JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Yapısal olarak ilişkili proteinler sık sık farklı Biyolojik işlevleri uygulamak. Eşdeğer chimeric proteinleri oluşturmak için bu proteinler bölgelerinde alışverişi için onların fonksiyonel sapma sorumludur kritik protein bölgeleri tanımlamak için yenilikçi bir yaklaşım oluşturmaktadır.

Özet

Bu iletişim kuralının amacı chimeric proteinler içinde ayrı bir protein bölgelerinde yapısal olarak benzer bir protein karşılık gelen onların serilerinde bu bölgeleri işlevsel önemini belirlemek için değiştirilir tasarımını kapsar. Böyle chimeras örtüşen DNA parçalarının kullanan bir iç içe geçmiş PCR protokolü aracılığıyla oluşturulur ve yeterince astar, onların ifade yerli ikincil yapı ve translasyonel modifikasyonlar sağlamak için bir memeli sistemi içinde ardından tasarlanmış.

Farklı bölge işlevsel rolü sonra Chimera uygun okuma tahlil aktivite kaybı simgesiyle gösterilir. Sonuç olarak, hangi daha fazla moleküler çözünürlüğünü artırmak için tamamlayıcı teknikleri tarafından (Örneğin site yönettiği mutagenesis) taranması bölgeleri barındıran kritik amino asitler kümesi tanımlanır. Farklı fonksiyonları ile yapısal olarak ilgili bir protein bulunabilir durumlarda sınırlı olmasına rağmen chimeric proteinler başarıyla proteinler sitokinler ve sitokin reseptörleri gibi bölgelerde kritik bağlama tanımlamak için istihdam edilmiştir. Bu yöntem özellikle protein'ın fonksiyonel bölgeleri iyi tanımlanmış olmayan durumlarda uygundur ve faiz bölgeleri dar ve tarama çaba dahil azaltmak için yönlendirilmiş evrim yaklaşımlar içinde değerli bir ilk adım teşkil etmektedir.

Giriş

Proteinler, sitokinler ve büyüme faktörleri, dahil olmak üzere çeşitli türleri üyeleri benzer üç boyutlu yapılar paylaşmak ama farklı biyolojik fonksiyonlar1,2kez sarfetmek ailelerde gruplandırılır. Bu işlevsel çeşitlilik genellikle amino asit kompozisyonu molekül'ın etkin sitelere3içinde küçük farklılıklar sonucudur. Tür siteler ve fonksiyonel belirleyicileri tanımlaması sadece sağlamıyorsa değerli evrimsel bakış açısı aynı zamanda daha açık agonistleri ve inhibitörleri4tasarlamak için. Ancak, sık sık ilgili Yapısal proteinler arasında bulunan kalıntı kompozisyon farklılıkları çok sayıda bu görevi zorlaştırmaktadır. İçeren büyük kütüphaneler inşa mutantlar yüzlerce günümüzde her tek kalıntı varyasyon değerlendirilmesi mümkün olsa bile ve bunların birleşimleri hala zor ve zaman alıcı çaba5kalır.

Büyük protein bölgeleri işlevsel önemini değerlendirme teknikleri böylece değerli için yönetilebilir numarası6mümkün artıkları sayısını azaltmak için. Kesilmiş proteinler bu sorunu çözmek için en çok kullanılan yaklaşım olmuştur. Buna göre bölgeler altında eğitim protein işlevi belirli bölge7,8,9silme tarafından etkileniyorsa işlevsel olarak ilgili olarak kabul edilir. Ancak, bir büyük bu yöntem silme protein'ın ikincil yapı, misfolding, toplama ve yetersizlik hedeflenen bölge eğitim için giden etkileyebilir kısıtlamasıdır. Sitokin oncostatin M (OSM) bir iç silme 7 artıkları daha fazla olamazdı bir misfolded mutant sonuçlandı daha büyük10okudu, kesilmiş bir sürümü iyi bir örnektir.

Chimeric proteinlerin üretimi daha büyük protein bölgeleri analizine izin veren bir alternatif ve yenilikçi yaklaşım oluşturmaktadır. Bu yöntem, belirli Biyolojik işlevleri yerine bölümlerine katkısını değerlendirmek için başka bir protein, yapısal olarak Ilgili sıralarının tarafından bir protein ilgi bölgelerinde değişimi için hedeftir. Reseptörleri işlevsel etki alanları11,12tanımlamak için sinyal alanında yaygın olarak kullanılan, chimeric proteinler protein aileler küçük amino asit kimlik ama korunmuş ikincil yapısı ile çalışmak özellikle yararlıdır. Uygun örnekler interlökin-6 ve silier nörotrofik faktör (% 6 sıra kimlik)13 ya da lösemi inhibitör faktörü (LIF) ve OSM (% 20 kimlik)6, hangi gibi interlökin-6 (IL-6) türü sitokinler, sınıfta bulunabilir protokol sonrası dayanmaktadır.

