JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Erratum Notice
  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Erratum
  • Reprints and Permissions

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Summary

ציסטאין עתירי פפטידים מקפלים לתוך מבנים תלת מימדיים נפרדות בהתאם שלהם קישוריות דיסולפידי. יישוב סינתזה של isomers דיסולפידי הפרט נדרש כאשר מאגר חמצון לא תוביל קישוריות דיסולפידי הרצוי. הפרוטוקול עוסק הסינתזה סלקטיבי של פפטידים 3 דיסולפידי-בונדד וניתוח מבניים שלהם באמצעות מחקרים NMR ו- MS/MS.

Abstract

פפטידים עם מספר גבוה של cysteines בדרך כלל מושפעים באשר למבנה התלת ממדי שלהם קישוריות דיסולפידי. זה ולכן חשוב מאוד להימנע מיצירת קשר דיסולפידי רצויה במהלך סינתזה פפטיד, כי זה עלול לגרום במבנה פפטיד שונה לחלוטין, וכתוצאה מכך משתנה bioactivity. אולם, היווצרות חוב דיסולפידי מרובים בפפטיד הנכון הוא קשה להשיג באמצעות שיטות עצמית מתקפלים סטנדרטיים כגון פרוטוקולים חימצון מאגר המקובלת, כי יכול להיווצר מספר connectivities דיסולפידי. פרוטוקול זה מייצג את אסטרטגיית מתקדם הדרושים לסינתזה יישוב של פפטידים גשר דיסולפידי מרובות אשר לא יכול להיות מסונתז באמצעות חימצון מאגר איכותי, כמותי. המחקר מדגים היישום של אסטרטגיה ברורה קבוצה שיגן על הסינתזה של כל פפטיד 3 דיסולפידי-בונדד אפשרי isomers של ממוצע-conotoxin PIIIA באופן ממוקד. פפטידים מוכנות על ידי באמצעות אסטרטגיה קבוצה מגן על היווצרות קשר דיסולפידי מוגדר סינתזה פפטיד מבוססי Fmoc מעבדתי. זוגות בהתאמה של cysteines מוגנים עם trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm) טרט-בוטיל (tBu) הגנה על קבוצות כדי לוודא כי במהלך כל שלב חמצון רק הנדרשת cysteines deprotected הינם מקושרים. בנוסף הסינתזה יישוב, שילוב של מספר שיטות אנליטיות משמש כדי להבהיר את מתקפלות הנכונה ואת הדור של המבנים פפטיד הרצוי. ההשוואה של isomers שונים 3-דיסולפידי-בונדד מציין את החשיבות של נחישות מדויק והידע של קישוריות דיסולפידי עבור החישוב של מבנה תלת מימדי, פרשנות של הביולוגי פעילות של isomers פפטיד. אפיון אנליטיים כולל הבהרה קשר דיסולפידי המדויק באמצעות ספקטרומטר מסה (MS/MS) טנדם ניתוח שבו מבוצע עם נגזרות חלקית מופחתת ו alkylated של איזומר פפטיד שלם המיוצר על ידי פרוטוקול מותאם. יתר על כן, המבנים פפטיד נקבעים באמצעות תהודה מגנטית גרעינית (NMR) 2D ניסויים ואת הידע המתקבל ניתוח MS/MS.

Introduction

השימוש של פפטידים ביו התרופות במחקר ופיתוח מוכרת מאוד, משום שהם מייצגים תרכובת סלקטיבי מאוד חזק עבור מטרות ביולוגיות מוגדרות1. עבור אתריים שלהם, למבנה התלת ממדי זאת, חשיבות רבה על מנת לבצע פעילות מבנה היחסים מחקרים2,3,4. מלבד רצף חומצת אמינו העיקרי המשפיע על קונפורמציה הכוללת, חוב דיסולפידי משמעותית לייצוב המבנה של ציסטאין עתירי פפטידים5. פפטידים גשר דיסולפידי מרובים כוללים conotoxins כגון ממוצע-PIIIA מ פורפורסנס אשר מכיל שישה cysteines ברצף שלה. תוכן ציסטאין גבוהה זה באופן תיאורטי מאפשרת היווצרות של 15 isomers דיסולפידי. קישוריות דיסולפידי נכונה חשוב מאוד פעילות ביולוגית6,7. עם זאת, השאלה שעולה היא האם יש אחד או יותר קונפורמציה ביו פפטידים המתרחשים באופן טבעי, אם אז, אשר של isomers האלה יש הפעילות הביולוגית הגבוהה ביותר? במקרה של ממוצע-conotoxins, מטרות ביולוגיות הן תעלות יונים ממותגת מתח נתרן, ממוצע-PIIIA בפרט הוא החזק ביותר עבור סוגיV1.2, נה נהV1.4 ו- NaV1.73.

