figura 2B).
    1. Progettare una coppia di primers per amplificare in ogni sito di restrizione (selezionata nel passaggio 1) che definiscono la sequenza di esca. Progettare il primer per entrambi RE1 (Vedi punto 6.5.6) e RE2 siti (Vedi punto 9.2).
    2. Progettazione di un set di primer che amplifica una regione non contenenti i siti per entrambi degli enzimi di limitazione come un controllo di normalizzazione (uncut DNA) per RE1 e RE2 (Vedi anche punto 6.5.6).

3. insieme di celle

  1. Utilizzando un metodo appropriato per la cultura dei tessuti o cellule, ottenere una sospensione unicellulare. Agglomerare le cellule per 5 min a 200 x g, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 500 µ l di tampone fosfato salino (PBS) per 107 cellule: 1x.

4. formaldeide cross-linking delle cellule per preservare la cromatina interazioni

  1. Per ogni 107 cellule, aggiungere 9,5 mL di 1% la microscopia elettronica (EM)-grado formaldeide (esente da metanolo) in PBS e incubare, mentre burattatura sull'attuatore (o simili), per 10 min a temperatura ambiente (RT, 18 – 22 ° C).
    Nota: Condizioni di fissazione potrebbero essere necessario essere ottimizzato per ogni tipo di cellula. Prima opera pubblicata in cellule di topo segnalato che tale fissazione ottima risultati in almeno il 40% di letture mappate allineando al cromosoma contenente il punto di vista9 supponendo che una regione non telomerica per un cromosoma di dimensione medio.
  2. Trasferire le provette di reazione per ghiaccio e aggiungere ghiacciata 1 M glicina ad una concentrazione finale di 0,125 M (1,425 mL) per placare la reazione di reticolazione. Mescolare capovolgendo.
  3. Centrifugare per 5 minuti a 200 x g, 4 ° C e rimuovere con attenzione tutto il supernatante. Conservare il pellet cellulare a-80 ° C o procedere immediatamente alla cella lisi.

5. cellula Lisi

  1. Risospendere il pellet cellulare da 4.3 passaggio in 500 µ l di acido di 5mm etilendiamminotetraacetico (EDTA) per lavare. Centrifugare a 200 x g per 5 min a RT. scartare il surnatante.
  2. Risospendere il pellet cellulare in 125 µ l di 5 mM EDTA con 0,5% sodio dodecil solfato (SDS) e inibitori della proteasi x 1, ad esempio a 100 x cocktail contenenti antipain 5 mg/mL, 10 mg/mL chymostatin, 10mg/mL leupeptina e pepstatina 10 mg/mL A.
    Nota: Concentrazione del detergente potrebbe essere necessario essere ottimizzato per ogni tipo di cellula. Concentrazioni di detersivo insufficiente si tradurrà in lisi cellulare incompleta, lasciando la cromatina inaccessibile agli enzimi di restrizione. Se digestione di limitazione è persistentemente bassa nel passaggio 6.5.6 e l'attività dell'enzima è stato confermato, detersivo supplementare può essere richiesto. Aumentare la concentrazione di SDS in incrementi di 0,1%.
  3. Incubare la sospensione cellulare in ghiaccio per 10 min.
    Nota: Per keratinocytes umani primari, ottimale Lisi è stata ottenuta utilizzando un'incubazione di 10 min a 65 ° C, seguita da un'incubazione di 37 ° C durante la notte in un blocco di riscaldamento agitazione con agitazione (900 giri/min).
  4. Garantire che la lisi delle cellule è completa.
    1. Mix 6 µ l delle cellule con 6 µ l di Trypan blu su una diapositiva e coprire con un vetrino coprioggetti. Mostra sotto un microscopio.
      Nota: Al momento riuscita lisi, all'interno delle cellule dovrebbe apparire blu e ONU-lisate cellule apparirà bianche.
    2. Se la lisi cellulare appare insufficiente, agglomerare le cellule a 200 x g per 5 min e salvare il supernatante. Risospendere il pellet e ripetere i passaggi da 5.2 – 5,4 e/o in alternativa con temperature di incubazione diversi (vedere la nota al punto 5.3).
    3. Combinare il pellet ri-lisato con il surnatante salvato e procedere.
      Nota: Controllo visivo non è una garanzia di lisi sufficiente. Efficienza di digestione deve essere oggettivamente determinato come descritto al punto 6.5.6.