Protokol

1. chimeric Protein tasarımı

  1. Uygun protein (donör protein ideal aynı protein ailesine ait, ama okuma kullanılmak üzere biyolojik aktivitesi eksik yapısal olarak benzer olmalıdır faiz (alıcı) protein bölgeleriyle değişimi için donör) seçin. Yapısal olarak ilgili hiçbir proteinler biliniyorsa, potansiyel adaylar bu uçsuz vektör hizalama arama aracı (bucaksız)14,15 gibi otomatik bir araç kullanarak belirlenebilir
    1. Protein veri Bankası (PDB)16 Avrupa Web sitesi (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/) erişmek, protein ilgi sağ üst köşesindeki Arama kutusuna adını tanıtmak ve 'Ara ''yı tıklatın. Koşuluyla bir kristal yapısı kullanılabilir değil PDB tanımlayıcı (PDB kimliği; Örneğin 1evs OSM için).
      Not: PDB yapısal veri yoksa, Homoloji manken protein SWISS-MODEL17 gibi bir aracı tarafından yerine, kullanılabilir adım adım protokolleri18kullanarak oluşturulmuş.
    2. BÜYÜK web sitesi (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vast.shtml) erişim. PDB kimliği kullanılabilir olması durumunda, 'önceden hesaplanan sonuçları al' bölümüne, imput 'İçin benzer yapıları göstermek' kutusundaki PDB kimliği gidin ve 'Go' tıklatın. Aaıdaki ekran görüntüsünde, 'Orijinal geniş' ve ardından 'Tüm zinciri' potansiyel yapısal olarak benzer adaylar için PDB kimliklerini görmek için tıklayın.
      1. PDB ID kullanılamaz, ancak bir Homoloji model oluşturulan 'Ara yeni yapısı ile' bölümüne gidin ve "Büyük arama" linkine tıklayın. PDB dosyasını modeli 'Gözat' 'Göndermek PDB dosyasını yanındaki', dosyayı seçerek ve 'Gönder' tıklatarak tarafından upload.
      2. Sonra PDB dosya yüklenir, büyük hesaplama başlatmak için 'Başlat' düğmesini tıklatın. Hesaplama yürütüldükten sonra yapısal olarak benzer proteinlerin PDB kimliklerini görmek için etki altında 'tüm zinciri' tıklayın.
    3. En iyi aday, ya deneysel olarak sistemindeki okuma seçim ya da bir edebiyat arama yoluyla (Örneğin reseptörü harekete geçirmek, enzimatik aktivite, transkripsiyon faktörü etkinlik) ilgi Biyolojik işlevleri değerlendirmek. Bir donör protein ile ilgi protein ile karşılaştırıldığında farklı görev seçin.
  2. Alıcı ve verici proteinler protein amino asit dizisi başvuru sırası (RefSeq) veritabanı19 edinin.
    1. RefSeq Web sayfası (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene) gen bölümünde erişmek, protein ilgi arama kutusuna adını yazın ve 'Ara ''yı tıklatın. Gen adı bulunan listesinde istediğiniz türlere tıklayın.
    2. Tüm belgelenmiş izoformlarının görmek için RefSeq bölümüne gidin. Sıra tanıtıcısı izoformu (NM ile başlayan) ilgi için tıklayın, sayfayı aşağı kaydırın ve 'gen, protein Kodlayıcı bölge vurgulamak için CD'ler üzerinde' tıklatın. Ekranın alt sağda 'FASTA' tıklatın ve gen dizisi kopyalayın.
    3. Düzenleme yazılımı uygun bir DNA'yı kullanarak DNA dizisi kaydedin. Serbestçe kullanılabilir maymun20kullanırken, programı açın, kopyalanan sıra boş kutusuna yapıştırın, sıra adı seçin ve 'Kaydet' seçeneğini tıklatın.
      Not: 1.2.1 adımları yineleyin. 1.2.3 için. Seçili bir veya daha fazla donör proteinler için.
  3. Farklı chimeric yapıları yerine kullanılacak protein bölgeleri seçin.
    1. Faiz farklı yapısal bölgelerde protein dizi bölün. İdeal olarak, söz konusu protein için farklı etki alanları literatürde tarif. Yoksa, ayrı korunmuş yapısal özellikleri (sarmal, döngüler) varlığını adımları 1.3.1.1 değerlendirilmelidir. 1.3.1.4 için.