הסינתזה של פפטידים גשר דיסולפידי יכולה להיות מושגת באמצעות שיטות שונות. השיטה הנוחה ביותר להיווצרות חוב דיסולפידי בתוך פפטיד היא הגישה כביכול על עצמי מתקפלים חמצוני. כאן, מבשר ליניארי של פפטיד מחזורית הרצוי הוא מסונתז הראשון באמצעות פפטיד מוצק-שלב הסינתזה, לאחר המחשוף מתמיכה פולימריים נתון חמצון במערכת מאגר. חמצון-חיזור-פעיל סוכני כגון גלוטתיון מופחתת ו מחמצנים (GSH/GSSG) מתווספים לעיתים קרובות כדי לקדם את היווצרות חוב דיסולפידי. החיסרון העיקרי של הנתמך על-ידי מאגר קיפול עצמית היא כי הקשרים דיסולפידי לא נוצרות באופן סלקטיבי stepwise אופנה. בהשוואה של פפטיד מקורית, אשר לעיתים קרובות איזומר אחד בלבד דיסולפידי ספציפי מתואר, זה אפשרי להשיג רבים isomers אחרים עם גישה זו8. ממוצע-PIIIA כבר הוכח לגרום לפחות שלושה isomers באופן שונה מקופל על עצמי מתקפל לתוך המחקר הקודם3. הפרדת תערובת איזומר כזה קשה למדי בשל פעמים השמירה דומה אם באמצעות שיטות טיהור כרומטוגרפי9. הסינתזה יישוב של איזומר ספציפי לכן יתרון. כדי לייצר באופן ספציפי שאיזומר עם קישוריות דיסולפידי מוגדרים, אסטרטגיה מיוחד נדרש אשר דיסולפידי איגרות החוב במרוכז סגורים. לכן, מבשר ליניארי נושאת קבוצות להגן על זוגות בודדים ציסטאין הוא מסונתז על התמיכה פולימר. לאחר חיסול, זוגות ציסטאין בנפרד ולא במרוכז deprotected הינם מקושרים ב תגובה חמצון להניב את הרצוי דיסולפידי אג ח10,11,12,13, 14 , 15 , 16. לאחר הסינתזה הטיהור של המוצר התגובה, נדרש לאשר את הזהות וקישוריות דיסולפידי לפי שיטות אנליטיות מתאימים. שיטות אנליטיות רבות זמינות עבור הבהרה של הרצף חומצת אמינו העיקרי, למשל., MS/MS, בעוד הקביעה של קישוריות דיסולפידי עדיין נשאר הרבה פחות ובדוקים. מלבד למורכבות כה מרובים בונדד דיסולפידי פפטידים, זיהומים הקשור למוצר (למשל., מ דיסולפידי ערבול), עקב מדגם והכנה לעבודה יכול לסבך עוד יותר את ניתוח. בנייר זה, אנו מראים כי השימוש בשילוב של טכניקות אנליטיות שונות הכרחי להבהיר באופן חד משמעי את זהותו של הקשרים דיסולפידי ב isomers ממוצע-PIIIA. יש בשילוב שיטות כרומטוגרפיות ספקטרומטר מסה ואנו מסופקים הדגימות באותו כדי NMR ספקטרוסקופיה. ב- desorption/ionization(MALDI) לייזר בסיוע מטריקס ניתוח MS/MS, זיהינו את האיגרות דיסולפידי באמצעות הפחתה חלקית של iodoacetamide derivatization כי ניתוח מלמעלה אינה אפשרית עבור פפטיד זה. 2D NMR הניסויים בוצעו על מנת לקבל מבנה תלת ממדי של כל איזומר. לפיכך, על ידי שילוב של שיטות אנליטיות מתוחכמים ברורים, אפשרי להבהיר כראוי קישוריות דיסולפידי ואת מבנה תלת ממדי של קומפלקס פפטידים בונדד דיסולפידי מספר7.

Protocol

הערה: כל חומצות האמינו המשמשות בתקנון היו בתצורה-L. הקיצורים של חומצות אמינו, חומצות אמיניות נגזרים שימשו על-פי ההמלצות של ועדת המינוח אוהב את, הוועדה המשותפת סיסטמטי-אוהב את המינוח הביוכימי.

1. מוצק-שלב פפטיד סינתזה (SPPS)

הערה: לבצע הסינתזה עם סינתיסייזר פפטיד מוצק-פאזי. לבצע הסינתזה של סימנים מקדימים פפטיד ליניארי של הרצף כללי ZRLCCGFOKSCRSRQCKOHRCC-NH2 באמצעות פרוטוקול תקשורת כימיה 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc). להחיל את חומצות אמינו המוגנים הבאים: Pyr (מפחיד (טרט-butyloxycarbonyl)), Arg (Pbf (2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl)), Asn(Trt), Asp(tBu), Hyp(tBu), Lys(Boc), Ser(tBu), Gln(Trt), Glu(tBu), Trp(Boc), Tyr(tBu), Thr(tBu) ושלו (Trt). להגן על זוגות ציסטאין Trt-, Acm-או tBu-קבוצות לפי קישוריות דיסולפידי המיועד.

