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要約

ここでは、腹側海馬脳波との組み合わせで、てんかんと非てんかんラットのアスパラギン酸とグルタミン酸のリリースを分析する体内マイクロダイアリシス法について述べる。アスパラギン酸とグルタミン酸の細胞外濃度は、病気のさまざまな段階と相関があります。

要約

マイクロダイアリシスは病理学 (例えば発作の結果および/または動作と脳の間質性スペースに拡散神経学的活性物質の変化と相関関係を確立された神経科学技術てんかん)。てんかんを勉強、マイクロダイアリシス法、しばしば短期もしくは長期的ビデオ-脳波 (EEG) 自発性発作頻度、重症度、進行およびクラスタ リングを評価する年次モニタリングと組み合わせてください。複合マイクロダイアリシス脳波は、いくつかのメソッドと楽器の使用に基づいています。ここでは、体内マイクロダイアリシスと連続ビデオ脳波モニターのグルタミン酸とアスパラギン酸の流出ラットモデルにおけるてんかんの自然史のさまざまなフェーズでの時間をかけて記録を行った。この手法により、病気の発症や進行の特定の段階で神経伝達物質のリリースにおける変更点の組み合わせ。液体クロマトグラフィーによる透析液中アミノ酸濃度を測定しました。ここでは、メソッドおよびプリンシパルの予防措置の 1 つは生体内で透析中に取る必要がありますのアウトラインについて述べる-定位手術には特に注意、マイクロダイアリシス、深さの中に基底部および高カリウム刺激と脳波電極脳波記録と透析液中グルタミン酸とアスパラギン酸の高速液体クロマトグラフィー分析。このアプローチを適合させることが薬物や疾患の様々 なテストするアスパラギン酸とグルタミン酸が脳内の生理学的濃度変化を誘発します。適切な分析法によります、それがさらに使用する同時に脳波記録を採用する際に異なる水溶性分子をテストします。

概要

興奮性グルタミン酸性の機能障害および gaba 作動性抑制性神経伝達側頭葉てんかん (TLE) の自然発作の結果への洞察力を提供するために我々 は体系的に監視の細胞外濃度GABA1と後で自然の病気の様々 な時点でラットの腹側海馬におけるマイクロダイアリシスによってグルタミン酸とアスパラギン酸の2レベル コース、すなわちてんかんの発生と進行中。我々 は行動、電気生理学的および病理組織学的変化の3,の4の面で非常に正確に病気を模倣しているラットでは, TLE ピロカルピン モデルの利点を取り、我々 はアミノ酸の透析液の濃度相関そのさまざまな段階酸: てんかんの侮辱、潜伏段階、最初の自然発作の慢性 phass5,6,7時間後急性期。病相をフレーミングは、長期ビデオ脳波モニタリングし正確な脳波と自然発作の臨床評価によって有効にされました。マイクロダイアリシス法のアプリケーション関連付けられて長期ビデオ脳波モニタリング TLE 分子病態のメカニズムの仮説を提案することができました。要約すると、本稿で説明する手法により開発てんかん動物モデルでの進行と定義されている脳領域内の神経化学的変化の組み合わせ。

マイクロダイアリシス カニューレに並置されている深度電極から成っているペアのデバイスは、神経活動に神経伝達物質の代謝やエネルギー基質の変化を関連付ける必要がありますのあるてんかんの研究に用いられます。広大な大部分のケースでは、自由に行動、使われますが、例えば手術8前深度電極調査薬物抵抗性てんかん患者の人間において、同様の方法でも実施することができます。脳波記録と透析液のコレクションの両方を個別に実行することがあります (例えば、1 つの半球で、マイクロダイアリシス電極を埋め込む他の半球または動物の 1 グループで、マイクロダイアリシスを実行するも実行中のプローブ唯一の脳波の動物の別のグループ)。ただし、電極をプローブに結合が複数の利点をある: それは定位手術を簡素化、のみ 1 つの半球に組織損傷を制限 (他、そのまま組織学のコントロールとして、そのまま)、これら結果をビードブラストアロイ同じ脳の領域と同じ動物から取得されます。

その一方で、結合マイクロダイアリシス プローブ電極素子の作製には、自家製の場合、スキルと時間が必要です。市場から購入した場合、1 つはお金の比較的高い量を過ごすことができました。また、マイクロダイアリシス プローブのとき (プローブ ・ チップは通常 200-400 μ m 径、長さ 7-12 mm)9、脳波電極 (電極、通常利息10の頭脳の構造に到達する 300-500 μ m、直径と十分な長さの)、結合、マウントされたデバイスは、動物の面倒は、透析ポンプと硬銅線脳波記録システムに接続されているとき特に失われる傾向が頭の片側にかさばるし、比較的重いオブジェクトを表します。この側面は、扱いにくく、マイクロダイアリシス セッションにあまり適応てんかん動物でより適切です。適切な手技と適切な術後ケアは最小限の動物の不快感を引き起こすと組合せマイクロダイアリシス脳波実験10、11,のために追求する必要があります長期的なインプラントにつながる12。

利点とマイクロダイアリシス法の制限は、多くの神経科学者によって詳細に検討されています。その他体内灌流のテクニック (例えば、高速流プッシュプルまたは皮質カップ灌流) をその主な利点は関心13,14、比較的正確な領域をカバーするプローブの小径 15。第二に、透析膜は、組織と出納; の間の物理的な障壁を作成しますしたがって、高分子量物質を横断しないし、解析16,17に干渉しません。さらに、組織は、出納18の流れから保護されています。もう一つの重要な利点液検体濃度を最大化するための流量を変更する可能性がある (すなわちマイクロダイアリシスのプロセスも数学的に定義することができ、高収量に変更することができますサンプルの試料の濃度)19。最後に、興味の組織に薬や薬理活性物質を注入して介入の20のサイトに及ぼす影響を確認する技術を使用可能性があります。その一方で、マイクロダイアリシス; 電気化学的または生物学的センサーと比較して解像度に制限時間 (サンプルを収集するために必要な時間のため通常より 1 分) にはそれは組織の損傷を引き起こす襲です。興味の analyte と出納に入るすべての可溶性物質の連続濃度勾配による膜の周りの空間内で神経バランスが損なわれます。最後に、マイクロダイアリシス法は非常に出納9,21,22,23 物質の定量化のための解析技法の制限による影響します。.高速液体クロマトグラフィー (HPLC) 生体試料中のグルタミン酸とアスパラギン酸の分析のための orthophthaldialdehyde 誘導体化が非常に有効24,25,26をされた後,27と広範な議論は本稿の範囲外ですが、このメソッドを使用して、生成されるデータの詳細に記載されます。

適切かつ液組成の変更なしに実行される、マイクロダイアリシスは伝達物質の放出の基底のレベルについての信頼できる情報を提供できます。基底レベルの最大の部分はシナプス9からの波及の送信機の結果が。神経細胞を刺激するためにまたは重要な奪うマイクロダイアリシス法ことができますも採用不足のため多くの場合で余分なシナプス領域の神経伝達物質の簡単なサンプリング調査の目標を追求する、K+または Ca2 +、するために呼び起こす神経伝達物質の放出を防ぐなどの生理的イオン。

高 K+刺激は、神経生物学目を覚まし動物のみならずプライマリおよび切片培養における神経細胞の活動を刺激するために使用されます。高濃度 K+ (40-100 mM) のソリューションに健康的な中枢神経系の露出は、神経伝達物質28の流出を連想させます。てんかん動物1その他神経変性疾患29,30高 K+に応えて追加リリースを提供するニューロンのこの機能が損なわれる可能性があります。同様に、2 +剥奪 (Ca2 +無料ソリューションを灌によって得られた) は、カルシウム依存性を確立に使用される Ca はマイクロダイアリシスによるほとんどの神経伝達物質のリリースします。グリア細胞に由来する Ca2 +独立したリリースが、多くの研究は、Ca2 +の意味の論争を提起に対し神経起源の Ca2 +依存リリースであることを一般に考えられている-の高感度測定などグルタミン酸や GABA9: したがって、可能であれば、それはこれらの後者より高い空間分解能と電極がシナプス31に近づくようにマイクロ センサーの研究、マイクロダイアリシス研究をサポートすることをお勧めします。

てんかん動物マイクロダイアリシス研究に関するそれらのほとんどから得られたデータがビデオまたはビデオ脳波モニタリング発作、すなわち、徴候および/または異常に起因する症状の一時的な発生の依存を強調することが重要です。32脳の神経活動を過度または同期。ピロカルピン扱われる動物実験を準備する際に考慮すべきアノキシア発作のいくつかの詳細があります。自然発作は頻繁に脳波発作間欠期スパイク3落ち込んで活動が続いているし、クラスター33,34で発生します。偽運営非てんかん動物が発作のような活動35を示すことがありますしたがって脳波記録の評価パラメーターは、標準化された36をする必要があり、可能であれば、マイクロダイアリシス セッションのタイミングが明確に定義する必要があります。最後に、彼らの非常に最近のレポート37 の国際連盟はてんかんに対して、アメリカてんかん学会の専門家によって説明次の原理と方法論的規準ビデオ脳波モニタリング コントロール アダルト齧歯動物でお勧め ,38。

ここでは、グルタミン酸とアスパラギン酸てんかん動物の長期脳波ビデオと高速液体クロマトグラフィーによる透析液の分析と並行しての透析について述べる。1 つは最もよい結果のための世話をする必要がありますプロトコルの重要なステップを強調します。

プロトコル

フェラーラ機関動物ケアおよび使用委員会の大学、イタリア保健省、すべての実験プロシージャを承認されている (承認: D.M. 246/2012-B) 欧州共同体で説明したガイドラインに従い1986 年 11 月 24 日 (86/609/EEC) の理事会指令」。このプロトコルは、てんかんと非てんかんラットにおけるマイクロダイアリシス セッションの脳波制御の下で得られたラット脳透析におけるグルタミン酸とアスパラギン酸の定量の具体的に調整されます。ここに記載されている材料の多くは、簡単にそれらの 1 つは彼の研究室で脳波やマイクロダイアリシスの使用するに置き換えられます可能性があります。

1. マイクロダイアリシス プローブ電極デバイスの組立

  1. (登録の電極の長さをカット、少なくとも 20 mm と長い接地電極 10 cm) 3 チャネル 2 ツイスト電極を使用して、デバイスを準備するガイド カニューレにカップルします。図 1Aで透析 3 チャネル電極とガイド カニューレの例を参照してください-1B 。
  2. (図 1) を取り出し、動物にマイクロダイアリシス プローブのためのスイッチの瞬間 (図 1) 数回の除去を容易にするため使用する前にダミー プラスチックカニューレにある金属製ガイド カニューレを挿入します。
  3. 電極を 2 回登録するのツイスト線を曲げる (図 1E-1F) ガイドのダミーのカニューレを線に合わせ、電極先端部 0.5 mm (図ガイド カニューレの先端よりも長い (図 1) をカットするために1 H) デジタル ノギスを使用しています。
  4. 1 mm 長いシリコン サークレットを準備 (外径 2 mm、厚さ 0.3 mm図 1I)ガイドのカニューレの先端とツイストの電極の先端をピンセット (図 1 j) を使用してシリコン サークレットに挿入します。それを修正、ガイドの足の上にカニューレ台座急速なアクションまたは樹脂 (図 1 K) の高分子接着剤で。図 1 L と図 2 aで完了したデバイスの例を参照してください。
  5. 4 h ターン デバイス上の側面のように、各 4 回、1 h の光にさらされるために、殺菌紫外線の下でデバイスを滅菌します。
    注: 多く自家製の電極とマイクロダイアリシス プローブは、同様の方法で組み立てられる可能性があります。ラット用説明インプラント上のヘッドは次の寸法: つま先; を台座に上から 10 mm x 深さ 7 mm 幅 x 5 mmインプラント先端が直径 600 μ m とすべてのデバイスの重量約 330 360 mg、長さ約 11 mm です。デバイスが接地電極の (i) 十分な長さ (ii) アセトンで任せられる歯科用セメントと共に回収装置 overnigh し、動物が殺されるとき次の使用、手術中に頭蓋骨のままにした場合 2、3 回は再可能性があります。t は、このようなセメントが機械的に分解することがあります、デバイスは洗浄し、再び滅菌します。

2. 定位手術

  1. 無菌、痛みのない手術39,40,41の現代的な標準に従うデバイス注入用脳定位固定装置とプローブ クリップ ホルダー (図 2 b) を使用します。
    1. ケタミン ・ キシラジンの混合物 (43 mg/kg と 7 mg/kg, i. p.) Sprague-dawley ラットの麻酔、脳定位固定装置のフレームにそれを修正します。時間で麻酔の深さをコントロールすることができます、最初のケタミン ・ キシラジン注射にイソフルラン麻酔 (空気の 1.4%; 1.2 mL/分) を追加します。動物の頭の毛を剃る。
  2. 後無菌手術39準備する 70% エタノールにヨウ素・ ベースのソリューションによって頭の皮膚表面を綿棒します。
    1. 次の座標を使用して右腹側海馬に優先順位 (1.1-1.5) で準備ガイド カニューレ電極装置をインプラント: 鼻バー + 5.0 mm、A-3.4 mm、L + 4.5 mm、P + 前1,26.5 mm。定位手術10、11,12の標準的な手法に従ってください。
    2. それがアンカーのネジをカバーしていないことを確認します。脳定位固定装置にそれをマウントするときは、これは簡単にプローブ ホルダーに配置される可能性がありますガイド カニューレ ヘッド用デバイスを把握します。
  3. 頭蓋骨骨 (右側頭骨プレート、左頭頂葉に 1 のネジと interparietal 骨プレートにネジに左右 1 ネジに 1 ネジ) にそれらをねじ込む、少なくとも 4 つのステンレスのネジで頭蓋骨にデバイスを固定します。さらに頭蓋骨の骨にネジを固定する組織接着剤のドロップを追加します。
    1. メタクリル セメントを用いたねじの半分をカバーします。骨の付着を高めるための浅い溝によってセメントの結合を促進します。
  4. デバイスの先端に脳組織に置き、一度約 3 本のネジを固定接地電極のワイヤーをねじる。マウントされたすべてのネジと歯科用セメント12,42,43でデバイスをカバーしてください。
  5. その後直立ケージ移動まで約 1 時間、手術中に動物を監視します。低体温症を避けるために地球温暖化パッドのそれらを保ちます。デバイスを注入した後、少なくとも 7 日間回復するラットを許可します。
  6. 手術後痛みや苦痛の印のための 3 日間、少なくとも一度毎日動物を監視します。鎮痛剤と感染症を防ぐために切開サイトに近い抗生物質のクリーム (ゲンタマイシン 0.1%) を持つ動物を与える (トラマドール 5 mg/kg, i. p.) 手術後の痛みを防ぐために 3 日間。

3. 側頭葉てんかん誘導ピロカルピンおよび動物実験のグループへの割り当て

  1. 手術後の回復の週後に、グループにランダムに動物を割り当てる: (i) 制御動物ピロカルピンが表示されます車および (ii) てんかんの動物。てんかんグループ以来、すべて、ピロカルピンの投与ラットの使用動物数の比例的増加は病気を開発します。
  2. ピロカルピン (350 mg/kg, i. p.) (SE) てんかん発作重積状態を誘導するための単一の注入後投与 (1 mg/kg、サウスカロライナ) methylscopolamine の 30 分を注入します。Methylscopolamine と対照群に車両 (生理食塩水) を注入します。すべての i. p. 行政用の 25 G 針付き注射器 1 mL を使用します。
    1. (手足をクローニングの頭をうなずいて 5 分以内 vibrissa 移動) 行動のけいれんを開始する動物を視覚的に確認し、継続的にすべての身体 (SE) のクローンを作成する 25 分以内。
  3. (20 mg/kg, i. p.) はジアゼパムの投与によって死亡率約 25% と約 10 日間の平均潜伏期間、発症後 SE 2 h を逮捕します。観察しピロカルピン注射後すぐに始まる行動すべての発作を記録し、その後少なくとも 6 時間継続します。
  4. 動物生理食塩水 (1 mL、i. p.) を与える 25 G 針とショ糖溶液 (1 mL、p. o.) で 1 mL 注射器を使用して体重の回復を促進するために SE 後 2 〜 3 日の 1 mL 注射器と柔軟な供給 17 G 針を使用します。
    1. ピロカルピン SE (SE、ボディ重量のフォロー アップが可能ではない後 24 h を殺した急性グループ) を除く研究から後 1 週間以内に最初の体重を達成できない動物を除外します。
  5. ポスト SE 動物にランダムに異なる実験的グループ (図 3) に割り当てる: 急性遅延 (SE の後の 7-9 日)、最初自発性発作 (SE 後約 11 日)、および慢性期 ((マイクロダイアリシスかかる場所 24 h 後)、相SE、すなわち約 10 日後最初の奪取後約 22 〜 24 日の開始)。自然発作の発生のための動物を監視します。
    注:てんかんラットにおける更なる実験のため次の包含/除外基準を使用: ピロカルピン投与後 1 時間以内のけいれんの SE の開発SE やマイクロダイアリシス プローブと電極の正しい位置の後の最初の週に体重します。

4. てんかんの動作の監視と分析

  1. てんかん動作の長期モニタリング
    1. (すなわち、研究者による直接観測の終わり)、ピロカルピン投与後約 6 時間はきれいな家のケージに動物を置き 24 時間ビデオ監視を開始します。
    2. 5 日目まで監視、デジタル ・ ビデオ監視システムを使用して 24 h ビデオを続けます。
    3. 5 日目で始まり、つなぎ縄でつながれた脳波記録へホーム長方形の檻の中でラットを接続し、24 時間ビデオ監視を継続します。
    4. 未接続で生成されたファラデーケージ (それぞれの単一動物の脳波信号の特異性によると各チャネルに設定増幅率) と脳波信号を観測開始脳波獲得外側に置かれたアンプのパラメーター セットケーブル。使用サンプリング レート 200 Hz と低い 0.5 hz フィルター セットを渡します。
    5. 動物を動物の頭 1 つの手の 2 つの伸ばされた指の間を押しながらコネクタ他のフリーハンドを使用して電極台座をネジ締めケーブルに接続します。集録を開始します。
      注意:信号が成果物の無料であることを確認します。一般的なアーティファクトは、スケールを大きく超えるスパイクです。
    6. 前日、マイクロダイアリシスの実験は、マイクロダイアリシスのプレキシ ガラス シリンダーを搭載したテザーの脳波システムに動物を転送します。動物を抑制することがなく電極からコネクタをねじ込むホーム ケージ システムをテザリング脳波から動物を外します。高プレキシ ガラス シリンダーに動物を配置します。
  2. 一日前に、マイクロダイアリシス セッション中にてんかんの動作の監視
    1. ファラデー ・ ケージ外に配置されるアンプのスイッチします。脳波ソフトウェアを開きます。接続されていないケーブルによって生成された脳波信号を観測脳波買収開始。
    2. 動物をテザー脳波記録システム 1 つの手の 2 つの伸ばされた指の間に動物の頭を押しながら他のフリーハンドを使用して電極台座にコネクタをねじに接続します。脳波信号はスケールに従って単一動物の電極信号増幅器の各チャンネルに増幅率 (利得) を設定します。研究者の直接の観察の下で少なくとも 1 h、新しいケージ (シリンダー) を探る動物を待ちます。
    3. 注: 24 h、透析前に実験は、ラットが簡潔にマイクロダイアリシス プローブをガイド カニューレのスイッチのイソフルラン麻酔。彼らは脳波記録システムにそれらを接続する麻酔したとき瞬間の活用します。
    4. 動物の商品によると垂れたケーブルを延長や短縮します。ケーブルが動物の動きと横になっている姿勢で干渉しないことを確認します。
    5. ビデオ カメラの正しい画像のフレーミングを確認します。ビデオ脳波記録を開始します。
  3. 発作と脳波活動の同定
    1. ソフトウェア プレーヤーを使用して、ビデオを視聴します。映画 8 回をリアルタイムに再生するよりも高速スクロールし、(前肢クローヌスと背面に動物または動物飼育と前肢クローヌスと落ちる参照) 一般化された発作を個別化します。ビデオをスローダウンし、始めのおよび行動の発作の終わりの正確な時間に注意してください。
    2. プロセス全般けいれん発作の数を数えることによってデータはビデオ記録の 24 h に観察し、発作頻度や発作 24 時間の観測値の平均された時間の面でそれらを表現します。
    3. 高周波の発作活動の期間として脳波発作を定義 (> 5 Hz) によって特徴付けられる、> 3 s2,44以上続くスパイクの頻度の進行とベースラインの向こう側 3 倍の振幅増加または似たような28。脳波のソフトウェアを使用すると、生の脳波を処理します。脳波のトレースを 1 h 分画に分割します。脳波トレース画ソフトウェア自動スパイクの分析のためにファイルをコピーします。
    4. 脳波ソフトウェアと定義済みパラメーター (4.3.3) を用いた脳波活動データを分析します。分析された動物のグループの目の不自由な 2 つの独立した調査官のすべてのビデオ分析を行います。発散の場合一緒にコンセンサス45に到達するデータを見直すようにします。

5. マイクロダイアリシス

  1. プローブ回復体外
    1. その保護スリーブの処理、製造元の指示に従ってその最初用プローブを準備します。
    2. 3 通で実験を実行: 3 1.5 mL 試験管 1 ml の標準 (グルタミン酸の 2.5 μ M) とアスパラギン酸の 2.5 μ M の混合物を含むリンゲル液のそれらの読み込みを準備します。3 ロード 1.5 mL の試験管を 37 ° c ブロック ヒーター セット入れ、かくはん上に配置します。
      注:クロマトグラフィー校正の同じ標準ソリューションを使用します。
    3. パラフィン フィルムで 1.5 mL の試験管を密封し、直径 1 mm 程度の穴を作るための鋭いピンセットによる穿刺します。
    4. プローブを取るし、パラフィンの映画で穴に挿入します。膜ソリューション レベルの下で少なくとも 2 mm を浸します。パラフィン フィルム 1.5 mL 試験管にプローブをさらに修正します。
      注意:先端に 1.5 mL 試験管の壁が触れていないことを確認します。
    5. プローブ入口を FEP チューブとチューブ アダプターを使用して輸液ポンプにマウントされている注射器に接続します。必要に応じて、使用微細孔 0.28 mm ID と 0.61 mm 外径と色チューブ アダプター (赤と青の管アダプター) のポリエチレン チューブ接続。
    6. 2 μ L/分のポンプを始動し、流体の出口のヒントに表示されます。0.2 mL の FEP チューブとチューブ アダプターを使用してテスト チューブを収集するプローブのコンセントに接続します。
      注:FEP 管を使用すると、すべての接続に対して。かみそりの刃を使用してチューブの希望の長さをカットします。入口と出口のプローブの異なる色のチューブ用アダプターを使用します。60 分チェック漏れを実行し、気泡ポンプができます。これらは存在しないはずです。
    7. 流率 2 μ L/分にポンプを設定し、チューブの出口側にサンプルを収集するために開始します。
    8. 3 30 分によるサンプルと 1.5 mL 試験管にソリューションの 3 つの等しいボリュームのサンプルを収集します。1.5 mL チューブ 1.5 mL の試験管内標準溶液に浸漬, マイクロシリンジを使用して 30 分毎から等しいボリュームのサンプルを取る。
    9. プローブ回復比較をしたら 2 つ異なる灌流量を使用してフロー レート 3 μ L/分 (5.1.7) ポンプを設置実験 (5.1.1-5.1.8) を繰り返します。
    10. ポンプを停止、70% エタノール蒸留水でチューブを洗浄し、空気を押し込みます。クリーンの蒸留水を満たしたバイアルにプローブを格納します。貯蔵前に蒸留水で 2 μ L/分でそれを灌によって徹底的にプローブをすすいでください。
    11. クロマトグラフィーによるグルタミン酸、アスパラギン酸、試料中の濃度を分析 (詳細下記; 6.3)。
    12. 次の方程式を使用してリカバリを計算します。
      回復 (%) = (C出納/Cソリューション透析) x 100。
  2. 自由行動ラットのマイクロダイアリシス セッション
    1. Preparative プロシージャ: プローブの挿入とテスト、輸液ポンプの設定および開始
      1. 製造元のユーザーズ ガイドによると初めて使用するためマイクロダイアリシス プローブを準備し、リンゲル液でそれらを埋めます。約 10 cm の FEP 管の長い部分をカットし、異なる色のチューブ アダプターを使用してプローブの入口と出口のカニューレに接続します。
      2. チューブ アダプターのすべての接続のデッド スペースに触れていることを確認します。
      3. 5.2.1.3。 24 時間透析実験の前に簡単に誘導の部屋にまでリカンベント イソフルラン (空気中の 5%) を持つ動物を麻酔します。ピンセットを使用して、動物の頭をしっかりと保持しているガイドからダミーのカニューレを取り外します。恵まれているじん帯膜ガイド カニューレにマイクロダイアリシス プローブを挿入さらに会社マイクロダイアリシス カニューレが粘土によって彼らのガイドに挿入します。
        注意:抽出するときにプローブの保護スリーブの壁をタッチ プローブをさせてください。
      4. プレキシ ガラス シリンダーに動物を入れ、新しい雰囲気を探る。前述のように動物をテザーの脳波記録システムに接続 (4.2.2 と 4.2.3 ポイントに従ってください)。
      5. 次の目がさめているラットの動きを自由に移動およびリンゲル液チューブ アダプターを使用してを含む鈍化の 22 G 針、2.5 mL シリンジにプローブの入口を接続します。リンゲル液リンゲル液 10 で 1 mL を取り出しプローブ内をプッシュ 2.5 mL の注射器のピストンを継続的に推進します。コンセントに表示される液体のドロップを確認します。プローブは、使用する準備が整いました。
      6. リンゲル液でチューブ アダプターによって FEP 管に接続されている 2.5 mL の注射器いっぱいになり輸液ポンプにそれらをマウントします。2 μ L/分でポンプを起動します。それは一晩実行みましょう。
        注:すべての FEP チューブの所望の長さを使用、高 K+刺激をいつ開始するかを知っているし、動物の脳の神経化学的変化と定量化データを関連付けるチューブのデッド ボリュームを計算します。作業フロー下でチューブで作成された空気の泡を使用して、この時間を計算します。
    2. 脳波の記録とカリウム刺激中のサンプルのコレクション
      1. 3 h のサンプル コレクション (ビデオ脳波記録) の発症の前の発作の有無を確認し、透析中発作活動を監視し続けます。
      2. リンゲル液でいっぱい cannulated FEP チューブ注射器を運ぶポンプを停止します。2.5 mL の注射器のポンプにマウントは K+ソリューション FEP チューブ チューブいっぱい修正リンゲル液溶液 100 mM アダプターと接続されます。
      3. 2 μ L/分でポンプを起動し、実行してみましょう。管のより迅速な充填は、充填時の 5 μ L/分でポンプを設定します。システム内の気泡の有無を確認します。チューブ アダプターのすべての接続のデッド スペースに触れていることを確認します。
      4. 動物 (5.2.1.5) 上記のように、プローブ使用の準備ができている場合をテストします。
        注:何らかの理由でプローブは動作しません、それを変更します。このような場合、マイクロダイアリシス脳波ワークステーション近くを使用する準備ができて、いくつかの準備マイクロダイアリシス プローブを維持します。脳波ケーブルから動物を外し、変更を実現するために必要に応じてイソフルランと簡単に麻酔します。
      5. 注射器いっぱいにそれぞれの動物、コンセントの先端に液滴の出現を待つにおけるプローブの入口カニューレにリンゲル液の FEP チューブを接続します。
      6. テスト チューブ内のコレクションにつながる FEP チューブ プローブのコンセントに接続します。穴あきキャップを閉じた 0.2 mL 試験管に FEP チューブを挿入します。チューブは、モデリング粘土の部分で固定することによって場所に留まることを確認します。
      7. システム (ゼロのサンプル) を平衡にサンプルを収集せず、2 μ L/分 60 分のポンプを実行し続けます。
      8. 基準条件 (通常リンゲル液による血液灌流) の下で 5 連続 30 分の透析液のサンプル (60 μ L それぞれボリューム) を収集します。氷の上のサンプルを格納します。
      9. 液体ポンプから動物の頭 (チューブ、すなわち、空気バブル時のデッド ボリュームによる) に渡すにかかる時間を計算し、FEP チューブに注射器を含む通常リンゲル液を含む注射器からなるを切り替えるこの時点でポンプを停止することがなく (100 mM K+) リンゲル液を変更しました。システム内の気泡の有無を確認します。ポンプを 10 分間実行をしましょう。
        注意:わらなくて自体を移動し、通常揺れる濡れた犬の偉大な番号を提示する傾向がある高 K+刺激の 10 分は、動物 (コントロール奪取クラスター動物から) または行動の発作 (てんかん動物) に介入する準備ができてねじれから管とケーブルを保護します。
      10. 10 分後に実行ポンプを含む通常リンゲル液に 100 ミリメートル K+リンガー液注射器からチューブをスイッチさせ.電源を切らないでポンプ ソリューションの変更時に、ラインに接続する管の端に液体のドロップされます。
      11. 透析液が含まれている、すなわち、高カリウム 5 後平衡透析液のコレクションの後の瞬間から 1 h. 収集 3 さらに 30 分の透析液サンプルの透析液分画 10 分毎 (20 μ L) を収集し、停止、ポンプです。氷の上のサンプルを格納します。
      12. 高速液体クロマトグラフィー分析まで実験後-80 ° c のサンプルを格納します。
      13. 急性 (24 h) とは、1 つだけマイクロダイアリシス セッション行われる 24 h 24 h 以内に SE した後最初の自発的な奪取 (図 3)、最初の発作グループを除いて、3 日連続、マイクロダイアリシス実験を繰り返します。
      14. 各実験終了後、麻酔薬の過剰摂取で動物を安楽死させるし、プローブおよび電極の位置の確認のため脳を削除します。
  3. ポスト透析の手順
    1. 蒸留水使用マイクロダイアリシス プローブを洗浄、次に使うまで清潔な蒸留水を満たした瓶で保管します。
      注:再利用膜透過性; を増加している可能性があります。その繰り返しの使用前にプローブの回復を確認します。
    2. 続いて 70% エタノール蒸留水 (チューブ、コネクタおよび注射器) を設定全体マイクロダイアリシスをすすいでください。エタノールを空気と置換し、無菌環境でセットを保管します。
    3. 基底の透析液のサンプルを 20 μ L 分画に分割し、アミノ酸基底の濃度分析のため 1 つだけ 20 μ L の割合を使用します。-80 ° C でさらにまたは検証的解析のための残りのサンプル ボリュームを格納します。
    4. 10% ホルマリンで脳を修正し、パラフィン包埋1によってそれらを保持します。歯肉のスライスに脳をセクション、ヘマトキシリンとエオシンで染色しています。正しいプローブの電極配置1,2脳を調べる。
      注:冷却 2 methylbutane で脳を修正し、-80 ° C で保存任意他実績のある染色プローブと電極管を視覚化することができます神経組織のセクションでを使用します。

6. ガスクロマトグラフィーによるグルタミン酸とアスパラギン酸の分析

  1. 前処理剤の準備
    1. それぞれボリューム 20:1 (v/v) orthophthaldialdehyde 試薬 (OPA) と 2-メルカプトエタノール (5 ME) バイアルにミックスします。バイアル キャップと空気タイトな隔壁を使用してを閉じます。
      注意:化学のフードの下で動作します。
    2. 渦に調製した溶液前処理エージェントのための位置にオートサンプラにそれを置くと。
  2. 透析液試料の調製
    1. 下春とガラス挿入を 2 mL 茶色オートサンプラー バイアルに入れ。1 つのバッチですべてのサンプルのバイアルを準備します。
    2. -80 ° C のフリーザーから 20 μ L 透析サンプルとそれらを溶かします。ソリューションの 1 μ L を削除し、内部標準物質 (IS) の 1 μ L を追加 L Homoserine (50 μ M) にサンプルの 19 μ L は、こうしてサンプル含むは 2.5 μ M。瓶でガラスの挿入に透析サンプルの 20 μ L をピペットし、気密隔壁でそれを封印します。
    3. オートサンプラー クロマトグラフィー ソフトウェアを使用して、ラベルの位置のサンプルにサンプルを含むバイアルを配置します。
  3. グルタミン酸とアスパラギン酸の濃度を決定するためのサンプルのガスクロマト グラフ分析
    1. カルバゾール検出液体クロマト グラフ システムの分析を実行します。サンプルの 20 μ L に 2 分プレカラムを 20 μ l/orthophthaldialdehyde/5-メルカプトエタノール 20:1 の (v/v) が追加された後は、アミノ酸を検出します。
    2. アミノ酸分析用システムを準備します。オートサンプラー、ポンプ、脱ガス装置、検出器、コンピューター制御ユニットの切り替えます。
    3. 移動相を含むボトルに、サイフォンを浸漬し、分析に使用されるクロマトグラフィー ポンプのチャンネルを削除します。
    4. 列の圧をチェックする移動相の流れを増やすに開始 (例えば、0.2 mL/min で開始し、作業フローを達成するまでさらに 0.2 mL/分 5 分ごとの流れを高める)。せ作業で実行システムの流れ 0.8 mL/分コラムを平衡させ、少なくとも 1 時間。
      注意:不安定な圧力システムの空気の存在を示します。圧力 25 MPa をを超えてはなりません。
    5. 345/455 に検出器の利得、高感度と励起と放射の波長設定 nm それぞれ。検出器信号 (オートゼロ) をリセットします。
    6. ガスクロマト グラフ ソフトウェアを使用すると、メソッドを計測器に送信します。今、クロマト グラフは測定する準備ができているはずです。
    7. 透析液のサンプルを独立した、標準スパイク透析液のサンプルと同様、適切なクロマト グラフ柱に関する基準 (0.25 μ M-2.5 μ M アスパラギン酸とグルタミン酸リンゲル液中)。ガスクロマト グラフ法を調整し、透析のサンプル分析の前に検出および定量限界を確立します。
    8. 単一の分析をアクティブにクロマトグラフィー ソフトウェアを使用して、分析するサンプルのシーケンスを作成し、シーケンスを実行します。
      注意:法精度を制御するために 1 つ以上の空白のサンプルと透析液サンプルのシーケンス内の異なる標準サンプルを実行します。
    9. クロマト グラムを取得一度、クロマトグラフィー ソフトウェアでそれらを分析します。校正印刷への関心のピークの統合をチェックしてください。定量化のためのピーク高さまたはピーク面積を使用します。
    10. サンプルの録音が完了するは、それでその高齢化と金型の成長を防ぐために (例えば、超純水で 50% アセトニ トリル) 有機溶剤で列とシステムを入力します。
    11. システムをシャット ダウンします。

結果

プローブの回復

平均の回復 (つまり、バイアル ソリューションの等量のコンテンツに対するパーセンテージとして出納の平均アミノ酸含量) は 6.32 ± 0.64 3 μ L/分、グルタミン酸の 2 μ L/分の流量で 15.49 ± 0.42% と 2 の流量で 14.89 ± 0.36% Μ L/min. 10.13 ± 0.51 3 μ L/分 cuprophane 膜プローブを使用するときはアスパラギン酸、平?...

ディスカッション

この作品では TLE の実験モデルにおけるマイクロダイアリシスと相まって連続ビデオ脳波記録を実行する方法を示す.動物の病気の進行の各段階を正しく診断するビデオ脳波記録技術が使用され (変更はありませんの時間で発生するグルタミン酸放出の変化を記述するマイクロダイアリシス法を使用以前に発行された研究2ではアスパラギン酸)。強くお勧めできる単一のデバイ...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者の優先順位で掲載された論文等への貢献のアンナ Binaschi、パオロ ・ Roncon、エレオノーラ パルマを感謝したいです。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
3-channel two-twisted electrodeInvivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USAMS333/3-B/SPCMaterial
guide cannulaAgn Tho's, Lindigö, SwedenMAB 4.15.ICMaterial
Resin KK2 PlastikElettra Sport, Lecco, ItalyKK2Material
Super Attack gel LoctiteHenkel Italia Srl, Milano, Italy2047420_71941Material
Imalgene-KetamineMerial, Toulouse, France221300288 (AIC)Solution
XylazineSigma, Milano, ItalyX1251Material
Isoflurane-VetMerial, Toulouse, France103120022 (AIC)Solution
Altadol 50 mg/ ml - tramadolFormevet, Milano, Italy103703017 (AIC)Solution
Gentalyn 0.1% crm - gentamycineMSD Italia, Roma, Italy20891077 (AIC)Material
simplex rapid dental cementKemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United KingdomACR811Material
GlasIonomer CX-Plus CementShofu, Kyoto, JapanPN1167Material
probe clip holderAgn Tho's, Lindigö, Swedenp/n 100 5001Equipment
Histoacryl® Blue Topical Skin AdhesiveTissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USATS1050044FPMaterial
Valium 10 mg/2 ml - diazepamRoche, Monza, Italy019995063 (AIC)Material
1 mL syringe with 25G needleVetrotecnica, Padova, Italy11.3500.05Material
rat flexible feeding needle 17GAgn Tho's, Lindigö Sweden7206Material
Grass Technology apparatusGrass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USAM665G08Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
modular data acquisition and analysis system MP150Biopac, Goleta, California, USAMP150WSWEquipment
digital video surveillance systemAverMedia Technologies, Fremont, California, USAV4.7.0041FDEquipment
microdialysis probeAgn Tho's, Lindigö SwedenMAB 4.15.1.CuMaterial
microdialysis probeSynaptech, Colorado Springs, Colorado, USAS-8010Material
block heaterGrant Instruments, Cambridge, EnglandQBD2Equipment
stirrerCecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy711Equipment
infusion pumpUniventor, Zejtun, Malta864Equipment
fine bore polythene tubingSmiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA800/100/100/100Material
blue tubing adaptersAgn Tho's, Lindigö Sweden1002Material
red tubing adaptersAgn Tho's, Lindigö Sweden1003Material
2.5 mL syringe with 22G needleChemil, Padova, ItalyS02G22Material
vial capCronus, Labicom, Olomouc, Czech RepublicVCA-1004TB-100Material
septumThermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USANational C4013-60 8 mm TEF/SIL septumMaterial
glass insert with bottom springSupelco, Sigma, Milano, Italy27400-UMaterial
autosampler vialNational Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, ItalyC4013-2Material
Smartline manager 5000 system controller and degasser unitKnauer, Berlin, GermanyV7602Equipment
Smartline 1000 quaternary gradient pumpKnauer, Berlin, GermanyV7603Equipment
spectrofluorometric detectorShimadzu, Kyoto, JapanRF-551Equipment
chromatogrphic columnKnauer, Berlin, Germany25EK181EBJMaterial
chromatogrphic pre-columnKnauer, Berlin, GermanyP5DK181EBJMaterial
mobile phase solution A0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0Solution
mobile phase solution B40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5Solution
Ringer solutioncomposition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSASolution
modified Ringer solutioncomposition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSASolution
saline0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0Solution
sucrose solution10% sucrose in distilled waterSolution

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