6. prima digestione di limitazione

  1. Aggiungere 30 μL di tampone di enzima di restrizione (specificati dal produttore) 10x e 27 μL di 20% Triton X-100 (1,8% finale) la sospensione dal punto 5.4. Portare il volume totale a 300 µ l con H2O.
    Nota: La composizione del buffer degli enzimi di limitazione dipenderà il RE scelto nel passaggio 1.
  2. Rimuovere un 15 μL aliquota come un "Controllo non digerito" e conservare a 4 ° C.
  3. Aggiungere la miscela di reazione rimanenti 200 U RE1 e incubare per una notte alla temperatura appropriata all'enzima in un blocco di riscaldamento agitazione con agitazione (900 giri/min). Il giorno successivo, aggiungere un supplemento di 200 U RE1 e continuare l'incubazione durante la notte.
  4. Rimuovere un μL 15 aliquota come "controllo Digested" e conservare a 4 ° C.
  5. Determinare l'efficienza di digestione:
    1. Aggiungere 82,5 µ l di 10 mM Tris-HCl a pH 7.5 a 15 campioni di µ l da passaggi 6.2 e 6.4. Aggiungere 2,5 µ l di proteinasi K (20 mg/mL) e incubare per 1 h a 65 ° C.
    2. Aggiungere 100 µ l di fenolo-cloroformio e agitare vigorosamente per inversione per eliminare la contaminazione di proteine residue. Centrifugare per 5 min, 16.100 x g e a temperatura ambiente.
    3. Trasferire la fase acquosa ad un nuovo tubo. 6.66 µ l di 3 M di sodio acetato pH 5.2, 1 µ l di glicogeno 20 mg/mL e 300 µ l di etanolo (EtOH) al 100%. Mescolare delicatamente inversione e porre a-80 ° C per 1 h.
    4. Centrifugare per 20 min a 16.100 x g a 4 ° C. Eliminare il surnatante, aggiungere 500 µ l di 70% EtOH e centrifugare per 5 min a 16.100 x g a TA.
    5. Rimuovere il supernatante e asciugare il pellet a temperatura ambiente per 2 min. Risospendere il pellet in 50 µ l di nucleasi-free H2O.
    6. Determinare l'efficienza del digest di qPCR13,14 utilizzando il metodo ∆∆Ct. Utilizzare il set non che fiancheggiano un sito di restrizione di primer (Vedi punto 2.2.2) come il controllo di normalizzazione. Procedere se l'efficienza di digestione è > 85%. In caso contrario, agglomerare le cellule e ripetere i passaggi 5.2 – 6.5, omettendo l'incubazione a 65 ° C al punto 5.3.

7. prima legatura

  1. Calore-inattivare l'enzima di restrizione incubando 20 min a 65 ° C. In alternativa, se l'enzima non può essere inattivato calore, fenolo-cloroformio estrarre ed etanolo precipitare il campione.
    Nota: Le più alte temperature di inattivazione raccomandate per alcuni enzimi di restrizione denaturano le proteine della cromatina, e questo può influenzare negativamente la qualità del campione. Inoltre, fenolo: cloroformio estrazione non è ideale, in quanto comporta la perdita del campione.
  2. Trasferire in una provetta conica 50 mL e aggiungere 6 mL di nucleasi-free H2O, 700 µ l di 10X tampone ligasi (660 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM di cloruro di magnesio (MgCl2), 10 mM dithiothreitol (DTT), 10 mM dell'adenosina trifosfato (ATP)) e 50 U T4 DNA ligasi. Mescolare delicatamente agitando e incubare per una notte a 16 ° C.
  3. Rimuovere un'aliquota di 100 µ l del campione come il 'controllo di legatura '.
  4. Determinare l'efficienza di legatura:
    1. Aggiungere 2,5 µ l di proteinasi K (20mg/mL) e incubare 1 h a 65 ° C.
    2. Aggiungere 100 µ l di fenolo-cloroformio e mescolare vigorosamente per inversione. Centrifugare per 5 min, 16.100 x g a RT.
    3. Trasferire la fase acquosa ad un nuovo tubo. 6.66 µ l di 3 M di sodio acetato pH 5.2, 1 µ l di glicogeno e 300 µ l di 100% EtOH. Mescolare delicatamente inversione e porre a-80 ° C circa 1 h.
    4. Centrifugare per 20 min a 16.100 x g a 4 ° C. Eliminare il surnatante, aggiungere 500 µ l di 70% EtOH e centrifugare per 5 min a 16.100 x g a 4 ° C.
    5. Rimuovere il supernatante e asciugare il pellet a temperatura ambiente. Risospendere il pellet in 20 µ l di acqua e caricare su un gel di agarosio 0,6% accanto ai controlli"digestione" da passo 6.5.
      Nota: Un campione ben legato dovrebbe apparire come una banda relativamente stretta ad alto peso molecolare (Figura 3).
    6. Se la legatura è sufficiente, procedere con il passaggio 8. In caso contrario, aggiungere fresco ATP (concentrazione finale di 1 mM) e nuova ligasi; Incubare per una notte a 16 ° C e ripetere i passaggi da 7,3 – 7,4.

8. invertire il cross-linking e isolare la cromatina

  1. Aggiungere 15 µ l di proteinasi K (20 mg/mL) e incubare per una notte a 65 ° C per invertire i legami incrociati.
  2. Aggiungere 30 µ l di RNasi A (10 mg/mL) e incubare per 45 minuti a 37 ° C.
  3. Aggiungere 7 mL di fenolo-cloroformio e mescolare vigorosamente per inversione. Centrifuga 15 min, 3.300 x g a RT.
  4. Trasferire la fase acquosa ad un nuovo tubo 50 mL e aggiungere 7,5 mL di nucleasi-free H2O (per diluire il DTT presente nel buffer di ligasi, che altrimenti si precipita con il DNA), 1 mL di 3 M sodio acetato a pH 5.6, 7 µ l di glicogeno (20 mg/mL) e 35 mL di 100% EtOH. Mescolare e incubare a-80 ° C per 1 h.
  5. Centrifuga 20 min, 3.900 x g a 4 ° C. Rimuovere il surnatante (pellet può essere difficile da vedere), lavare la pallina con 10 mL di ghiacciata 70% EtOH e centrifuga 15 min, 3.300 x g a 4 ° C.
  6. Rimuovere il supernatante e asciugare brevemente il pellet a RT. sciogliere la pastiglia in 150 µ l di 10 mM Tris-HCl a pH 7.5 a 37 ° C. Conservare a-20 ° C o continuare con il passaggio 9.

9. seconda digestione di limitazione: Tagliare i cerchi

Nota: Questo passaggio Crea cerchi più piccoli per ridurre al minimo la sovrarappresentazione del più piccolo catturati frammenti a causa di pregiudizi PCR nei passaggi di amplificazione a valle.

  1. Al campione passo 8.6, aggiungere 50 µ l di tampone di enzima di restrizione (specificati dal produttore), 10x 300 µ l di nucleasi-free H2O e degli enzimi di limitazione di U 50 RE2. Incubare per una notte alla temperatura appropriata per l'enzima selezionata.
  2. Rimuovere un'aliquota di 15 µ l del campione come il "controllo di digestione". Determinare l'efficienza di digestione come descritto nel passo 6.5.

10. seconda legatura e purificazione del DNA

  1. Inattivare l'enzima di restrizione come consigliato dal produttore. Se l'enzima non può essere inattivati, rimuovere l'enzima utilizzando un kit di purificazione basata su colonne.
    Nota: Come questo comporta la perdita del campione, purificazione di colonna non è ideale.
  2. Trasferire il campione in una provetta 50 mL e aggiungere 12,1 mL di nucleasi-free H2O, 1,4 mL di tampone di legatura (660 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM MgCl2; 10 mM DTT 10mm ATP) 10x e 100 U T4 DNA ligasi. Incubare per una notte a 16 ° C.
  3. 467 µ l di 3 M sodio acetato a pH 5.6, 233 µ l privo di nucleasi H2O, 7 µ l glicogeno (20 mg/mL) e 35 mL 100% EtOH. Mescolare bene e incubare a-80 ° C 1 h.
  4. Centrifuga 45 min, 3.900 x g a 4 ° C. Eliminare il surnatante, aggiungere 10 mL di freddo 70% EtOH e centrifuga 15 min, 3.300 x g a 4 ° C.
  5. Rimuovere il supernatante e asciugare brevemente il pellet a temperatura ambiente. Aggiungere 150 µ l di 10 mM Tris-HCl a pH 7.5 e incubare a 37 ° C per sciogliere il precipitato.
  6. Purificare i campioni con un silice basata su colonne PCR kit di purificazione, seguendo le istruzioni del produttore. Utilizzare 1 colonna per 3 x 106 cellule, basate sul numero iniziale delle cellule. Eluire le colonne con 50 µ l di 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 e i campioni della piscina.
  7. Misurare la concentrazione di fluorimetria o spettrofotometria utilizzando l'assorbanza a 260 nm. Il modello 4C è ora pronto per PCR inversa. Conservare a-20 ° C o procedere direttamente al passaggio 11.

11. PCR amplificare sequenze sconosciute interagenti mediante PCR inversa

  1. Determinare l'intervallo lineare dell'amplificazione eseguendo una PCR utilizzando diluizioni di modello di 12,5, 25, 50 e 100 ng 4C modello. Se si desidera amplificare da gDNA in parallelo per confrontare direttamente i prodotti al fine di identificare l'amplificazione non specifici. Eseguire reazioni di PCR utilizzando una denaturazione iniziale a 94 ° C per 2 min; 30 cicli costituito da una fase di denaturazione a 94 ° C per 10 s, un passo di ricottura a 55 ° C per 1 min e un passo di estensione a 68 ° C per 3 min; e un'estensione finale a 68 ° C per 5 min.
  2. Separare 15 µ l di ciascun prodotto PCR su un gel di agarosio 1.5% per confermare amplificazione lineare e valutare la qualità del modello (Figura 4). Amplificazione da 4C modello dovrebbe produrre discreti banding a basse concentrazioni di DNA e uno striscio a concentrazioni più elevate. La presenza della sbavatura indica maggiore complessità delle legature 4C amplificato.
  3. Quando siete soddisfatti con la qualità e la quantità del prodotto della PCR inverso generato, impostare una qPCR per determinare il numero ottimale di cicli da utilizzare per l'amplificazione:
    1. Impostare le reazioni contenenti coloranti SYBR e ROX usando la miscela di reazione in tabella 2. A meno che l'amplificazione non lineare ad alte concentrazioni in passo 11.2, uso 100 ng del modello per reazione.
      Nota: L'aggiunta di ROX facilita la normalizzazione del segnale fluorescente da un pozzetto a altro e da ciclo a ciclo.
    2. Eseguire le reazioni di PCR utilizzando una denaturazione iniziale a 94 ° C per 2 min; 40 cicli costituito da una fase di denaturazione a 94 ° C per 10 s, un passo di ricottura a 55 ° C per 1 min e un passo di estensione a 68 ° C per 3 min; e un'estensione finale a 68 ° C per 5 min.
    3. Determinare la fluorescenza di picco (endpoint) delle reazioni utilizzando la trama di amplificazione. Determinare il ciclo in cui reazioni raggiungono il 25% della fluorescenza di picco (Figura 5).
      Nota: Questo è il numero di cicli che verrà utilizzato per amplificare le librerie 4C (vedi passo 11.4).
  4. Impostare inversa PCR come illustrato nella tabella 3 per amplificare sequenze sconosciute legati all'esca dal modello 4 C. Dividere in 16 reazioni di 50 µ l prima dell'esecuzione. Eseguire reazioni di PCR utilizzando una denaturazione iniziale a 94 ° C per 2 min e cicli che consiste di una fase di denaturazione a 94 ° C per 10 s, una ricottura passo a 55 ° C per 1 min, e un passaggio di estensione a 68 ° C per 3 min utilizzare il numero di cicli determinato nel passaggio 11.3.3.
  5. Raccogliere e le reazioni della piscina. Purificare utilizzando un kit di purificazione di PCR di colonna-base silice. Utilizzare almeno 2 colonne per 16 reazioni. I prodotti di PCR purificati della piscina.
  6. Determinare la quantità di campione e la purezza mediante spettrofotometria. Rendimenti tipici sono tra 10 e 20 μg con rapporto A260/A280 ~ 1.85. Se i rapporti di assorbimento sono sub-ottimali, ri-purificare al fine di prevenire i problemi durante la sequenza.
  7. Valutare la complessità della libreria separando 300 ng di purificato prodotto di PCR su un gel di agarosio 1.5%.
    Nota: Prodotto amplificato dovrebbe assomigliare a quello da passo 11.2.

12. terza digestione di limitazione: Tagliare sequenze dell'esca

Nota: Questo passaggio rimuove sequenze non-informativo esca dai prodotti PCR inversi per massimizzare informativi sequenze catturate nelle fasi a valle di sequenziamento. Per monitorare l'efficienza del digest, un "monitor digest"15 viene digerito in parallelo utilizzando la concentrazione di DNA e l'enzima equivalente. Se RE1 e RE2 sono incompatibili per digestione simultanea, ad esempio, a causa di temperature di incubazione ottimali diversi o buffer di reazione, questo deve essere fatto come un digest sequenza (questo non è ideale).

  1. Ottenere un monitor di digest RE e testare la digestione in una reazione di 50 µ l.
    Nota: Si tratta di una molecola di dsDNA (ad esempio, un plasmide, amplicone PCR o DNA sintetico) che contiene i siti RE. L'unico requisito è che dovrebbe essere facile distinguere il taglio da uncut monitor su un gel di agarosio. Optimize RE monitor massa enzima concentrazione e se necessario.
  2. Digest 1 µ g di prodotto PCR inversa purificato da 11,6 passo e, in parallelo, il monitor RE da passo 12.1.
    Nota: DNA e concentrazione negli enzimi, come pure il tempo di incubazione, dovrebbe essere lo stesso per quanto riguarda il digest di prova nel passaggio 12.1 per sia il prodotto PCR inverso e il digest di monitor. Se necessario, regolare il volume di reazione.
  3. Eseguire il digerito RE monitor su un gel di agarosio di concentrazione appropriata per i frammenti previsti. La digestione è considerata sufficiente < 10% del DNA rimane uncut (Figura 6).
  4. Purificare il prodotto di PCR inverso digerito su un kit di purificazione DNA basato su colonna silice. Se digest sequenziale sono necessari, ripetere i passaggi da 12.1 – 12,4 con il secondo enzima.

13. preparazione di sequenziamento biblioteca

  1. Legare le schede compatibili con la rispettiva piattaforma sequenziamento di prossima generazione.
    1. Progettare le schede per ogni RE1 e RE2 in modo che, dopo ricottura i oligos, ogni scheda di RE ha la rispettiva sporgenza su 1 lato.
      Nota: ad esempio, se viene utilizzato HindIII, l'adattatore ricotto dovrebbe contenere una sporgenza "AGCT" 5' fosforilato. In alternativa, se si utilizzano standard T-sbalzo schede, fine-riparazione e coda alla libreria prima della legatura di adattatore.
    2. Temprare il rispettivo adattatore RE oligos. Risospendere i oligos nel buffer di ricottura (10 mM Tris, pH 7.5, 50 mM di cloruro di sodio (NaCl), 1 mM EDTA), mescolare in quantità equimolari a 50 µM, calore a 95 ° C e lasciarli raffreddare lentamente a 25 ° C.
    3. Eseguire la reazione di legatura. Mescolarvi ligasi 1x libreria C 4 ri-digerito con un complessivo 5 - 10 volte eccesso molare di adattatori ricotti (passo 13.1.2; rapporto di 50: 50 per ogni adattatore di RE utilizzati) e aggiungere 6U ligasi del DNA. Incubare secondo le istruzioni del produttore.
    4. Rimuovere le schede in eccesso purificando utilizzando un kit di base di silice colonna volume di basso-eluizione.
  2. Dimensione-selezionare.
    Nota: Selezione dimensione possono essere eseguita anche utilizzando un kit di pulitura della perla-based ed sono consigliata anche dopo purificazione colonna.
    1. Un gel di agarosio al 2% utilizzando un'agarosi ad alta risoluzione, l'aggiunta di una macchia non UV prima di colare il cast. Garantire che qualsiasi acqua perdita a causa dell'evaporazione durante il riscaldamento è sostituito da pesatura il biberon o il pallone prima e dopo il riscaldamento e l'aggiunta di acqua per recuperare la massa persa.
    2. Eseguire le librerie adattatore-legati sul gel, lasciando vuote corsie tra i campioni.
    3. Asportare le fette del gel corrispondente alla dimensione gamma 150 bp a 1 kb usando un bisturi pulito o la lama di rasoio.
    4. Purificare le librerie dal gel utilizzando un kit di estrazione del gel. Per minimizzare il bias della GC nel recupero di DNA, sciogliere le fette del gel a temperatura ambiente con rotazione.
  3. Determinare il numero di cicli per l'amplificazione di PCR di qPCR usando la miscela di reazione in tabella 4. Eseguire reazioni di PCR utilizzando una denaturazione iniziale a 98 ° C per 2 min e 40 cicli costituiti una denaturazione passo a 98 ° C per 10 s, un passo di ricottura a 60 ° C per 1 min e un passo di estensione a 72 ° C per 3 min.
    Nota: Il ciclo in cui fluorescenza raggiunge il 25% del valore massimo è il numero di cicli che verrà utilizzato per amplificare la libreria, come nel passo 11,3.
  4. Amplificare le librerie utilizzando la miscela di reazione in tabella 5. Eseguire reazioni di PCR utilizzando una denaturazione iniziale a 98 ° C per 2 min e cicli comprendente una fase di denaturazione a 98 ° C per 10 s, un passo di ricottura a 60 ° C per 1 min e un passo di estensione a 72 ° C per 3 min. Il numero di cicli di amplificazione da utilizzare per ogni libreria è stato determinato nel passaggio 13.3.
  5. Purificare le librerie amplificate utilizzando un kit di base di silice colonna volume di basso-eluizione.

14. sequenziamento e analisi dei dati di sequenziamento

  1. Determinare le concentrazioni di librerie amplificate usando un'analisi fluorimetrica. Diluire le librerie per la concentrazione appropriata per la sequenziazione (controllare con il servizio di sequenziamento o core per loro raccomandazione).
  2. Determinare la qualità delle librerie utilizzando una piattaforma di analisi degli acidi nucleici microfluidica.
    Nota: Il profilo della biblioteca dovrebbe rispecchiare che visto sul gel selezione dimensione nel passaggio 13.2 e la concentrazione del campione determinato in questo passaggio deve essere utilizzato per il sequenziamento.
  3. Piscina indicizzati librerie per ottenere letture almeno 3 milioni (almeno 50 bp leggere; single [1 X 50] o accoppiati fine [2 X 50]) per campione. Una libreria di alta qualità richiede almeno 1 milione mappato legge9, ma ci sarà qualche attrito durante il mapping. Ad esempio, una piattaforma di sequenziamento che produce circa 150 milioni letture per corsia può ospitare fino a 50 campioni in una sola corsia.

15. analisi dei dati di sequenza

  1. Demultiplex i dati utilizzando sequenze di indice per assegnare le letture a loro campioni adeguati.
    Nota: A seconda della loro familiarità, gli utenti possono eseguire analisi computazionali a valle dei file raw di sequenza FASTA/FASTQ utilizzando base interfaccia a riga di comando o, in alternativa, il facile da usare, basato su web Galaxy interfaccia (GUI) di grafica utente16 .
  2. Tagliare sequenze di adattatore e qualsiasi sequenza di esca derivanti da incompleta RE digestione nel passaggio 12, ad esempio, utilizzando il Toolkit di FAST-X (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/).
  3. Mappa demoltiplicate letture al genoma appropriato di interesse (ad es., UCSC mm10, hg19) utilizzando la trasformata di Burrows-Wheeler Aligner (BWA)17 o altro software di allineamento conseguente SAM file di output. Se necessario, convertire i file SAM a BAM via samtools18 (vedi passo 15,4).
  4. Utilizzare una pipeline di analisi 4C-seq come Basic4Cseq19, 4C-ker20, FourCSeq21o fourSig22 per analizzare i dati e identificare le interazioni.
    Nota: L'analisi dei dati e la valutazione della qualità della stessa deve essere effettuati secondo il manuale di riferimento del pacchetto software selezionato. Pacchetti di generano file di output di letto eccetto dove indicato. Brevemente, Basic4CSeq19 utilizza un file di input SAM (passo 15,3) per visualizzare le interazioni (txt, tiff, letto e file di output di parrucca) e valuta la qualità dei dati sulla base dei criteri stabiliti nel van de Werken et al. 9 4C-ker20 (ingresso tagliato FASTQ, passo 15,2) e FourCSeq21 (ingresso BAM, passo 15,3) identificare le interazioni differenziali tra le condizioni. fourSig22 (ingresso SAM) inoltre identifica interazioni significative e assegna una priorità di coloro che rischiano di essere riproducibile. Strumenti quali la genomica arricchimento normativo di strumento annotazioni (grande)23o integrazione con set di dati di codifica possono essere utilizzati anche per predire la funzione biologica di interazioni scoperto da 4C-segg.

Risultati

Keratinocytes umani primari sono stati isolati da 2 – 3 scartati neonatale prepuzi, riunita e colta in KSFM completati con 30 µ g/mL pituitaria bovina Estratto, 0,26 ng/mL ricombinante umano fattore di crescita epidermico e 0,09 mM di cloruro di calcio (CaCl2 ) a 37 ° C, 5% di anidride carbonica. Le cellule sono state divise in due boccette, e una boccetta è stata differenziata dall'aggiunta di CaCl2 a una concentrazione finale di 1.2 mM per cellule7 ...

Discussione

4C risultati hanno il potenziale per rivelare le interazioni di cromatina che possono identificare gli elementi normativi precedentemente sconosciuti e/o geni bersaglio che sono importanti in un contesto biologico specifico24,25,26. Tuttavia, gli ostacoli tecnici possono limitare i dati ottenuti da questi esperimenti. Bias PCR derivanti dalla eccessiva amplificazione del modello nei protocolli 4C è probabile. Questo protocollo ...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato da NIAMS (R01AR065523).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
HindIIINEBR0104S
CviQINEBR0639S
DNA oligonucleotide primersIDTTo be designed by the reader
50 mL conical centrifuge tubesFisher Scientific06-443-19
1.7 mL microcentrifuge tubesMidSciAVSS1700
Phosphate buffered salineThermo Fisher14190-136
Formaldehyde, methanol freeElectron Microscopy Sciences15710
NutatorVWR15172-203
GlycineJT Baker4059-00
Benchtop centrifuge
Refrigerated microcentrifuge
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma-AldrichED2SS
20% SDS solutionSigma-Aldrich05030
Trypan BlueThermo Fisher15250061
Glass slidesFisher Scientific12-550-143
Cover slipsVWR16004-094
Light microscope
Triton X-100Alfa AesarA16046
Shaking heat block
2 M Tris-HClQuality Biological351-048-101
Proteinase KNEBP8107S
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1)Sigma-AldrichP2069
Sodium acetateSigma-AldrichM5661
20 mg/mL glycogenThermo FisherR0561
EthanolFisher Scientific04-355-223
Nuclease-free waterFisher ScientificMT-46-000-CM
qPCR cyclerThermo Fisher4453536
qPCR platesThermo Fisher4309849
ThermocyclerThermo Fisher4375786
PCR strip tubesMidSciAVSST-FL
1 M Magnesium chlorideQuality Biological351-033-721
DithiothreotolSigma-Aldrich43815
Adenosine triphosphateSigma-AldrichA2383
T4 DNA LigaseNEBM0202S
AgaroseSigma-AldrichA6013
RNase AThermo FisherEN0531
Qiaquick PCR purification kitQiagen28104
MinElute PCR Purification kitQiagen28004
Spectrophotometer
Expand Long Template PCR SystemSigma-Aldrich11681834001
dNTP mixThermo FisherR0191
SYBR Green ISigma-AldrichS9430
ROXBioRad172-5858
Sodium chlorideSigma-AldrichS5886
End-It DNA End-Repair KitLucigenER0720
LigaFast Rapid DNA Ligation SystemPromegaM8221
SYBR SafeThermo FisherS33102
Taq PolymeraseNEBM0267S
UltraSieve AgaroseIBI ScientificIB70054
Qiaquick Gel Extraction KitQiagen28704

Riferimenti

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