  1. הכנה
    1. יבש שרף Fmoc רינק-אמיד (טעינה: 0.28 mmol/g) באמצעות של איזה שהוא לופילייזר בין לילה.
    2. הזן את הרצף הרצוי פפטיד (קוד 1-מכתב) לתוכנית של סינתיסייזר. התוכנית מחשבת את הסכום הנדרש עבור כל ריאגנט בודדים ומציין את הכמויות הממס.
    3. שוקל ריאגנטים בודדים (חומצות אמינו, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) לפי הפרוטוקול, לפזר אותם ב- dimethylformamide (DMF) כדי ריכוז סופי של 2.4 מטר (חומצות אמינו) ו- (0.6 מטר HBTU), בהתאמה.
    4. להעביר את ריאגנטים שונים (חומצות אמינו, HBTU, N-methylmorpholine (NMM, 50% DMF), פיפרידין (20% ב DMF), DMF, דיכלורומתאן (DCM)) כדי כלי המתאים ומניחים המחבטים המתאים של סינתיסייזר פפטיד מוצק-פאזי.
    5. להוסיף 100 מ ג של שרף יבש העמודות התגובה ולשים אותם מן ההמולה של סינתיסייזר. התחל את הסינתזה שלב מוצק פפטיד.
  2. SPPS-פרוטוקול (שסופק על-ידי סינתיסייזר)
    הערה: הפרוטוקול חלה על 100 מ ג של שרף (טעינה: 0.28 mmol/g) להוסיף תגובה אחת עמודה עבור 28 µmol סולם.
    1. הכנה של שרף
      1. יש לשטוף את השרף עם 2500 µL DMF, 1400 µL של DCM ו 1400 µL של DMF.
      2. ריקון שרף באוויר עד הממס יוסר ולשטוף השרף עם 2500 µL של DMF.
    2. . המחשוף Fmoc מגן קבוצתית
      1. להוסיף 20% פיפרידין DMF (1000 µL) שרף, וחכי במשך 6 דקות להסיר את הפתרון השרף. חזור על שלב 1.2.2.1.
      2. לשטוף פעמיים עם DMF (µLst 4000 1, 2 µLnd1400), לשטוף את השרף באוויר עד הממס יוסר ולשטוף פעמיים עם 2000 µL של DMF.
    3. ריאקציות מצומדות
      1. לערבב את ריאגנטים הבאים בבקבוקון נפרדים: HBTU (450 µL; 0.6 מטר ב DMF 270 µmol; 9.6 הציוד), NMM (125 µL; 50% DMF 568 µmol; 20 הציוד), חומצה אמינו Fmoc (420 µL; 2.4 מטר ב DMF 1.01 mmol; 36 הציוד). להוסיף את התערובת שרף ולחכות 13 מינימלית להסיר הפתרון של השרף. חזור על שלב כ- 1.2.3.1.
      2. לשטוף עם 3000 µL של DMF. לשטוף פעמיים עם 1400 µL של DMF. לשטוף פעמיים עם 2000 µL של DMF.
      3. חזור על שלבים 1.2.2 ו- 1.2.3 לפי מספר חומצות אמינו ברצף פפטיד.
    4. שטיפת המחשוף, שרף Fmoc הסופי
      1. להוסיף 20% פיפרידין DMF (1000 µL) שרף, וחכי במשך 6 דקות להסיר את הפתרון השרף. חזור על שלב 1.2.4.1.
      2. לשטוף פעמיים עם DMF (µLst 4000 1, 2 µLnd 1400) ומורידים את השרף באוויר. לשטוף פעמיים עם µL 2000 של DMF, 4 פעמים עם 1400 µL של DCM, ותורידי פעמיים עם אוויר.
  3. עבודה-up
    1. Lyophilize השרף מן התגובה עמודות לילה לאחר הסינתזה הושלמה.

2. פפטיד המחשוף של השרף (איור 1א')

הערה: במהלך ההליך המחשוף, כל חומצת אמינו לצד רשתות חוץ Cys(Acm) ואת Cys (tBu) להיות deprotected. הפרוטוקול חל על 100 מ ג של שרף.

  1. לשלב את השרף הליחה פנימה צינור 12 ml, תירגע עד 0 ° C על קרח.
  2. להוסיף 150 µL של תערובת נבלות (להכין 0.75 g פנול, 0.5 מ ל thioanisole, ethanedithiol 0.25 mL), 1 מ"ל חומצה trifluoroacetic (95% מים (H2O), TFA) על הקרח השרף. השאר מנענע בעדינות במשך 3 שעות בטמפרטורת החדר.
  3. לסנן את התערובת דרך frit זכוכית ולאסוף את פילטרט של צינורות מלאים בנפרד כקרח דיאתיל אתר (1 מ"ל של פצילות תערובת לכל 8-10 מ"ל של דיאתיל אתר). פפטיד ארגונייט שוקע כמו מוצק לבן.
  4. יש לשטוף את העוגה מסנן TFA נוספים (95% H2O, כ – 1-3 מ ל).
  5. סגור את הצינורות המכיל התמיסה centrifuge (3400 x g) את המתלים עבור 1 דקות, decant את תגובת שיקוע, לשטוף את כדורי עם 8-10 מ"ל של דיאתיל אתר קר כקרח. חזור על שלב זה 3 פעמים.
  6. להשאיר את כדורי עומד בלי בולם כבר 5 דקות להסיר שאריות שנותרו של דיאתיל אתר. להמיס את כדורי המוצר הגולמי ב 1 מ"ל של טרט-butanol (80% H2O). שזה יבש והקפיא את פפטידים (-80 מעלות צלזיוס).

3. טיהור למבשר ליניארי עם כרומטוגרפיה נוזלית למחצה מפוח בעל ביצועים גבוהים (HPLC)

הערה: לטהר את פפטידים גולמי על ידי שלב הפוכה למחצה מפוח (RP) HPLC מצויד עמודה סי18 (גודל החלקיקים מיקרומטר 5, 100 Å גודל הנקבוביות, 250 x 32 מ מ), לולאה הזרקת 3.6 מ ל. להשתמש במערכת • תנאי מעבר של 0.1% TFA H2O (eluent A) ו- 0.1% TFA acetonitrile (MeCN) /H2O (9:1, eluent B). לזהות את הפסגות-220 ננומטר.

  1. להוסיף כ- 70 מ"ג של פפטיד גסה צינור 15 מ"ל, לפזר את פפטיד מוצק בהיקף של הלולאה מדגם HPLC (למשל., 3.6 מ ל). משתמשים בתערובת של 0.1% TFA MeCN/H2O (1:1). מערבולת עד השלמת התפרקות, צנטריפוגה (3400 x g) הפתרון עבור 1 דקות.
  2. לצייר את המדגם (3.6 מ"ל) במזרק 5 מ ל, להזריק את הדגימה ללא בועות אוויר לתוך הלולאה הזרקה. מזריקים לתוך מערכת HPLC. הפרד את התערובת פפטיד באמצעות שיפוע של 0-50% eluent B מעל 120 דקות בקצב הזרימה של 10 מ"ל לדקה.
  3. לאסוף את השברים צינורות בודדים כפי שהם מופיעים. בתום המרוץ, להכין שברים שנבחר ספקטרומטר מסה (MS) וניתוח HPLC (שלב 6.1-6.2). שזה יבש והקפיא השברים ואחסן אותם ב-20 ° C.
  4. אחרי ניתוח MS ו- HPLC, לשלב שברים טהור של פפטיד ליניארי ולהכין את הדגימות חמצון הראשון.

4. סלקטיבי היווצרות חוב דיסולפידי

  1. 1 סנט חמצון (איור 1B)
    הערה: במהלך המחשוף פפטיד של השרף, Cys(Trt) הם deprotected, המוביל אל שני שאריות Cys לא מוגן אשר לאחר מכן ותוחלת חמצון כדי ליצור את קשר דיסולפידי הראשון. הפרוטוקול הבא חל על 15 מ ג של פפטיד מטוהרים ליניארי (גר'/מול 2864.5; 1; 5.2 µmol הציוד).
    1. להמיס את פפטיד ליניארי (15 מ ג) ב- 105 mL של אלכוהול איזופרופיל/H2O-תערובת (1:2; מ מ 0.05 pH 8.5 מותאם עם הידרוקסיד הנתרן (NaOH)) ולהשאיר מנענע בעדינות באוויר בתנאים בסיסיים עבור 12-48 שעות.
    2. לפקח על תגובת חמצון באמצעות HPLC ו גב' אישור הקמת הגשר הראשון על-ידי iodoacetamide (רשות העתיקות) derivatization (שלב 6).
    3. שזה יבש והקפיא את פפטיד ולהשתמש בו ללא טיהור נוסף עבור חמצון 2nd .
  2. 2nd חמצון (איור 1C)
    הערה: במהלך חמצון השני, את deprotection של cysteines המוגנים Acm, היווצרות של הגשר השני הם מזורז על ידי יוד. הפרוטוקול חל 15 מ ג של פפטיד לאחר חמצוןst 1 (גר'/מול 2862.5; 1; 5.2 µmol הציוד)
    1. להמיס את פפטיד (15 מ ג; הריכוז הסופי של 0.05 מ"מ) 105 mL של אלכוהול איזופרופיל/H2מ' O/1 תערובת חומצת מימן כלורי (HCl) (80:12.5:7.5).
    2. להוסיף µL 158 של פתרון יוד 0.1 M מתנול (MeOH) (15.7 µmol; 3 הציוד) לפתרון. מערבבים את התגובה בטמפרטורת החדר במשך 3-52 h, כלומר., עד להשלמת החמצון.
    3. לפקח על תגובת חמצון באמצעות HPLC ו גב' אישור היווצרות קשר דיסולפידי השני על ידי iodoacetamide (רשות העתיקות) derivatization (שלב 6).
    4. לעצור את התגובה על-ידי הוספת µL 79 של פתרון חומצה אסקורבית 1 מ' H2O (78.8 µmol; 15 הציוד). שזה יבש והקפיא את תערובת התגובה ומשתמשים את אבקת חמצון 3rd .
  3. 3 חמצוןרואד (איור 1D)
    הערה: חמצון האחרון מוביל את deprotection של cysteines המוגנים Bu t, היווצרות של גשר דיסולפידי השלישי. הפרוטוקול חל 15 מ ג של פפטיד לאחר 2nd החמצון (גר'/מול 2718.3; 1; 5.5 µmol הציוד).
    1. להמיס את פפטיד (15 מ ג, הריכוז הסופי של 1 מ מ) מ 5.5 ל TFA. הוא מכיל תערובת נבלות המורכב 11.2 מ ג של diphenylsulfoxide (55 µmol; 10 הציוד), 60.2 µL של anisole (0.6 mmol; 100 הציוד) ו 97.2 µL של trichloromethylsilane (0.8 mmol; 150 הציוד). מערבבים את התערובת במשך 3-5 שעות בטמפרטורת החדר.
    2. לפקח על תגובת חמצון באמצעות HPLC ו גב' אישור היווצרות קשר דיסולפידי השלישי על-ידי iodoacetamide (רשות העתיקות) derivatization (שלב 6).
    3. לזרז את פפטיד את החצוצרות שלה המכיל דיאתיל קר (0 ° C, 1 מ"ל של התגובה פתרון לכל 8-10 מ"ל של דיאתיל אתר).
    4. Centrifuge את המתלים (3400 x g, 1 דקות), decant את תגובת שיקוע, לשטוף את כדורי שוב ושוב (4 פעמים) עם 8-10 מ ל קר דיאתיל אתר (0 ° C). תן את כדורי יבש על אוויר (3 דקות).
    5. להמיס את כדורי ב 1 מ"ל של 80% טרט-butanol (ב H2O), שזה יבש והקפיא את פפטיד ואחסן אותו ב-20 ° C.

5. פפטיד טיהור

הערה: לטהר את פפטידים מחמצנים מאת preparative חלקית, RP HPLC מצויד עמודה סי18 (10 גודל החלקיקים מיקרומטר, 300 Å גודל הנקבוביות, 250 x 22 מ מ), לולאה הזרקת 3.6 מ ל. להשתמש במערכת • תנאי מעבר של 0.1% TFA H2O (eluent A) ו- 0.1% TFA MeCN/H2O (9:1, eluent B). לזהות את הפסגות-220 ננומטר.

  1. להוסיף 15 מ ג של המוצר הגולמי שסובל משלב 4.3.5 צינור 15 מ"ל. להמיס את המוצר הגולמי בהיקף של הלולאה מדגם HPLC (למשל., 3.6 מ ל). משתמשים בתערובת של 0.1% TFA MeCN/H2O (1:1). מערבולת עד השלמת התפרקות, צנטריפוגה (3400 x g) הפתרון עבור 1 דקות.
  2. להכין לתערובת 3.6 מ במזרק 5 מ ל, להזריק את הדגימה ללא בועות אוויר לתוך הלולאה הזרקה. התחל את הזריקה לתוך מערכת HPLC. לטהר את התערובת פפטיד באמצעות שיפוע של 0-50% eluent B מעל 120 דקות בקצב הזרימה של 10 מ"ל לדקה.
  3. לאסוף את השברים צינורות בודדים כפי שהם מופיעים. בתום המרוץ, להכין שברים שנבחר MS וניתוח HPLC (שלב 6.1-6.2). שזה יבש והקפיא שברים כל ואחסן אותם ב-20 ° C.
  4. בתום המרוץ, להכין שברים שנבחר MS וניתוח HPLC (שלב 6.1-6.2). שזה יבש והקפיא שברים כל ואחסן אותם ב-20 ° C.

6. פפטיד Analytics

  1. HPLC אנליטי
    הערה: לאשר את הטוהר של פפטיד על ידי RP HPLC אנליטיות מצויד עמודה סי18 (5 גודל החלקיקים מיקרומטר, 300 Å גודל הנקבוביות, 250 x 4.6 מ מ), לולאה הזרקת 500 µL. להשתמש במערכת • תנאי מעבר של 0.1% TFA H2O (eluent A) ו- 0.1% TFA ב- MeCN (eluent B). לזהות את הפסגות-220 ננומטר.
    1. להעביר דגימה של שברים פפטיד או התגובה פקדים לתוך HPLC בקבוקון, להמיס בתערובת של 0.1% TFA ב MeCN/H2O (1:1, 300-500 µL). למקם את המבחנה HPLC תעשיה של RP HPLC אנליטי.
    2. מזריקים µL 250 של כל דגימה. להשתמש במערכת • תנאי מעבר של 0.1% TFA H2O (eluent A) ו- 0.1% TFA ב- MeCN (eluent B). לטהר את פפטיד באמצעות שיפוע של 10-40% eluent B מעל 30 דקות בקצב הזרימה של 1.0 mL/min.
  2. ספקטרומטר מסה MALDI TOF
    הערה: לאשר את הזהות של פפטיד באמצעות ספקטרומטר מסה TOF MALDI (שעת הטיסה) באמצעות α- cyano-4-hydroxycinnamic חומצה כמו מטריקס.
    1. העברת כמות גלוי של פפטיד לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL ו לפזר זאת בתוך 10 µL של 37 מ מ α- cyano-4-hydroxycinnamic חומצה פתרון בתערובת של 0.1% TFA H2O/MeCN (1:1).
    2. מערבולת הפתרון עבור 10 s, חלות 2 µL של המדגם מטרה הקרקע פלדה, מילה נהדרת המדגם.
    3. השתמש במצב המשקף את המידות, כיול פפטיד של תקן שן טוחנת גושים מתחת 6000 גרם/מול.
  3. Iodoacetamide derivatization
    הערה: כפי iodoacetamide מגיב עם קבוצות תיול, iodoacetamide derivatization של פפטידים מציינת קבוצות תיול חינם. לפיכך, העדר של קבוצות תיול חינם משמש פקד תגובה באמצעות MS במהלך חמצון 1סנט .
    1. להמיס את פפטיד במאגר 10 מ מ פוספט (100 µL; מ מ 0.05 pH 7.8) צינור microcentrifuge 1.5 mL. להוסיף 100 µL של iodoacetamide במאגר פוספט (4 מ מ) של 10 מ מ הפתרון פפטיד ומנערים בעדינות את התגובה כבר שעתיים בטמפרטורת החדר בחושך. שזה יבש והקפיא את תערובת התגובה ואחסן אותו ב-20 ° C.
    2. טיפ פיפטה מסנן סי18-ריכוז ולהשתמש להתנות את הטיפ עם 10 µL של 80% (3 פעמים), 50% (3 פעמים), 30% (פי 3) ו- 0% (3 פעמים) MeCN H2O (+ 0.1% TFA).
    3. להמיס את הדגימה של שלב µL 6.3.1 ב 1 של 0.1% TFA H2O ולהוסיף את הפתרון לקצה פיפטה מסנן. פיפטה בזהירות למעלה ולמטה כך פפטיד נקשר החרוז. הסר את H2O מתוך הקצה פיפטה ולשטוף את הטיפ פיפטה מסנן עם 10 µL של 0.1% TFA H2O.
    4. להוסיף 2 µl של 0.1% TFA H2O/MeCN (1:1) עם עוד טיפ פיפטה (ללא סינון) מעל החרוז אשר מכיל את פפטיד. להחיל את פילטרט של המטרה הקרקע פלדה, מילה נהדרת המדגם.
    5. החל µL 1 של 37 מ מ α-cyano-4-hydroxycinnamic פתרון חומצה בתערובת של 0.1% TFA H2O/MeCN (1:1) כדי להשמיד את הקרקע היעד עם הדגימה, מילה נהדרת המדגם.
    6. השתמש במצב המשקף את המידות, כיול פפטיד של תקן שן טוחנת גושים מתחת 6000 גרם/מול.
  4. חומצת אמינו ניתוח
    הערה: לנתח את הריכוז פפטיד מדויק, כמו גם הרכב חומצת אמינו פפטיד באמצעות מנתח של חומצה אמינית.
    1. להעביר צינור microcentrifuge 1.5 מ ל 100 µg של פפטיד טהור (2604 g/mol; 0.04 µmol), לפזר את האבקה בתוך 200 µL של 6 M HCl.
    2. להעביר µL 200 של הפתרון לתוך המבחנה זכוכית ולהעביר שטיפה הצינור microcentrifuge 1.5 מ ל פעמיים עם 200 µL של HCl M 6. הפתרון השטיפה לתוך האמפולה זכוכית גם כן.
    3. לסגור את האמפולה על ידי חימום צוואר המבחנה עם להבה מבער בונזן. לשים את האמפולה לתוך שפופרת זכוכית. למקם אותו בתוך גוש חימום במשך 24 שעות ביממה ב 110 ° C עבור הידרוליזה.
    4. פתח את האמפולה, להעביר את הפתרון לתוך צינור microcentrifuge 2 מ"ל. לשטוף את האמפולה (3 x 200 µL) את הכובע (3 x 100 µL) עם מזוקק פעמיים H2O והעבר אותו לתוך הצינור microcentrifuge.
    5. Centrifuge הפתרון עבור 6-אייץ '-60 ° C ו- g x 210 ברכז כשעוצמת ואקום. להמיס את המוצר הידרוליזה µL 192 המאגר דילול מדגם (200 מיקרומטר) ולהעביר את הפתרון לתוך מסנן מיקרו-צנטריפוגלית.
    6. Centrifuge לדוגמה עבור 1 דקות ב 2300 x µL 100 g והעברה של פילטרט של תוך צינור מדגם חומצה אמינית ניתוח. למקם את הצינור לתוך במנתח חומצת אמינו ולהתחיל את הניתוח. תקן חומצת אמינו משמש לכיול.

7. MS/MS ניתוח של קישוריות דיסולפידי

  1. הפחתת ו אלקילציה חלקית17
    1. להמיס 600 µg של פפטיד טהור (2604 g/mol; 0.23 µmol) ב- 1.2 מ של מאגר ציטראט 0.05 M (pH 3.0; מ מ 0.14 פפטיד ריכוז) המכיל 7.5 מ"ג של tris(2-carboxyethyl) פוספין (TCEP; מ 0.02 נקודות mmol 0.03 נקודות).
    2. דגירה התערובת בטמפרטורת החדר, לקחת תגובה מספר דגימות הבקרה (100 µL) החל 0 דקות עד 30 דקות.
    3. מערבבים את הדגימות צינור microcentrifuge 1.5 mL עם 300 µL אלקילציה מאגר (0.5 M טריס-אצטט; pH 8.0; 2 מ מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA); 1.1 מ' iodoacetamide) כדי לעצור את התגובה ולבצע carbamidomethylation של קבוצות תיול חינם.
    4. לעצור את התגובה לאחר 5 דקות על-ידי הוספת 100 µL של 10% TFA (ב H2O) וחנות הדגימות בקרח יבש. להכין דגימות HPLC כפי שמתואר בשלב 6.1.2 ולהזריק 400 µL. (איור 2א)
    5. להשתמש במערכת • תנאי מעבר של 0.1% TFA H2O (eluent A) ו- 0.1% TFA ב- MeCN (eluent B). לנתח את פפטידים באמצעות השילוב של ההפרדה איזוקראטית (10% eluent B למשך 15 דקות), ואז הדרגתי עוקבות של 10-35% eluent B מעל 25 דקות בקצב הזרימה של 10 מ"ל לדקה לזהות את הפסגות-220 ננומטר.
    6. לאסוף את השברים 1.5 mL microcentrifuge צינורות ולהקפיא את פפטידים. (איור 2B)
    7. להעביר כמות קטנה של כל שבר צינור microcentrifuge 1.5 mL לניתוח MS/MS של הצורות מחמצנים (המשך בשלב 7.1.12).
    8. להמיס את פפטיד הנותרים (10-100 µg) ב- 0.1% TFA H2O (10-50 µL) ולהוסיף אמצעי אחסון המתאים של פתרון TCEP 100 מ מ (ב- H2O) כדי לקבל ריכוז TCEP הסופי של 10 מ מ.
    9. דגירה התגובה עבור h 1 ° 37 C (איור 2C). שזה יבש והקפיא את תערובת התגובה ואחסן אותו ב-20 ° C.
    10. להכין דגימות MS/MS כפי שמתואר בשלב 6.3.2-6.3.5.
    11. מבצע המדידות MS/MS ספקטרומטר מסה MALDI תוף/תוף. השתמש MS/MS המכסה (קרינת לייזר המושרה) עבור פיצול של פפטיד ובחר ההמונים קודמן 2 - ו 4 פעמים carbamidomethylated מינים. תהליך ולהעריך את הנתונים MALDI כדי לוודא קישוריות דיסולפידי הרצוי.

8. NMR ניסויים וניתוח מבנה

  1. להמיס כ 0.3-2 מ"ג של המוצר פפטיד טהור 500 µL של H2O/D2O (90:10), העברת התערובת לתוך microtube NMR.
  2. הכנת המדגם למדידות-ספקטרומטר NMR
  3. רשומה 2-ממדי [1H,1H] - DQF - נעים (כפול קוונטית מסונן המתאם ספקטרוסקופיה), [1H,1H] - TOCSY (ספקטרוסקופיה מתואם סה כ), [1H,1H] - NOESY (Overhauser הגרעינית שיפור ספקטרוסקופיה), ו [1H,13C]-ספקטרה HSQC (קוהרנטיות קוונטית בודדת heteronuclear) באמצעות דיכוי מים.
  4. להקצות את מגנטיים פרוטון הספקטרום מוקלטות, ליצור את המשימה אטום NOESY ספקטרה. להשוות עוצמות ב ספקטרום NOESY כדי להגדיר את האילוצים הגבול העליון המרחק בין אטומי שונה פפטיד. השתמש את עוצמת הפרוטונים נבטי לכיול שיא בעוצמה.
  5. לבצע חישוב מבנה ועידון עם תוכנת מחשב להמחשת מולקולרית ועושים שימוש את connectivities דיסולפידי מזוהה של שלב 7 נוספים ריסון (איור 3).
  6. בחר את המבנים עם האנרגיות הנמוך ולהשתמש בו עבור סימולציות דינמיקה מולקולרית (MD).