      1. Yapısal veri ilgi proteinin PDB Web sitesinden indirin (bkz. Adım 1.1.1.). Protein için PDB sayfaya erişmek ve ekranın sağ tarafında 'İndir' tıklatarak PDB dosyasını karşıdan yükleyin.
      2. PyMOL (https://pymol.org/) gibi bir moleküler görselleştirme sisteminde PDB dosyasını açın. PyMOL içinde nükleotid dizisi görüntülemek (görüntü tıklayarak > sıra üzerinde), (H PDB kimliği yanında, tıklatıp 'her şey' seçerek) varsayılan yapısal verileri gizleme ve açıkça protein'ın yapısal görselleştirmek için 'karikatür' görünümü seçin (PDB kimliği yanındaki S tıklatıp 'karikatür') özellikleri.
      3. Nükleotid dizisi her ayırt edici yapısal özelliği için karşılık gelen amino asitler aşağı belirterek molekülü, farklı kısımlarını vurgulamak için ekranın üstündeki tıklayın.
    2. Maymun DNA sırayla farklı yapısal bölgelerde açıklama ekleyin. Bunu yapmak için adım 1.2.3 DNA dizisi açın., bölge amino asitler için kodlama nükleotit seçin, seçimi sağ tıklatın ve 'Yeni şekil' bir ad ve bir renk vermek için seçin. Önceki adımda belirlediğiniz yapısal her bölge için işlemi tekrarlayın.
      Not: Nükleotit seçim ORFs tıklayarak çift > doğru amino asit dizisi için kod sağlamak için Translate, sonra Tamam,'ı tıklatmak.
    3. Bir protein hizalama araç (Örneğin Clustal Omega21) istihdam iki protein kalıntı dizisi hizalayın.
      Not: chimeras memeli ifade sisteminde üretilmesi için olduğundan, bu dizilere proteinler sinyal peptidler içermelidir.
      1. 1.2.3 adımından DNA dizileri açarak ApE, donör ve reseptör proteinler tam amino asit dizisi elde edilir., seçme onları ve ORFs'ı > çevir.
      2. Clustal Omega Web sayfası (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) erişmek ve imput iki protein, amino asit dizisi sonra sayfayı aşağı kaydırın ve 'Gönder' seçeneğini tıklatın. Her sıra proceded içeren bir metin satırı tarafından olmalıdır ' > ProteinName' düzgün tespit edilmesi...
      3. 'Download hizalama dosya' sekmesini tıklatarak hizalamayı dosya almak ve kaydetmek. Bu dosya herhangi bir metin düzenleme programı tarafından açılabilir.
      4. Hizalama dosya bir referans olarak kullanarak açıklama onların DNA dizisi donör protein karşılık gelen yapısal bölgelerinde (bkz. Adım 1.3.2.).
    4. Hangi protein bölgelerine chimeric proteinler arasında döviz ve chimeras uygun nükleotit dizileri tasarım karar.
      Not: farklı bölgelerin fonksiyonel önemi ile ilgili ayrıntılı bilgi yokluğunda, bu tüm döngüler gibi büyük oyuncu değişikliği seçmek için önerilmektedir veya sarmal hangisinin değerlendirmek için protein işlevi üzerinde etkisi. Bu ilk keşif deneme sonra ilgili bölgeleri içinde daha küçük oyuncu değişikliği üzerinde duruldu chimeric protein tasarımının ikinci tur tarafından takip edilebilir.
      1. Reseptör protein ek açıklama eklenen DNA sırasının bir kopya--dan adım 1.3.2 oluşturun. ve bir chimeric protein yeniden adlandırın. Yeniden adlandırılan DNA dizisi maymun içinde açın, seçin ve nükleotid sırası değiştirilebilmesi ve eski yerine koymak o (1.3.3. adımda oluşturduğunuz ek açıklama eklenen sırasından kopyalanır.) donör protein karşılık gelen bölge tarafından daha sonra değişiklikleri kaydetmek bölge için kodlama silin.
        Not: yeni bir kopya oluşturun ve her farklı chimera tasarlanmış için bu adımı yineleyin.

2. moleküler klonlama için hazırlık

  1. Plazmid vektör seçim ifade sistemi için uygun seçin. Memeli ifade için bir yüksek-ifade vektör pCAGGS22 gibi veya pcDNA vektör serisi tavsiye edilir.
    1. Restriksiyon enzimi tabanlı bu protokol için gösterdiği klonlama için benzersiz kısıtlama siteleri birden çok klonlama sitedeki Yöneyin (MCS) mevcut faiz protein ile uyumlu olduğundan emin olun. Bunu yapmak için DNA dizisi chimeric yapıları, maymun ile açın, ' enzimler > enzim Seçici ' ve en az iki MCS kısıtlama sitelerin eksik olduğundan emin olun (adlarının yanında sıfır görüntüleme) sıra.
  2. Maymun gibi bir DNA Düzenleyicisi kullanarak terminal astar tasarım.
    1. Yeni bir DNA dosya oluşturun (Dosya > Yeni) vector öğesinin MCS (6-8 baz çifti, Örneğin TTAATTAA PacI için), seçilen ilk kısıtlama siteyi takip N-terminal astar bir lider sıra (3-9 İlave baz çifti, e.g. AAAGGGAAA), ile başlatmak ve bir isteğe bağlı rondela (Örneğin GCTAGCGCATCGCCACC pCAGGS vektör kullanılmış örnekte) ve faiz (Örneğin ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACG için OSM) gen ilk 18-27 baz çifti.
    2. Yeni DNA dosyasında, C-terminal astar sırası ile final 18-27 baz çifti ilginç (e.g. CTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA 6xHistidine C-terminal etiketi ile bir gen için), Gen tarafından isteğe bağlı bir spacer takip başlar (Örneğin TAGCGGCCGC içinde pCAGGS vektör), ikinci kısıtlama site seçilmiş (Örneğin GGCGCGCC AscI için) ve bir lider sıralaması (Örneğin AAAGGGAAA). Tüm sıra vurgulamak, sağ tıklayın ve 'Ters ters astar elde etmek için tamamlama' seçin.
  3. Beher-in chimeric yapıları sınır bölgelerinde tasarım astar.
    1. DNA dizisi Chimera (1.3.4.1. adımda oluşturduğunuz.) açın ve orijinal ve eklenen diziler temas halinde oluşan 15 baz çifti her serisinin nerede bölge 30 baz çifti bölgede vurgulayın. Bölge (sağ tıklayın ve seçin 'Kopya') kopyalayıp yeni bir DNA dosya yapıştırın; Bu dizi ileri astar olacaktır.
    2. Adım ve ters astar yeniden adlandırın önceki oluşturulan ileri astar kopyalayın. Astar sıra vurgulamak, sağ tıklayın ve 'Ters-tamamlayıcı' ters astar sıra oluşturmak için seçin.
    3. 2.3.1 adımları yineleyin. ve 2.3.2. chimeric DNA dizisi her temas bölgesi için. N-terminal veya C-terminal bölgelerde bu değişiklik yapılır sürece genellikle, ileri/geri astar iki kümesi bir chimera oluşturmak için gereklidir.
  4. Terminal ve iç astar bir oligonükleotid sentez sağlayıcısı'ndan sipariş.
    Notlar: Son derece kullanarak saf terminal astar (Örneğin HPLC saf) protokolün başarı oranı olumlu bir etkisi olabilir. Desalted iç astar genellikle iyi sonuçlar sağlar.
  5. Donör ile reseptör gen dizilerinin şablonu edinin.
    Not: bu dizilere açık okuma çerçevesi (ORFs) içeren bir şablon olarak büyük ölçüde plazmid istihdam yordamı kolaylaştırır ve tavsiye edilir. Alternatif olarak, bu genlerin ifade etmek için bilinen bir hücre satırından oluşturulan tamamlayıcı DNA (cDNA) sonraki adımlar için şablon olarak kullanılabilir.

3. polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) amplifikasyon Chimera oluşturan bireysel DNA parçalarının

  1. Bireysel bir PCR reaksiyon karışımı her chimeric protein beste parçaları için hazır olun. Tipik bir chimeric protein üç bireysel parçaları gerektirir: N-terminal bölümü, eklenecek bölge ve C-terminal bölümü.
    Notlar: Bir yüksek-sadakat DNA polimeraz (Örneğin Phusion High Fidelity DNA polimeraz) mutasyonlar sıra tanıtımı önlemek için kullanın. PCR reaksiyon akşam ayarlayabilir ve gecede çalıştırın.
    1. 1.5 mL microfuge tüp buz ve damlalıklı Tablo 1' de gösterilen sırayla PCR karışımları farklı reaktifleri kümesi sağlamak doğru astar ve şablonları her PCR reaksiyon için istihdam edilmektedir (bkz. Tablo 2).
    2. İki 0.2 mL ince duvarlı PCR tüpleri her reaksiyon için etiket ve her tüpün içinde karşılık gelen PCR karışımı 20 µL aktarın. PCR tüpleri bir PCR thermocycler transferi ve Tablo 3' te ayrıntılı Protokolü başlatın.
      Not: tavlama sıcaklığı en az 5 derece erime sıcaklığı daha düşük tasarlanmış astar olmalıdır.
  2. PCR çalışırken, 100 mL % 1'özel jel Tris-asetat-EDTA (TAE) arabelleği hazırlayın. Bu amaçla, özel 1 g ağırlığında, TAE arabellekte bir cam şişe 100 mL ile karıştırın ve özel tamamen şişeye 30-40 saniyede dönen eriyene kadar mikrodalga. Yaklaşık 50 ° C'ye soğutma izin ver, 2-3 µL etidyum bromür, (ya da eşdeğer bir DNA boya) ekleyin ve istediğiniz iyi tarak jel tepsiye dökün.
    Dikkat: etidyum bromür bilinen bir alkil, uygun koruyucu ekipman kullanımı sağlamak.
  3. 6 x DNA yükleme arabelleği 4 µL PCR reaksiyon tamamlandıktan sonra her tüpte ekleyin. % 1'özel jel elektroforez biriminde Ekle, TAE arabellek ile kapak ve dikkatle jel ile birlikte bir molekül ağırlığı merdiven içine örnekleri yükleyin.
    Not: yükleme saatinde boş şerit daha sonra DNA kurtarma kolaylaştırmak için örnekleri arasında bırakmak için tercih edilir.
  4. Jel 80-120 V adlı 20-45 dakika çalıştırın.
    Not: daha büyük gruplar daha uzun çalışan kez gerektirirken bantları 1.000 baz çifti altında genellikle yaklaşık 20 dakikada 120 V, electrophoresed.
  5. Elektroforez birim açmak, özel jel almak ve UV ışığı altında güçlendirilmiş DNA bantları görselleştirmek. Bir tıraş bıçağı kullanarak, jel üzerinden bireysel DNA parçalarının kesip ve etiketli 2 mL microfuge tüpler için aktarmak.
    Not: DNA hasarı önlemek için UV ışık pozlama süresini en aza indirmek.
  6. Bir PCR temizlik kullanın (bkz. Tablo reçetesi) farklı DNA parçalarının arındırmak için kit.
    1. Bir jel parçası içeren her tüp seti tarafından sağlanan NTI arabelleği 500 µL ekleyin. Bir thermomixer 50-55 ° c ve jel ara belleğe tamamen eriyene kadar 1000 devir / dakikada sallayarak aktarın.
    2. Her çözüm için etiketli kiti sütun aktarım, bir microcentrifuge (30-60'lar, 11.000 x g) spin ve flowthrough atın. Kit'in NT3 yıkama arabelleği 700 µL ekleyin, tekrar aynı ayarları altında santrifüj kapasitesi ve flowthrough atın. Sütun 1-2mins silis membran sütun içinde kurumaya 11.000 x g de için tekrar santrifüj kapasitesi.
    3. Sütun etiketli 1.5 mL microfuge Tube, damlalıklı 30 µL nükleaz ücretsiz su ve 30-60'ların DNA elute için 11.000 x g, santrifüj kapasitesi 1 dakikalığına stand izin sütun içine aktarın.
  7. DNA örneği 260'absorbans ölçerek kurtarılan miktarını ölçmek nm ve 340 nm bir spektrofotometre ( Tablo malzemelerigörmek). DNA toplama sonucu DNA'ın yok olma katsayısı (50 µg/mL)23tarafından çarparak 260 nm rakam 340 nm okunurken çıkarılarak hesaplanır.
    Notlar: Ek ölçümler at 230 nm ve 280 nm DNA saflık değerlendirilmesi için izin: 260/280 ve 260/1.8 yukarıda 230 oranları genellikle kabul kadar saf DNA örneği almak için. Protokol bu adım 4 ° C (kısa vadeli) veya-20 ° C (uzun dönem) eluted DNA depolamak sonra duraklatılmış.

