Materialbildung von Rekombinanten Spider-Seiden durch wässrige Lösung mit Wärme und Druck

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Herstellung wasserlöslicher rekombinanter Spinnenseidenproteinlösungen und der aus diesen Lösungen entstandenen Materialformen vor.

Zusammenfassung

Viele Spinnen produzieren sieben Seidenarten. Sechs der Seiden sind in Form, wenn sie von den Spinnen hergestellt werden. Diese Fasern sind nicht wasserlöslich. Um die bemerkenswerten mechanischen Eigenschaften von Spinnenseiden zu reproduzieren, müssen sie in heterologischen Hosts hergestellt werden, da Spinnen sowohl territorial als auch kannibalistisch sind. Die synthetischen Analogien von Spinnenseide sind auch in wässrigen Lösungen unlöslich. So ist ein großer Teil der Forschung an rekombinanten Spinnenseiden auf organische Lösungsmittel angewiesen, die sich nachteilig auf die großflächige Produktion von Materialien auswirken. Die Methode unserer Gruppe zwingt die Lösung dieser rekombinanten Spinnenseiden ins Wasser. Bemerkenswert ist, dass, wenn diese Proteine mit dieser Methode der Wärme und des Drucks hergestellt werden, eine breite Palette von Materialformen aus der gleichen Lösung rekombinanter Spinnenseidenproteine (rSSp) hergestellt werden kann, darunter: Folien, Fasern, Schwamm, Hydrogel, Lyogel und Klebstoffe. Dieser Artikel zeigt die Produktion der gelösten RSSp und Materialformen in einer Weise, die leichter zu verstehen ist als aus schriftlichen Materialien und Methoden allein.

Einleitung

Spiderseide haben das Interesse der Materialwissenschaftler für ihre beeindruckende Kombination aus Festigkeit, Elastizität und Bioverträglichkeit geweckt. Die Neuaufnahme von Fasern ist traditionell der Tenor der Forschung. Diese Anstrengung wurde durch die rekombinante Spinnenseidenprotein (RSSp) Unlöslichkeit im Wasser sowie die Unfähigkeit der traditionellen Lösungstechniken (Chaotropen und Waschmittel), eine wässrige Lösung zu erreichen, behindert. Darüber hinaus funktionieren Techniken, die für lösende Versionen von rSSp entwickelt wurden, nicht an allen rSSp-Varianten und erfordern auch umfangreiche Manipulationen und Zeit, die oft zu Proteinverlust 1^,2führen. Dies hat zum großen Teil dazu geführt, dass das Feld 1, 1, 1, 3, 3 hexafluoroisopropanol (HFIP) als Lösungsmittel zur Bildung von Fasern und anderen begrenzten Materialformen verwendet. Der Vorteil besteht darin, dass alle bekannten rSSp in HFIP löslich sind und eine Dateneinheitlichkeit zwischen den einzelnen Forschungsgruppen bieten. Der Nachteil ist, dass HFIP ein giftiges Lösungsmittel ist, das teuer und aus gesundheitlichen Gründen und aus Umweltgründen nicht in der Lage ist, zu skalieren.

Es wurde ein neuartiger Ansatz zur RSSp-Rotation entwickelt, der die technologische Kluft zwischen dem rauen organischen Lösungsmittel HFIP und anderen Techniken überbrückte, die selektiv für die RSSp-Rotation arbeiteten. Die Kombination von spezifischen Heizungen und Drücke wurde auf die Suspensionen von RSSp und Wasser angewendet. Die Ergebnisse waren nahezu 100% Lösungsmittel-und Rückgewinnung des RSSp sowie hohe Proteinkonzentrationen; Aus diesen Formulierungen, die mit HFIP oder anderen organischen Lösungsmitteln 3, 4,^5,6nichtalle erreichbar waren, wurde eine Vielzahl^vonWerkstoffformen^ermittelt,^ummöglich zu sein. Ziel dieses Ansatzes ist es, gereinigte und getrocknete rekombinante Spinnenproteine effizient und einfach in einer wässrigen Lösung zu lösen, die dann für die Herstellung einer Vielzahl von Materialformen genutzt werden kann.