תוצאות

15 שונים גשר דיסולפידי isomers של PIIIA ממוצע-conotoxin מסונתז, מאופיין בפירוט (איור 1). חוב דיסולפידי מזוהים על ידי הפחתת חלקית ו- MS/MS לאחר מכן ניתוח (איור 2). ניתוח NMR של isomers שונים מתבצעת (איור 3) כדי לחשוף את המבנים פפטיד בודדים. ראוי לציי...

Discussion

שיטת המתוארים בזאת לסינתזה של ציסטאין עתירי פפטידים כגון ממוצע-PIIIA מייצג אפשרות לייצר באופן סלקטיבי בונדד דיסולפידי isomers של אותו רצף חומצות אמיניות. לכן, הוקמה שיטות כמו מוצק מבוססי Fmoc שלב הסינתזה פפטיד18 , אסטרטגיה מוגדרת קבוצה שיגן על היווצרות regioselective דיסולפידי חוב היו בשימו...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

אנחנו רוצים להודות Resemann א פ י מאייר, ד Suckau של ברוקר Daltonics GmbH ברמן; ד ההרחבה של טיצה, ההרחבה של טיצה א א, Schmidts ו', ג למפשעה מאוניברסיטת דרמסטאדט של טכנולוגיה; O. Ohlenschläger מ יינה כאשר שגיא, Engeser מ מ באוניברסיטת בון; ק' קרמר, Harzen א ו ה Nakagami של מכון מקס פלנק למחקר גידול הצמח, קלן; Susanne Neupert ממכון זואולוגיה, קלן; למערכות ביולוגיות תהודה מגנטית ספקטרוסקופיה במתקני באוניברסיטת פרנקפורט טכנית, תמיכה, הדרכה מודולים, וגישה מכשירים. תמיכה כספית מאת באוניברסיטת בון כדי ד הוא הודה בהכרת תודה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
PS PEG2000 Fmoc Rink-amide ResinVarian, Inc.PL3867-3764AmphiSpheres 40 RAM
Pyr(Boc)BachemA-3850
Arg(Pbf)Iris BiotechFSC1010
Asn(Trt)BachemB-1785
Asp(tBu)Iris BiotechFSP1020
Hyp(tBu)Iris BiotechFAA1627
Lys(Boc)BachemB-1080
Ser(tBu)Iris BiotechFSC1190
Gln(Trt)Iris BiotechFSC1043
Glu(tBu)Iris BiotechFSP1045
Trp(Boc)Iris BiotechFSC1225
Tyr(tBu)Sigma Aldrich47623
Thr(tBu)Iris BiotechFSP1210
His(Trt)Iris BiotechFDP1200
2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphatSigma Aldrich8510060Flammable
DMFFisher ScientificD119Flammable, Toxic
DCMFisher ScientificD37Carcinogenic
PiperidineAlfa AesarA12442Flammable, Toxic, Corrosive
N-Methyl-MorpholinSigma Aldrich224286
Cys(Acm)Iris BiotechFAA1506
Cys(Trt)BachemE-2495
Cys(tBu)BachemB-1220
trifluoruacetic acidSigma Aldrich74564Toxic, Corrosive
phenolMerck1002060Toxic
thioanisolAlfa AesarA14846
ethanedithiolFluka Analytical2390
diethyl etherVWR100,921Flammable
tert-butanolAlfa AesarL12338Flammable
acetonitrileFisher ScientificA998Flammable
waterFisher ScientificW5
isopropanolVWRACRO42383Flammable
sodium hydroxideAppliChemA6579,1000Corrosive
iodoacetamideSigma AldrichI6125
iodineSigma AldrichI0385
Hydrochloric acidMerck110165Corrosive
ascorbic acidSigma AldrichA4403
diphenylsulfoxideSigma AldrichP35405
anisolSigma Aldrich96109Flammable
trichloromethylsilaneSigma AldrichM85301Flammable
sample dilution bufferLaborservice Onken
sodium dihydrogen phosphateSigma Aldrich106370
disodium hydrogen phosphateSigma Aldrich795410
(2-carboxyethyl)phosphine hydrochlorideSigma AldrichC4706
citric acidSigma Aldrich251275
sodium citrate dihydrateSigma AldrichW302600
tris-acetateCarl Roth, 7125
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma AldrichE26282 
peptide calibration standard IIBruker Daltonics GmbH8222570
Name of EquipmentCompany
solid-phase peptide synthesizerIntavis Bioanalytical Instruments AGEPS 221
lyophilizer Martin Christ GmbH Alpha 1-2 Ldplus
semipreparative HPLCJascosystem PV-987
Eurospher 100 C18 column (RP, 5 µm particle size, 100 Å pore size, 250 x 32 mm)Knauer25QE181E2Jpurification of the linear peptide
Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 22 mm)Hichrom-VWRHICH218TP1022purification of the oxidized peptide
analytical HPLC Shimadzusystem LC-20AD
Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 4.6 mm) Hichrom-VWRHICH218TP54analytical column
ground steel target (MTP 384)Bruker Daltonics GmbHNC0910436MALDI preparation 
C18-concentration filter (ZipTip)Merck KGaAZTC18S096MALDI preparation 
MALDI mass spectrometerBruker Daltonics GmbHultraflex III TOF/TOF
amino acid analyzerEppendorf-Biotronik GmbHLC 3000 system
NMR spectrometer Bruker Avance IIIBruker Daltonics GmbHBruker Avance III 600 MHz
computer program for molecular visualisingYASARA Biosciences GmbHYasara structuresNMR structure calculation
computer program for MALDI data evaluation Bruker Daltonics GmbHflexAnalysis, BioToolsMS/MS fragmentation
analog vortex mixerVWRVM 3000
MicrocentrifugeEppendorf5410
CentrifugeHettichEBA 20
Rotational vacuum concentratorChrist2-18 Cdplus
Analytical BalanceA&D InstrumentsGR-202-EC

References

  1. Fosgerau, K., Hoffmann, T. Peptide therapeutics: Current status and future directions. Drug Discovery Today. 20 (1), 122-128 (2015).
  2. Gongora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
  3. Tietze, A. A., et al. Structurally diverse µ-conotoxin PIIIA isomers block sodium channel NaV1.4. Angewandte Chemie - International Edition. 51 (17), 4058-4061 (2012).
  4. Carstens, B. B., et al. Structure-Activity Studies of Cysteine-Rich α-Conotoxins that Inhibit High-Voltage-Activated Calcium Channels via GABABReceptor Activation Reveal a Minimal Functional Motif. Angewandte Chemie - International Edition. 55 (15), 4692-4696 (2016).
  5. Zhang, Y., Schulten, K., Gruebele, M., Bansal, P. S., Wilson, D., Daly, N. L. Disulfide bridges: Bringing together frustrated structure in a bioactive peptide. Biophysical Journal. 110 (8), 1744-1752 (2016).
  6. Nielsen, K. J., et al. Solution structure of µ-conotoxin PIIIA, a preferential inhibitor of persistent tetrodotoxin-sensitive sodium channels. Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27247-27255 (2002).
  7. Heimer, P., et al. Conformational µ-Conotoxin PIIIA Isomers Revisited: Impact of Cysteine Pairing on Disulfide-Bond Assignment and Structure Elucidation. Analytical Chemistry. 90 (5), 3321-3327 (2018).
  8. Chang, J. Y. Diverse pathways of oxidative folding of disulfide proteins: Underlying causes and folding models. Biochemistry. 50 (17), 3414-3431 (2011).
  9. Böhm, M., et al. Novel insights into structure and function of factor XIIIa-inhibitor tridegin. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (24), 10355-10365 (2014).
  10. Postma, T. M., Albericio, F. Disulfide Formation Strategies in Peptide Synthesis. European Journal of Organic Chemistry. 2014 (17), 3519-3530 (2014).
  11. Albericio, F., Isidro-llobet, A., Mercedes, A. Amino Acid-Protecting Groups. Chemical Reviews. 109 (6), 2455-2504 (2009).
  12. Annis, I., Hargittai, B., Barany, G. Disulfide bond formation in peptides. Methods in Enzymology. 289 (1988), 198-221 (1997).
  13. Kamber, B., et al. The Synthesis of Cystine Peptides by Iodine Oxidation of S-Trityl-cysteine and S-Acetamidomethyl-cysteine Peptides. Helvetica Chimica Acta. 63 (4), 899-915 (1980).
  14. Bosch, D. E., Zielinski, T., Lowery, R. G., Siderovski, D. P. Evaluating Modulators of Regulator of G-Protein Signaling (RGS) Proteins. Current Protocols in Pharmacology. 56 (2.8), 1-15 (2012).
  15. Mochizuki, M., Tsuda, S., Tanimura, K., Nishiuchi, Y. Regioselective formation of multiple disulfide bonds with the aid of postsynthetic S-tritylation. Organic Letters. 17 (9), 2202-2205 (2015).
  16. Peigneur, S., et al. δ-conotoxins synthesized using an acid-cleavable solubility tag approach reveal key structural determinants for NaV subtype selectivity. Journal of Biological Chemistry. 289 (51), 35341-35350 (2014).
  17. Heimer, P., et al. Application of Room-Temperature Aprotic and Protic Ionic Liquids for Oxidative Folding of Cysteine-Rich Peptides. ChemBioChem. 15 (18), 2754-2765 (2014).
  18. Kates, S. A., Albericio, F. . Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide. , (2000).
  19. Wüthrich, K. NMR studies of structure and function of biological macromolecules (Nobel lecture). Angewandte Chemie - International Edition. 42 (29), 3340-3363 (2003).

Erratum


Formal Correction: Erratum: Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities
Posted by JoVE Editors on 11/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities. The Protocol and Materials sections were updated.

Step 1.1.3 in the Protocol section was updated from:

Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 2.4 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.

to:

Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 0.6 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.

Step 1.2 in the Protocol section was updated from:

NOTE: The protocol applies to 100 mg of resin (loading: 0.28 mmol/g) added to one reaction column for 28 μmol scale.

to:

NOTE: The standardized protocol usually applies to 100 mg of resin (loading: 0.53 mmol/g) added to one reaction column for 53 μmol scale leading to the following equivalents: 5 eq. HBTU, 10 eq. NMM, 5 eq. amino acid. In case of PIIIA, however, a loading of 0.28 mmol/g (28 µmol scale) is used, which results in the specified higher equivalents.

Step 1.2.3.1 in the Protocol section was updated from:

HBTU (450 µL; 0.6 M in DMF; 270 µmol; 9.6 eq.), NMM (125 µL; 50% in DMF; 568 µmol; 20 eq.), Fmoc-amino acid (420 µL; 2.4 M in DMF; 1.01 mmol; 36 eq.).

to:

HBTU (415 µL; 0.6 M in DMF; 249 µmol; 9 eq.), NMM (112 µL; 50% in DMF; 510 µmol; 18 eq.), Fmoc-amino acid (420 µL; 0.6 M in DMF; 252 µmol; 9 eq.).

The first item in the Materials table was updated from:

Fmoc Rink amide resinNovabiochem855001

to:

PS PEG2000 Fmoc Rink-amide ResinVarian, Inc.PL3867-3764AmphiSpheres 40 RAM

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

1402D NMRMS MS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved