次世代の 16S rRNA 増幅シーケンスによる目盛りマイクロバイ評価

要約

16S rRNA 配列ベクトル内で微生物の同定と解析を可能にするための次世代シーケンス プロトコルをご紹介します。このメソッドには、DNA 抽出、増幅し、pcr 法によって、フローセルとバイオインフォマティクスをシーケンス処理シーケンス データを系統情報に合わせてサンプルのバーコードが含まれます。

要約

最近十年間に媒介性疾患が再登場し、驚くべき速度、かなり罹患率と死亡率の世界の原因で展開します。効果的な広く利用可能なワクチンは、小説病軽減戦略の開発を必要とこれらの疾患の大部分の欠けています。この目的のためには、疾病の有望な道は、ベクトル マイクロバイ、ベクターに棲息する微生物のコミュニティを対象とする場合します。ベクトル マイクロバイ病原体ダイナミクスにおける極めて重要な役割を果たしているし、マイクロバイの操作は、ベクトル耐えられた病気の一握りの減らされたベクトルの豊富なまたは病原体伝送につながっています。ただし、病気、制御アプリケーションにこれらの調査結果を翻訳ベクトル微生物生態学、この分野で十分な技術によって歴史的に制限の徹底理解が必要です。次世代シーケンス アプローチの出現は、多様な微生物の迅速、高並列シーケンスを可能にしました。非常に節約される 16S rRNA 遺伝子をターゲットと変化する生態学的、実験条件の下でベクトル内に存在する細菌の特性を促進しています。この技法が PCR のシーケンス、フローセルに読み込みサンプルによってサンプル バーコード 16S rRNA 遺伝子の増幅とバイオインフォマティクスの系統情報を持つシーケンス データを一致するようにアプローチします。種または複製の高数の属レベルでの識別はこのアプローチにより、検出、解決、および伝統的な培養、顕微鏡、または組織学的染色からの出力の課題を回避通常達成することができます。テクニック。したがって、このメソッドはベクトル微生物多様な条件下での特性評価に最適ですが、現在微生物機能、ベクトル、または抗生物質による治療への応答内の場所に関する情報を提供できません。全体的にみて、16 次世代シーケンサーは、アイデンティティとベクトル病気ダイナミクスにおける微生物の役割を理解強力な手法です。

概要

復活と最近十年間に媒介性疾患の広がり世界的な人間と野生動物の健康に深刻な脅威をもたらします。効果的なワクチンは、これらの疾患の大部分の欠けているし、コントロールの努力はベクトルとベクトル ホスト相互作用の複雑な生物学的性質によって妨げられます。これらの課題を回避する新しい戦略の開発のため病原体の感染でベクター内微生物相互作用の役割を理解することができます。特に、ベクター関連微生物共生生物と共生、マイクロバイと呼ばれる病原体の相互作用は、病原体の感染に重要な結果があります。圧倒的な証拠を今、ベクトル マイクロバイ オームおよびライム病^1,2,3ジカ、マラリアなどの病気のための能力の間のリンクを示す例とこのアサーションをサポートします。ただし、疾病管理のための戦略にこれらの調査結果を翻訳構造、関数、およびベクター内細菌叢解析の起源のはるかに詳細な理解が必要です。変化する生態学的なおよび実験条件下でのベクトルの微生物コミュニティの同定と解析進むこの分野で重要なパスを構成します。

病原体のベクトルの微生物の居住者を識別するためのプロシージャは、西黒脚ダニセイブクロアシマダニライム病ライム病病原体の媒介種を利用してここで提供されます。ダニは、他の節足動物以上の人間の病原体の種類港中、比較的ティック内細菌叢解析⁴の生物学およびコミュニティの生態について少し知られています。ダニがウイルス、細菌、菌類、原生動物によって、共生、一過性微生物住民^5,4などの多様な配列を抱くことは明らかです。前の仕事は、地理、種、セックス、ライフ ステージ、吸血ソース^6,7、8に関連付けられているマダニ内細菌叢解析に強い変化を実証しています。しかし、この変化の基になるメカニズムは不明のまま、起源の調査とこれらの微生物コミュニティのアセンブリの詳細を保証します。ダニは垂直感染微生物を得ることができるホスト、気門、口、アナル孔⁹を通じて環境から吸収と接触。初期形成とティック マイクロバイの開発の形成要因を理解するには、相対的な上下環境伝送、具体的には目盛りの変化、自然なパターンを理解するために重要ですマイクロバイの多様性と疾患またはベクター コントロールに適用できるの病原体感染中のこれらのコミュニティの対話方法。

次世代シーケンスなどの強力な分子技術は今微生物を識別するため存在し、多様な環境や実験条件の下でベクトル内細菌叢解析を特徴づけるために用いることができます。これらの高スループット シーケンスのアプローチの出現で、前に微生物の同定は顕微鏡と文化主に依存。顕微鏡検査は迅速かつ簡単な方法が、微生物を識別するための形態学的方法は本質的に主観的な粗と低感度と検出¹⁰によって限られました。文化ベースのメソッドは微生物同定のため広く使用されて、薬物治療¹¹微生物の感受性を決定するため使用することができます。ただし、このメソッドも、感度が低いと苦しんで環境微生物の 2% 未満を設定¹²研究室で培養できることが推定されています。組織の染色方法は、検出し、ベクトル内の特定微生物をローカライズ、ダニの内様々 な分類群の分布の調査を有効にして微生物の相互作用についての仮説を研究に採用されています。ただし、微生物のアイデンティティの知識はこのアプローチを作る微生物の特性と同定適して適切な汚れを選択するため必要です。さらに、組織染色は非常に時間がかかり、骨の折れるプロセスであり大規模なサンプル サイズにも対応していません。シーケンスは、感度と多様な微生物の検出に限られている同様にサンガーなど従来の分子アプローチ。

次世代シーケンサーは、サンプル数が多いから微生物の迅速同定のためことができます。標準的なマーカー遺伝子のデータベースをさらに有効に参照の存在は、属や種のレベルに多くの分類学的解像度を増強しました。リボソームの小サブユニット Rna は、16 s rRNA の遺伝子領域を節約され、変数の存在のために最も一般的である各細菌のユニークな産物と普遍的なプライマーを作成すると、この目標を達成するためによく使用されます。種^13,14。このレポートは 16S rRNA 次世代シーケンスをティック マイクロバイのイチイを識別するための手順を詳しく説明します。特に、このプロトコルは、シークエンシングのためのサンプルを準備するための手順を強調します。もっと一般化順序の詳細については、バイオインフォマティクスの手順提供されており、現在利用可能なさまざまなシーケンスのプラットフォームおよび解析プログラムがあるのでそれぞれ豊富な既存ドキュメント。この次世代シーケンサー アプローチの全体的な可能性が主病のベクター内の微生物群集構造アセンブリの調査に適用することによって実証します。

プロトコル

1. マダニ コレクションと表面殺菌

1. ダニ ダニ削除ティック関連する生息地の上 1 m²白い布をドラッグしてホスト種に添付またはラボ^15,16刻み飼育収集。微細鉗子を使用してダニを操作し、-80 ° C で保存
2. 個々 の PCR チューブにダニを置き、15 のボルテックスによって表面の汚染物質を除去を過酸化水素 (H₂O₂)、70% エタノール、ddH₂O を 500 μ l 連続 s
3. 新しい PCR チューブにダニを置き、空気乾燥させます。
4. このチューブの機械的に乳鉢と乳棒 (本研究で使用される)、ビーズ ビーターの小さなビーズを使用してダニを粉砕してティック組織を中断またはメスと離れて目盛りを切断します。

2. DNA 精製

1. 市販 DNA 抽出キットで提供される指示に従って個々 のタイマー刻みから DNA を浄化します。100 μ L の最終巻を溶出します。
   注: は、2.2 2.8 の手順の概要については図 1を参照してください。キレート材料^20,21抽出やエタノール沈殿物¹⁹フェノール-クロロホルム抽出^17,18代替抽出方法があります。
2. 蛍光光度計や分光光度計を使用して成功の DNA の浄化を確認します。蛍光分析、190 μ L 二本鎖 DNA 分析の DNA のテンプレートの 10 μ L を使用します。予想収量は 0.1 〜 1.0 ng/μ L²²。吸光光度法、核酸定量で 1 μ L の DNA のテンプレートを使用します。予想される A260/280 の比率は約 1.8²³です。
3. 増幅にすぐに進むは、-20 ° C で試料を保存されていない場合

3. 16S rRNA 遺伝子増幅

1. 27.5 μ L 反応含むで PCR 増幅を設定: 1 μ m; 各プライマーの 5 μ L市販の 12.5 μ L PCR ミックス;5 ng/μ L の濃度で各タイマー刻みから抽出した DNA の 5 μ L。
   注: は 16S rRNA 遺伝子¹³の超可変 V3 V4 領域の拡大のため次のプライマーを使用します。
   5 ' - TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG - 3'
   5 ' - GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC - 3'
2. たちのためにプログラムにチューブを移動: 3 分; 95 ° C で初期変性25 サイクル 1) 95 ° C の 30 s、2) 57 ° C、30 秒、3) 72 ° C、30 s;5 分; 72 ° C で最終的な拡張10 ° C で最終開催
3. PCR が終わったら、4-6 μ L/1.5% の agarose のゲルにサンプルをロードすることによって PCR の製品を視覚化します。460 でバンドを探す bp の増幅を確認します。
   注: 増幅 PCR の製品が表示されない、ゲルのサンプル濃度が低すぎる場合 (< 10 ng)。プライマー二量体の存在は、低濃度のサンプルで共通です。他の非ターゲットのバンドが存在する場合、アニーリング温度を調整またはサイクルの数を減らします。
4. 浄化にすぐに進むが 4 ° C で試料を保存されていない場合

4. 16S 私アンプリコン浄化

1. 新しい PCR チューブを使用すると、各サンプルの ddH₂O 60 μ L の合計を取得すると PCR の製品を組み合わせます。低濃度の DNA サンプルは、増幅バイアスを軽減し、集中するサンプルをプールに 3 通で PCR 増幅を実行します。
2. それらを使用する前によく部屋の温度と渦に常磁性ビーズをもたらします。
3. 60 μ L のサンプルを常磁性ビーズの 48 μ L を追加し、5 分管磁気ラック ソリューションになるまで 5 分とオフの場所間インキュベートします。上澄みを除去します。
   注: このビーズ濃度対象プライマー二量体 (< 60 bp) の除去です。必要な場合は、他の非固有のバンドを削除するビーズ濃度を調整します。
4. 磁気ラックにチューブ、出来立ての 80% の 500 μ L を追加江藤。全ての試験管にエタノールを追加した直後に、液体をピペットします。ビーズを削除しないでください。エタノール付加と除去 1 つのより多くの時間を繰り返します。
5. 磁気ラック 5 分または小さいひびがビーズで表示されるまでにチューブを開いたままで余分なエタノールを削除するサンプルを風乾します。
6. TE バッファーの 20 μ L を追加し、5-10 分の室温で磁石をサンプルをインキュベートします。
7. 背面磁石チューブを配置します。一度ビーズと液体を分離、洗浄の PCR の製品を取得する新鮮なチューブに上清を転送します。
8. (省略可能)4-6 μ L/1.5% のゲルにサンプルをロードすることによって成功した私アンプリコン浄化を確認する製品を視覚化します。460 bp のバンドは見えるべきであるおよびプライマー二量体はないはず。
9. PCR のインデックスにすぐに進んでいない場合のサンプルを格納 4 ° C

5. サンプルのバーコードと浄化

1. 前方または逆プライマーまたは市販ライブラリ インデックス キットから、両方を選択して、各サンプルに特異的プライマーの組み合わせを割り当てます。
   注: シーケンスの後の微分をラベル見本を一意にできます。キットは通常 96 384 サンプルをシーケンス処理するのに十分なプライマーを提供します。
2. デュアル プライマーまたはインデックスを各プライマー (N7xx と S5xx)、12.5 μ L の市販 PCR マスター ミックス、ddH₂O、5 μ L、掃除私アンプリコン製品の 2.5 μ L の 2.5 μ L を含む 25 μ L 反応で PCR を行うことでサンプルに添付します。
3. たちのためにプログラムにチューブを移動: 3 分; 95 ° C で初期変性8-14 サイクル 1) 95 ° C の 30 s、2) 55 ° C、30 s、30 ° C、3) 72 s;5 分; 72 ° C で最終的な拡張10 ° C で最終開催
4. PCR が終わったら、4-6 μ L/1.5% の agarose のゲルにサンプルをロードすることによって PCR の製品を視覚化します。550 でバンドを探す bp の増幅を確認します。
   注: インデックス PCR の循環状態を通知するための可視化結果を使用します。非特異的結合を緩和したり、サンプルごとに目に見えるバンドを取得するサイクル数を増やすサイクル数を下げます。
5. 手順 4 に記載されている、クリーンアップ手順を繰り返します。クリーンアップ中に希釈を避けるためには、重複してインデックスの PCR を実行し、プールをここの製品。
6. いない場合はライブラリの定量化と正規化にすぐに進むの 4 ° C でサンプルを格納

6. ライブラリの定量化と正規化

1. ステップ 5.5 蛍光光度計や分光光度計を使用して各精製、バーコード製品の濃度を推定 (手順 2.2 参照)。約 13 の濃度を得るために TE バッファーでサンプルを希釈します。
   注: ライブラリ定量化試料シーケンス プラットフォームの推奨濃度を達成するために必要です。ライブラリの定量化、qPCR、によって達成されるが、qPCR 前サンプル濃度試薬と時間の節約します。13 濃度を定量キット²⁴qPCR 基準の濃度の平均値は、このライブラリ定量の精度を最大限に推奨します。
2. QPCR マスター ミックス (ライブラリ定量キット) から、ddH₂O、2.0 μ L、サンプルまたは標準の 2.0 μ L の 6.0 μ L を含む 10 μ L 反応の qPCR を実行します。各サンプルと標準より高い精度と精度の 3 通を実行します。3 つ以上の希釈レベルで各サンプルを実行 (e.g。、12:01、1 pm、および推定開始濃度 22) 定量の正確さを確保するため。
   注: 指定されたプライマーと基準の詳細については、使用数量キットによって異なります、製品テクニカル データ シートで利用できます。本研究で用いた定量キットの材料表を参照してください。
3. QPCR プレートまたはチューブのプログラム リアルタイム PCR 機器に移動: 95 ° C、5 分; の初期変性35 サイクル 1) 95 ° C の 30 s の 45 ° C、2) 60 s;解離ステップ 1) 95 ° C、15 s、2) 60 ° C、30 s、および 3) 95 ° C、15 s。
4. QPCR の結果から得られた定量値と使用サンプルの希釈レベルを使用して、各サンプルの濃度を始めて平均を計算します。
   注: たとえば、サンプル希釈 1: 100,000 の 14 の平均濃度が得られます 200 の元の開始濃度 nM。定量化結果が正確にできない場合があります標準曲線の範囲内である特定のサンプルの希釈レベルのいずれもしないする場合その場合は、希釈を調整し、再 qPCR を実行します。
5. 4 各精製、バーコード サンプルを希釈ステップ 7.5 で計算された平均濃度を用いた TE バッファーで nM。
   注: たとえば、平均サンプル濃度 200 nM、希薄、サンプル 1:50 で TE バッファー 4 nM 濃度を達成するために。正確なサンプル濃度は使用されるシーケンス システムと試薬キットによって異なります。推奨濃度のシーケンス システムのユーザー ガイドを参照してください。
6. 単管に等しいボリューム (通常 5-10 μ L) を追加することによってすべての個々 のライブラリの結合されたライブラリを作成します。
   注: すべてのサンプルは 4 nM 濃度にする必要があります等しいボリュームの追加プールされたライブラリのすべてのサンプルの等しい濃度を実現しています。
7. 6.2 6.4 4 nM 濃度を確認するため結合されたライブラリの手順を繰り返します。
8. 結合されたライブラリの濃度を計算して希釈または再 4 を達成するために必要に応じて Tris バッファーを使用して、プールに最終的なライブラリを構成する nM。
9. サンプル ロードにすぐに進むは、-20 ° C で試料を保存されていない場合損失や貯蔵中の DNA 濃度への変更を最小限に抑えるための定量化の直後に実行シーケンスを実行します。

7. ライブラリ変性および希釈、およびシーケンスを実行 (同じ日に実行)

1. 4 ステップ 6.9 naoh から nM 結合されたライブラリを変化させなさい。
   メモ: 最後のライブラリの準備手順は、シーケンス システムごとに異なります。詳細かつ最新のプロトコル シーケンス システムのユーザーズ ガイドを参照してください。新しいユーザーは、シーケンス処理プラットフォームの使用に関するトレーニングを受ける必要があります。 またはコア シーケンス処理施設を自分たちのライブラリを送信可能性があります。
2. シーケンス試薬キット (材料表) で指定されたバッファーを使用して必要な読み込み濃度変性ライブラリを希釈します。
   注: 最適な読み込み濃度はシーケンス システムと通常 1 250 午後²⁵からの範囲によって異なります。
3. 変性し、シーケンス制御を希釈します。
   注: はシーケンス制御を追加する低多様性ライブラリから生じるシーケンス処理の問題を修正します。NaOH を使用してシーケンス制御を変化させなさいし、ライブラリと同じ濃度に希釈します。
4. ライブラリとシーケンス制御を組み合わせます。
   注: ライブラリの多様性とシーケンス システムを使用すると、結合されたライブラリに、シーケンス制御の比率によって異なりますが、それは通常の 1:1 の²⁶。
5. 結合されたライブラリを読み込み、シーケンス フロー セルにシーケンス制御混合します。

8. 私アンプリコン シーケンス解析

1. 使用シーケンス システムに対応するクラウド コンピューティング環境で実行の指標を調べることによって実行の全体的な成功を評価します。
   注: 配列読み取りの数など、実行のメトリックは使用されるプラットフォームと試薬キットをシーケンスに基づいて異なります。一般的なシーケンス システムの目標値は、表 1に表示されます。
2. 生シーケンス データをダウンロードし、必要なバイオインフォマティクスのオープン ソース ソフトウェア、微生物生態学 (QIIME)²⁷または Mothur²⁸に量的な洞察力。
   注: 両方 QIIME と Mothur、オープン ソースと無料でダウンロードします。これらのプログラムを使用しての詳細についてはオンライン見つけることができ、初めてユーザーの詳細が十分に。以下の手順は、QIIME で実施したバイオインフォマティクス パイプラインの広範な概要を提供します。Python に精通している必要はありませんが、以下のスクリプトの実装を容易にします。
3. 作成し、QIIME の"validate_mapping_file.py"のスクリプトを使用してマッピング ファイルを検証します。
   注意: マッピング ファイルには、サンプル ID、私アンプリコンのプライマー シーケンス サンプルの説明など、データ分析を実行に必要なすべてのメタデータが含まれています。検証手順は、すべての必要なデータを適切な形式で入力されていることを確認します。
4. デマルチプレックスして"split_libraries.py"のスクリプト (図 1) を使用してシーケンスをフィルター処理します。
   注: このスクリプトを割り当てるバーコード読み取りインデックス プライマーの組み合わせに基づいてサンプル サンプル Id で入力してマッピング ファイル。また、いくつかの品質が最低限の品質スコア、シーケンスの長さ、および終了トリミング カットのトレードオフをユーザー定義に基づいてエラーのシーケンス制御の手順をフィルタ リングを実行します。
5. 運用分類単位 (OTUs) を"pick_open_references_otus.py"のスクリプトを使用してシーケンスに割り当てます。
   注: この手順のシーケンス id (通常 97%) のしきい値に基づいて参照シーケンスのコレクションに対してクラスター化されています。参照シーケンスのコレクションと一致しない読み取りは互いに対してクラスター化します。・ デ ・ ノボと終了参照乙ピッキング オプションも用意していますが、QIIME の開発者によって開く参照ピッキングお勧め。
6. "Alpha_rarefaction.py"または"normalize_table.py"のスクリプトを使用して乙テーブルを正規化します。
   注: この手順を修正列合計の変化かモダンなシーケンス テクノロジーに起因するサンプルあたり合計シーケンスを読み取ります。従来の真空を使用して正規化を実行することができますまたは累積合計スケーリングなどの代替方法。
7. いくつかのアルファ多様性、ベータ多様性と"core_diversity_analysis.py"のスクリプトを使用して、一度に分類群組成多様性解析を実行します。
   注: また、これらの解析実行できる個々 のスクリプトを使用して個別 (など、"alpha_diversity.py")。

結果

3 つの独立した卵から 42 タイマー刻みの合計クラッチし、0 と土中では、2 週間の 2 つの環境曝露期間マイクロバイ シーケンスの処理されました。各治療のグループ、1 つのクラッチと露出時間、6-8 目盛りサンプルの複製が含まれていると見なされます。これらの処理されたダニの抽出は次世代シーケンサーに読み込まれ、フィルターを渡す 12,885,713 のペアエンド リ?...

ディスカッション

16S rRNA の次世代シーケンシング、微生物同定のための標準的なアプローチになるし、病原体の感染に影響を与えるベクトル内細菌叢解析の研究。ここで説明したプロトコル詳細I. スルメライム病の媒介種の微生物コミュニティ アセンブリを調査するこのメソッドを使用してただし、他のカチカチ種または節足動物媒介種勉強に簡単に適用することができます。

確?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Item	Name of Material/Equipment	Company	Catalog #
1	DNeasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69504
2	Qubit 4 Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q3326
3	NanoDrop 8000 Spectrophotometer	ThermoFisher Scientific	ND-8000-GL
4	2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Kapa Biosystems	KK2501
5	AMPure XP beads	Agen Court	A63880
6	Magnetic Rack	ThermoFisher Scientific	MR02
6	TE buffer	Teknova	T0223
7	Nextera Index Kit	Illumina	FC-121-1011
8	KAPA Library Quantification Kit	Roche	KK4824
9	MiSeq System	Illumina	SY-410-1003
10	MiSeq Reagent Kit v3	Illumina	MS-102-3001
11	10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20	Teknova	T7724