Fasern, Folien, Beschichtungen, Klebstoffe, Hydrogele, Litogen, Mikrosphären und Schwammmaterialien sind mit dieser Methode aus der gleichen wässrigen RSSp-Lösung problemlos zu erreichen. Die weitere Entwicklung dieser Methode, nicht nur mit zusätzlichem RSSp, sondern auch mit anderen Proteinen, könnte zu neuen Materialformen und alternativen Möglichkeiten der Proteinreinigung und-lösung führen.

Protokoll

1. Rekombinante Seidenmischung aus lyophilisierten Proteinvorräten

1. Bestimmen Sie die für die beabsichtigten Materialformationen erforderlichen Formulierungen und Volumen. Typische Formulierungen reichen von 3% (w/v) bis zu 15% (w/v). Mit dieser Auswahl berechnen Sie die passende RSSp, Konzentrationen und Verhältnisse.
   1. Verwenden Sie die folgenden entsprechenden Formulierungen, um jedes Material vorzubereiten, das in diesem Protokoll beschrieben wird: Hydrogels/sponges/lyogels, 6% (w/v) 50:50 MaSp1:MaSp2; Films/Beschichtungen, 5% (w/v) 80:20 MaSp1:MaSp2; Klebstoffe, 12% (w/v) 50:50 MaSp1:MaSp2; Fasern, 12,5% (w/v) 80:MaSp1:MaSp2.
      Achtung: Auch wenn die meisten Rezepturen besser für bestimmte Formen und Materialien geeignet sind, gibt es eine Vielzahl von Formulierungen, die sich oft überschneiden können. Darüber hinaus können die endgültigen RSSp-Materialien auch bei der Bildung und Verarbeitung auf die gewünschten Eigenschaften zugeschnitten werden. In der Regel muss jedes Protein untersucht werden, welche Parameter angemessen oder nützlich sind.
2. Wählen Sie eine saubere und neue 8 mL autoklavable Borosilikat-Glaskultur mit Gummi-Schraubkappe.
3. Entfernen Sie die Kappe und legen Sie die leere Ampulle auf eine analytische Balance. Die Masse der leeren Ampullen so zu erkleiden, dass das Gleichgewicht null Masse liest.
4. Fügen Sie für jedes einzelne Material das gewünschte lyophilisierte RSSp-Pulver in die leere Ampulliere.
   1. Verwenden Sie diese spezifischen Massen jeder Proteinsorte für jedes Material, wenn Sie eine 2 ml Lösung vorbereiten: Hydrogels/sponges/-Liogels, 60 mg MaSp1 und 60 mg MaSp2; Films/Lackierungen, 80 mg MaSp1 und 20 mg MaSp2; Klebstoffe, 120 mg MaSp1 und 120 mg MaSp2; Fasern, 200 mg MaSp1 und 50 mg MaSp2.
5. Fügen Sie der Ampulere, die bereits die gewichteten RSSp-Pulver enthält, die gewünschte Menge ultrareines Wasser, mindestens 2 ml, hinzu.
   Hinweis: Für alle Lösungsvorgänge wird ein minimales Volumen von 2 mL empfohlen.
6. Die Ampelkappe versiegelt und den Inhalt mit einem brisanten Wirbel überziehen, um eine zerstreute und homogene RSSp-Mischung zu erzeugen, die nun für den Lösungsvorgang bereit ist. Zusätzliche Homogenisierungsansätze wie Schalldeinigung oder Laufradmischung können mit oder zusätzlich mit der Wirbelmischung eingesetzt werden.

2. Rekombinant Spinnenseide löst

CAUTION: Während des Lösungsvorgangs werden hohe Heizungen und Drücke erzeugt. Für diesen Prozess sind richtige persönliche Schutzausrüstung, insbesondere Brillen, lange Ärmel und hitzebeständige Handschuhe erforderlich.

1. Führen Sie eine abschließende Überprüfung der Ampullen oder Gefäße durch, um sicherzustellen, dass sie fest und sicher festgezogen wurde. Anschließend das aufgehängte RSSp-Gemisch auf einen herkömmlichen Mikrowellenherd übertragen.
   Hinweis: Mikrowelleneinheiten im Leistungsbereich von 700 bis 1.500 Watt, die über kleinere interne Kammerkapazitäten verfügen, und rotierende Plattformen werden empfohlen, um bessere Lösungsbedingungen zu bieten.
2. Beginnen Sie den Betrieb der Mikrowelle mit 5 s platzt bei voller Leistung. Nach jedem Einbruch kurz die Tür öffnen und vorsichtig mischen Sie die Vial, um zu verhindern, dass sich die aufgehängte Mischung.
3. Wiederholen Sie diesen Mikrowellen-Prozess, bis das Gemisch and/oder die Lösung eine Temperatur von mindestens 130 ° C erreicht hat, wenn sie mit einem Infrarot-Thermometer direkt mit der Lösung gemessen wird, die Teile der Ampullen enthält. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle festen Partikel vollständig aufgelöst sind und nicht mehr sichtbar sind.
   Hinweis: Es wird empfohlen, die Ampulle und die Lösung gelegentlich abkühlen zu lassen, besonders wenn die Formulierung eine hohe RSSp-Konzentration hat. Temperaturen von über 200 ° C erhöhen das Risiko eines Ampelversagens. Besonderes Augenmerk muss auch darauf gelegt werden, dass die überhitzte Mixture/Lösung die Dichtung berührt, was auch zu einem Ampeleindämmungsausfall führt.
4. Nach erfolgreichem Ablösen des RSSp-Gemisches in eine Lösung lassen Sie die Temperatur der Lösung und die Ampelkappe unter 100 ° C (Siedepunkt) vor dem Öffnen abkühlen.

3. Hydrogels

1. Bereiten Sie ein Hydrogel aus der Lösung, nachdem Sie es aus der Mikrowelle entfernt und es abkühlen und setzen lassen. Das Hydrogel in bestimmte Geometrien geben, bevor es vollständig abkühlen kann.
   Hinweis: Verschiedene rSSps benötigen eine Vielzahl von Zeiten, um zu einem Hydrogel überzugehen. So bilden beispielsweise MaSp2-ähnliche Sequenzen im Vergleich zu MaSp1-ähnlichen Sequenzen eher schneller Hydrogele. Proteinkonzentrationen, Salzgehalt und pH-Wert wirken sich auch direkt auf die Übergangsquote zu einem Hydrogel aus.

4. Sponges

1. Bereiten Sie einen RSSp-Swamm vor, indem Sie zuerst die primäre lösbare Lösung zu einem Hydrogel bilden.
2. Das Hydrogel in ein Wasserbad legen, dieses Bad in den Gefrierschrank-20 ° C legen und warten, bis das Bad vollständig eingefroren ist.
3. Vervollständigen Sie den Schwammbildungsprozess, indem Sie das gefrorene Hydrogel und das Wasserbad aus dem Gefrierschrank entfernen und bei 25 ° C tauen. Der daraus resultierende Schwamm kann nun aus dem aufgetauten Wasser entfernt werden.

5. Lyogel

1. Bereiten Sie ein RSSp-Lyogel vor, indem Sie direkt ein geformtes Hydrogel, entweder mit oder ohne Wasserbad, einfrieren und die gefrorene Hydrogelprobe auf einen Lyophilisator (Gefriertrockner) übertragen.
2. Entfernen Sie das endgültige lyophilisierte Gel-Material aus dem Gefäß, in dem die Feuchtigkeitssublimation auftrat.

6. Folien und Beschichtungen

1. Verwenden Sie eine der drei folgenden Methoden: Lösungsguss, Lösungspilung oder Tauchbeschichtung zur Herstellung von Folien oder Beschichtungen von rSSp.
   1. Die lösbare Seidenlösung auf die PDMS-Formen der gewünschten Form legen.
   2. 200 μL der Folienlösung gießen und verteilen und trocknen lassen, bevor sie das PDMS-Substrat zum Testen oder zur Behandlung abschallen.
   3. Nachdem diese getrocknet werden können, entfernen Sie die geformten Folien für die mechanische Prüfung oder nach der Behandlung der Folien, um die mechanischen Eigenschaften zu verbessern.
2. Zur Herstellung einer Beschichtung oder einer Folie, die nicht aus dem Substrat entfernt werden kann, verwenden Sie entweder Spray oder Dip-Beschichtung, um eine dünne Folienschicht zu erzeugen.
   Hinweis: Um die Anhand zu sprühen, hat dieses Protokoll mit einem Master Airbrush Modell Lacksprayer Erfolg gefunden.
   1. Eine Dip-Beschichtung bilden, indem Sie einfach das Untergrund der Wahl in den lösubilisierten RSSp eintauchen und nach dem Trocknen wiederholen, um die gewünschte Dicke zu erreichen.
   2. Führen Sie vor dem Auftragen eines Tauchwells einen ersten Spritzmantel durch, um die Konsistenz und Wirksamkeit der Endschicht zu erhöhen.

7. Klebstoffe

Achtung: Die Bildung von Klebstoffen wird durch eine der folgenden Methoden erreicht.

1. Fügen Sie den lösungrigen RSSp direkt auf ein Substrat und tragen Sie dann ein zweites Substrat über die Oberseite der Lösung auf. Die Teile fest zusammenklemmen und dann in einem Backofen mit einer Minimaltemperatur von 25 ° C für mindestens 16 Stunden trocknen.
2. Alternativ können die beiden Substratoberflächen mit einer Sprühschicht besprüht und dann die Substrate zusammengeklemmt werden.
3. Das Auftragen des RSSp durch die Dip-Methode der Beschichtung der Substrate und das Aufkleben der Substrate können auch zur Vorbereitung und Klebung verwendet werden.

8. Nassgesponnen-Fasern

1. Die lösungläubige Dope-Lösung mit der Luer-Lok-Spitze durch eine 19 G-Gleichnadel in eine konzentrische Spritze laden. Luft sprengen und die Dope am Luer-Lok am Ende der Spritze sitzen lassen.
2. Fügen Sie mindestens 25 mm PEEK-Schläuche mit einem internen Durchmesser von 0,01 Zoll in die einteiligen Finger-Armaturen für den Zoll 4-Zoll-OD und 10/32 Kegel ein. Befestigen Sie diese Passform an einem PEEK-Schlauch an Luer-Lok-Adapter.
   1. Ersetzen Sie die 19-Spurnadel mit dieser Einstellung auf die geladene Spritze.
3. Füllen Sie ein großes, klares Glasbad mit 99% reinem Isopropanol, um es für das Gerinnungsbad zu verwenden.
   1. Füllen Sie die Stretchbäder, die sich unterhalb der Stretchkate befinden. Diese werden 80:20 Isopropanol haben: Destilliertes Wasser im ersten Stretchbad, und 20:80 Isopropanol: Destilliertes Wasser im zweiten Stretchbad.
4. Stellen Sie das Stotet-Stretchsystem so ein, dass der erste Godet nach dem Gerinnungsbad und der erste Godet im ersten Stretchbad mit der gleichen Geschwindigkeit rotieren.
   1. Initiieren Sie die erste Strecke, indem Sie die Geschwindigkeiten des letzten Godet im Stretchbad 1, dem mittleren oberen Godet, und dem ersten Godet im Stretchbad 2 auf die gleiche Geschwindigkeit einstellen. Diese Geschwindigkeit wird 2x so schnell sein wie die anfängliche Faserentfernungsgeschwindigkeit.
   2. Initiieren Sie den zweiten Streckenabschnitt, indem Sie die Geschwindigkeiten des letzten Godet im Stretchbad 2, dem letzten oberen Godet und dem Wickler auf die gleiche Geschwindigkeit einstellen. Diese Geschwindigkeit wird 2x so schnell sein wie die Geschwindigkeit, die für die erste Strecke verwendet wird, oder 4x die anfängliche Faserentfernungsgeschwindigkeit.
   3. Nitrilhandschuhe an die Außenseite der Zwischengottes legen, um das Verrutschen der Faser zu verhindern.
5. Beginnen Sie langsam, die Lösung in das Gerinnungsbad zu extrudieren. In einem automatisierten System stellen Sie die Extrusionsrate auf eine Entfernungsgeschwindigkeit von 10 mm/.
   1. Lassen Sie die Faserextrusion gleichmäßig werden, bevor Sie die Fasern mit einem dünnen Metallhaken oder Zangen aus dem Bad ziehen. Überprüfen, ob die Faser aus dem Bad entfernt wurde, wurde eine Schleife zwischen der PEEK Schlauchspitze und Pfad der Faser, die das Bad verlassen.
6. Führen Sie die abgeholte Faser durch die Reihe von Götteln so, dass die Faser in den Stretchbädern untergetaucht ist, aber in der Luft zwischen den Stretchbädern trocknet und bevor sie auf eine Spule geht. Diese Trocknung wird durch die höher platzierten Zwischengottesdienststellen erreicht.
   Hinweis: Die Faserentfernungsrate und/oder die Extrusionsrate müssen auf der Grundlage der Proteinkonzentration, der Zusatzstoffe und des Proteintyps angepasst werden, um eine ausreichende Gerinnungszeit zu ermöglichen, ohne Fasern auf dem Boden des Gerinnungsbades zu bündeln.
7. Befestigen Sie die voll gestreckte Faser mit Klebeband an der Spule.

Ergebnisse

Aus der beschriebenen Methode der Lösungsmethode von rSSp lassen sich eine Vielzahl von Materialformen erzielen, wie in Abbildung1 zu sehen ist. Die Methode der Lösungsmittellösung besteht darin, Wärme und Druck, die durch eine herkömmliche Mikrowelle erzeugt werden, auf eine Aufhängung von RSSp und Wasser zu verwenden. Wenn kritische Temperaturen und Drücke erreicht werden, wird sich das Protein lösen. Aus dieser lösungsgeschichteten RSSp-Lösung we...

Diskussion

Nachdem rekombinante Spinnenseidenproteine gereinigt sind, müssen sie dann in einer Lösung hergestellt werden, die zur Materialbildung eingesetzt werden kann. Durch die Mischung von lyophilem Spinnenseidenprotein mit Wasser und die Exposition dieser Mischung der Mikrowellenbestrahlung, um Wärme und Druck zu erzeugen, ist es möglich, eine RSSp-Lösung vorzubereiten. Aus dieser einfachen und effizienten Methode der RSSp-Solubilisierung lassen sich eine Vielzahl von Materialformen herstellen. Jedes Material muss individ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mL Syringe with Luer-Lok Tip	BD	309657	Other size syringes can be used but to keep the tips on, it is advised to use luer-lok tips
4 mL culture vial, clear with rubber lined cap	Wheaton	225142	Minimum dope volume is 1mL, max is 2mL
8 mL culture vial, clear with rubber lined cap	Wheaton	225144	Minimum dope volume is 2mL, max is 4mL
99% Isopropyl Alcohol, Reagent ACS/USP Grade	Pharmco-Aaper	231000099
Freezone 4.5 Plus	Labconco	7386030	Freeze Dryer
Luer Adapter Female Luer x 10-32 Female, Tefzel (ETFE)	IDEX	P-629
Microwave	Magic Chef	HMD1110B	120V, 60Hz AC; 1000 watts; 1.1 cu. ft. capacity; with glass turn table
One-Piece Fingertight 10-32 Coned, for 1/16" OD	IDEX	F-120X
PEEK Tubing 1/16" OD x 0.010" ID	IDEX	1531B
Sprayer: Master Airbrush	Master Airbrush	TC-60