4. PCR güçlendirme Chimeric DNA dizisi oluşturmak için

  1. Kadar 50 µL PCR reaksiyon chimera ayrı bileşenlerinin sigorta için ayarlayın. 3.1, N-terminal ve C-terminal astar ile birlikte 10 istihdam ayrıntılı aynı adımları izleyin ng her DNA'ın parçaları içinde elde edilen adım 3.7.
    Not: PCR reaksiyon akşam ayarla ve gecede çalıştırın.
  2. 3.2-3.7 yeniden elde etmek ve 30 µL nükleaz ücretsiz su arıtılmış DNA parçası ölçmek için adımları yineleyin. Bu parçası terminal astar dahil kısıtlama siteleri tarafından çevrili chimeric DNA dizisi içerir.

5. Chimeric DNA içine ekleme bir ifade vektör

  1. Etiket iki 1.5 mL microfuge tüpler ve damlalıklı sırayla farklı reaktifleri 1 µg seçili ifade ekleme Tablo 4' te gösterilen bir tüp ve diğer kurtarılan DNA parçasının 1 µg vektör. 1-4 h 37 ° C'de seçilen enzimleri ile sindirim gerçekleştirmek için kuluçkaya.
    Notlar: Her iki enzimleri istihdam arabellek ile uyumlu olduğundan emin olun. -Dibi takdirde onlar tamamen farklı arabellekleri gerektirir, bu adımları ilk enzimler yalnızca birini gerçekleştirmeniz ve tekrarlayın. Sindirim seçili enzimleri bağlı olarak değişebilir için gereken süre: detaylı bilgi için üreticinin yönergelerine başvurun.
  2. Arındırmak ve sindirilmiş DNA parçası ve ifade vektör 30 µL nükleaz ücretsiz su içinde yeniden elde etmek için 3.2 3.7 adımları yineleyin. Daha önce olduğu gibi kurtarılan DNA miktarını ölçmek.
  3. 3:1 Ekle/vektör molar oranı ligasyonu reaksiyon için gerekli Ekle DNA aşağıdaki denklemi kullanarak tutarını hesaplar.

    Ekle (ng) Molar oranı = * vektör (ng) * (bp) boyutu eklemek / vektör boyutu (bp)

    Not: genellikle 3:1 oranında yeterli sonuçları elde etmek yeterli olsa da farklı Ekle/vektör molar oranları, test edilebilir.
  4. Bir 1.5 mL microfuge tüp ligasyonu tepki 20 µL 40 ile kurmak ng ifade chimeric DNA adım 5.3, arabellek ve Tablo 5' te belirtilen sipariş takip T4 DNA ligaz hesaplanan miktarı vektör ve gecede 16 ° C'de kuluçkaya
    Not: Tüp ligasyonu verimliliği genellikle reaksiyon gecede 16 ° C'de gerçekleştirerek artmış ama alternatif olarak tepki için 2 h oda sıcaklığında inkübe.
  5. 5-10 µL kimyasal olarak yetkili Escherichia coli (e.coli) içine tüp ligasyonu karışımı standart protokoller24 Grow seçimi tabak içinde takip hazırlanan ve tek kolonileri genişleme ve plazmid DNA örneği almak için seçin dönüştürme yalıtım göre kurulan iletişim kuralları25.
    Not: E. coli XL1-mavi zorlanma bu iletişim kuralı için istihdam edildi, ancak diğer E. coli türevleri de kullanılabilir.
  6. Adım 5.1 konusunda belirtilen talimatları izleyerek uygun enzimleri ile izole plazmid 1 µg sindirmek ve DNA grubu tarafından bir özel jel elektroforez chimeric dizisine karşılık gelen bir boyutta varlığını değerlendirmek (bkz: adımlar 3.2-3.5).
    Not: Eklenen sıra bir DNA sıralama hizmet aracılığıyla doğrulanır önerilir.
  7. Başarılı sıra doğrulama plazmid daha büyük miktarlarda üretilen ve bir memeli ifade sisteminde aşağıdaki köklü protokolleri26,27tarafından istihdam.

Sonuçlar

İnşaat ve üretimi chimeric protein (Şekil 1) örneği iki üyesi interlökin-6 sitokin aile ile OSM ve LIF, kısa bir süre önce çalışma6konuydu. Şekil 2 bu proteinler üç boyutlu yapısını gösterir. Her iki molekül ben sitokinler, dört sarmal (A-D olarak adlandırdığı) ile bir paket içinde paketlenmiş ve döngüler28tarafından katıldı sınıfının karakteris...

Tartışmalar

Chimeric proteinlerin üretimi sitokin reseptör bağlayıcı etki alanları13modüler gibi adres sorular için kesilmiş proteinler sınırları ötesine gitmek mümkün olan bir çok yönlü teknik kabul ettiğiniz anlamına gelir. Chimeras tasarım çalışmaları bu tür önemli bir adımdır ve dikkatli bir değerlendirme gerektirir. Daha küçük değişiklik, değişken uzunlukta tek bir bölgeye ayrıntılı çalışmalar için daha uygun olmakla birlikte işlevsel etki alanları kurmak i?...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser Max Planck toplum ve Schüchtermann klinik (Bad Rothenfelde, Almanya) tarafından desteklenmiştir. Bu araştırmanın bir parçası ilk biyolojik Kimya Dergisi yayımlandı. Adrian Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, s., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. AB döngü ve D-helix bağlama site III insan Oncostatin M (OSM) OSM reseptörü harekete geçirmek için gereklidir. J. Biol. kimyasalları 2018; 18:7017-7029. © yazarlar.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Labcycler thermocyclerSensoquest011-103Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol
NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometerThermoFisher ScientificND-2000C DNA quantification
GeneRuler 100 bp DNA ladderThermoFisher ScientificSM0241
GeneRuler DNA Ladder MixThermoFisher ScientificSM0331
AscI restriction enzymeNew England BiolabsR0558
PacI restriction enzymeNew England BiolabsR0547
Phusion Hot Start II DNA PolymeraseThermoFisher ScientificF-549S
dNTP set (100 mM)Invitrogen10297018
T4 DNA ligasePromegaM1804
NucleoSpin Gel and PCR clean-up kitMacherey-Nagel740609
MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stockThermoFisher ScientificMHS6278-202857165
LE agaroseBiozym840004
PrimersSigma-AldrichCustom order
Human Oncostatin M cDNAGift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital Würzburg, Germany) 
pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sitesGift of Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany)

Referanslar

  1. Huising, M. O., Kruiswijk, C. P., Flik, G. Phylogeny and evolution of class-I helical cytokines. The Journal of Endocrinology. 189 (1), 1-25 (2006).
  2. Brocker, C., Thompson, D., Matsumoto, A., Nebert, D. W., Vasiliou, V. Evolutionary divergence and functions of the human interleukin (IL) gene family. Human Genomics. 5 (1), 30-55 (2010).
  3. Bravo, J., Heath, J. K. Receptor recognition by gp130 cytokines. The EMBO Journal. 19 (11), 2399-2411 (2000).
  4. Schneider, G., Fechner, U. Computer-based de novo. design of drug-like molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (8), 649-663 (2005).
  5. Heydenreich, F. M., Miljuš, T., Jaussi, R., Benoit, R., Milić, D., Veprintsev, D. B. High-throughput mutagenesis using a two-fragment PCR approach. Scientific Reports. 7 (1), 6787 (2017).
  6. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T., Pöling, J. The AB loop and D-helix in binding site III of human Oncostatin M (OSM) are required for OSM receptor activation. The Journal of Biological Chemistry. 293 (18), 7017-7029 (2018).
  7. Wang, Y., Pallen, C. J. Expression and characterization of wild type, truncated, and mutant forms of the intracellular region of the receptor-like protein tyrosine phosphatase HPTP beta. The Journal of Biological Chemistry. 267 (23), 16696-16702 (1992).
  8. Lim, J., Yao, S., Graf, M., Winkler, C., Yang, D. Structure-function analysis of full-length midkine reveals novel residues important for heparin binding and zebrafish embryogenesis. The Biochemical Journal. 451 (3), 407-415 (2013).
  9. Kim, K. -. W., Vallon-Eberhard, A., et al. In vivo structure/function and expression analysis of the CX3C chemokine fractalkine. Blood. 118 (22), 156-167 (2011).
  10. Chollangi, S., Mather, T., Rodgers, K. K., Ash, J. D. A unique loop structure in oncostatin M determines binding affinity toward oncostatin M receptor and leukemia inhibitory factor receptor. The Journal of Biological Chemistry. 287 (39), 32848-32859 (2012).
  11. Aasland, D., Schuster, B., Grötzinger, J., Rose-John, S., Kallen, K. -. J. Analysis of the leukemia inhibitory factor receptor functional domains by chimeric receptors and cytokines. Biochemistry. 42 (18), 5244-5252 (2003).
  12. Hermanns, H. M., Radtke, S., et al. Contributions of leukemia inhibitory factor receptor and oncostatin M receptor to signal transduction in heterodimeric complexes with glycoprotein 130. Journal of Immunology. 163 (12), 6651-6658 (1999).
  13. Kallen, K. J., Grötzinger, J., et al. Receptor recognition sites of cytokines are organized as exchangeable modules. Transfer of the leukemia inhibitory factor receptor-binding site from ciliary neurotrophic factor to interleukin-6. The Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11859-11867 (1999).
  14. Gibrat, J. F., Madej, T., Bryant, S. H. Surprising similarities in structure comparison. Current Opinion in Structural Biology. 6 (3), 377-385 (1996).
  15. Madej, T., Lanczycki, C. J., et al. MMDB and VAST+: tracking structural similarities between macromolecular complexes. Nucleic Acids Research. 42, 297-303 (2014).
  16. Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. Announcing the worldwide Protein Data Bank. Nature Structural Biology. 10 (12), 980 (2003).
  17. Biasini, M., Bienert, S., et al. SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information. Nucleic Acids Research. 42, 252-258 (2014).
  18. Bordoli, L., Kiefer, F., Arnold, K., Benkert, P., Battey, J., Schwede, T. Protein structure homology modeling using SWISS-MODEL workspace. Nature Protocols. 4 (1), 1-13 (2009).
  19. Maglott, D. R., Katz, K. S., Sicotte, H., Pruitt, K. D. NCBI's LocusLink and RefSeq. Nucleic Acids Research. 28 (1), 126-128 (2000).
  20. Sievers, F., Wilm, A., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Molecular Systems Biology. 7, 539 (2011).
  21. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
  22. Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
  23. Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation and Transformation of Competent E. coli Using Calcium Chloride. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  24. Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS: Minipreparation. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  25. Green, M. R., Sambrook, J. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with Sodium Dodecyl Sulfate: Maxipreps. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), 093351 (2018).
  26. Hopkins, R. F., Wall, V. E., Esposito, D. Optimizing transient recombinant protein expression in mammalian cells. Methods in Molecular Biology. 801, 251-268 (2012).
  27. Wang, X., Lupardus, P., Laporte, S. L., Garcia, K. C. Structural biology of shared cytokine receptors. Annual Review of Immunology. 27, 29-60 (2009).
  28. Deller, M. C., Hudson, K. R., Ikemizu, S., Bravo, J., Jones, E. Y., Heath, J. K. Crystal structure and functional dissection of the cytostatic cytokine oncostatin. Structure. 8, 863-874 (2000).
  29. Huyton, T., Zhang, J. -. G., et al. An unusual cytokine:Ig-domain interaction revealed in the crystal structure of leukemia inhibitory factor (LIF) in complex with the LIF receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12737-12742 (2007).
  30. Oezguen, N., Kumar, S., Hindupur, A., Braun, W., Muralidhara, B. K., Halpert, J. R. Identification and analysis of conserved sequence motifs in cytochrome P450 family 2. Functional and structural role of a motif 187RFDYKD192 in CYP2B enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 283 (31), 21808-21816 (2008).
  31. Wong, A., Gehring, C., Irving, H. R. Conserved Functional Motifs and Homology Modeling to Predict Hidden Moonlighting Functional Sites. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 82 (2015).
  32. McDowell, D. G., Burns, N. A., Parkes, H. C. Localised sequence regions possessing high melting temperatures prevent the amplification of a DNA mimic in competitive PCR. Nucleic Acids Research. 26 (14), 3340-3347 (1998).
  33. Mamedov, T. G., Pienaar, E., et al. A fundamental study of the PCR amplification of GC-rich DNA templates. Computational Biology and Chemistry. 32 (6), 452-457 (2008).
  34. Park, J., Throop, A. L., LaBaer, J. Site-specific recombinational cloning using gateway and in-fusion cloning schemes. Current Protocols in Molecular Biology. 110, 1-23 (2015).
  35. Bitinaite, J., Rubino, M., Varma, K. H., Schildkraut, I., Vaisvila, R., Vaiskunaite, R. USER friendly DNA engineering and cloning method by uracil excision. Nucleic Acids Research. 35 (6), 1992-2002 (2007).
  36. Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  37. Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro. to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
  38. Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. BioTechniques. 43 (3), 354-359 (2007).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyokimyasay 143Chimeric proteinleryap sal benzerlikmolek ler biyolojist ste PCRyap fonksiyon analizprotein etki alanlarprotein protein etkile imleriprotein ba lama zellikleri

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır