Electroforesis de DNA utilizando naranja de tiazol en lugar de bromuro de etidio o tintes alternativos

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para utilizar tiazol naranja para la detección de ADN en experimentos de electroforesis de gel. El uso de naranja de tiazol permite eliminación de bromuro de etidio, y se logra la detección de la fluorescencia con luz azul o UV.

Resumen

Electroforesis en gel de DNA utilizando agarosa es una herramienta común en laboratorios de biología molecular, permitiendo la separación de fragmentos de ADN por tamaño. Después de la separación, ADN es visualizado por la coloración. Este artículo muestra cómo utilizar tiazol naranja para teñir ADN. Naranja de tiazol compara favorablemente a los métodos de tinción común, que es sensible, barato, excitable con UV o luz azul (para evitar el daño de la muestra) y más seguro que el bromuro de etidio. Laboratorios equipados ya para ejecutar experimentos de electroforesis de ADN con bromuro de etidio pueden cambiar generalmente tintes sin cambios adicionales a los protocolos existentes, utilizando luz ultravioleta para la detección. Además, detección de luz azul para evitar el daño de la muestra se logra con un filtro de la fuente y emisión de luz azul. Laboratorios ya equipados para la detección de luz azul pueden cambiar simplemente tintes sin cambios adicionales a los protocolos existentes.

Introducción

El propósito de este método es identificar ADN en geles de agarosa utilizando tiazol naranja (a) para la detección de fluorescencia. Debido a su perfil de seguridad favorable y bajo costo, naranja de tiazol puede ver beneficio particular en los laboratorios de docencia de pregrado y laboratorios de investigación realizar biología molecular, especialmente trompas y clonación.

Bromuro de etidio queda el tinte más común para la detección de ADN en geles de agarosa. Esto es principalmente porque se puede obtener muy poco costosa y sólo requiere excitación con luz UV para la detección. Ambos etidio bromuro y tiazol naranja son baratos, con baja detección de límites (1-2 ng/carril)¹. Hay dos principales inconvenientes a bromuro de etidio naranja de tiazol mejora.

En primer lugar, bromuro de etidio es un mutágeno² especiales de manejo, envío y requisitos de la disposición, mientras que el naranja de tiazol es menos mutagénico (3 – 4 x menos mutagénicos en la prueba de Ames)^3,4 y pueden eliminarse generalmente de con residuos químicos comunes.

En segundo lugar, bromuro de etidio requiere luz UV para la detección. Naranja de tiazol semejantemente puede usar luz UV si se desea, pero también puede ser detectada con luz azul. Luz UV, mientras que comúnmente utilizado, tiene algunas desventajas salientes. En primer lugar, es dañino a los ojos y la piel humana. Mientras que la luz UV puede ser utilizada con seguridad por profesionales capacitados, piel o los ojos daños accidentales (funcionalmente similar a las quemaduras de sol) de la luz UV de laboratorio no son infrecuentes particularmente con científicos inexpertos. En segundo lugar, la luz UV es extremadamente perjudicial para el DNA muestras⁵, que reduce el éxito de posteriores experimentos (como la ligadura y transformación)^1,6,7. A permite la detección con luz azul (λ_{ex, max} = 510 nm (488 nm y 470 nm también muestran excitación fuerte)), que no causa daño a la piel o daño de ADN (aunque cualquier luz intensa todavía puede ser dañoso a los ojos), disminuyendo enormemente los riesgos para ambos el científico y la muestra.

No es la alternativa de colorante fluorescente sólo a bromuro de etidio; su ventaja es el costo. A fue descubierto en la década de 1980 como una mancha de reticulocitos⁸y ha encontrado utilidad en un número de fluorescencia basada en ADN experimentos^{9,10,11,12,13}. Actualmente se vende por varios proveedores. A es el compuesto original de adicional, más caro, azul-luz – detectable tintes comerciales y se comporta de manera similar durante la electroforesis, utilizando luz azul o UV para detección¹. Además, mientras que otros tintes son más sensibles a concentraciones muy bajas de ADN que EtBr o a, para los experimentos de electroforesis genérico, estos tintes son prohibitivos en muchos contextos.

Protocolo

1. preparar el gel

Nota: Para los protocolos de la electroforesis del gel general, ver también P.Y. Lee, et al. ¹⁴.

1. Mezcla de agarosa (~ 1% w/v, porcentaje puede ser variado para separaciones de tamaño) en tampón (aproximadamente 70 mL para un gel mini (8 x 7 cm)). Tampones son comúnmente TAE (pH de tris-acetato-EDTA, 40 mM Tris, acetato de 20 mM, 1 mM EDTA, aproximadamente 8.6) o TBE (pH de tris-borato-EDTA, 90 mM Tris, borato de 90 mM, EDTA 2 mM, aproximadamente 8.3)).
2. Añadir naranja de tiazol a una concentración final de 1.3 μg/mL.
   1. Disolver el tiazol naranja en DMSO para hacer una solución stock de 10.000 x (13 mg/mL). Mientras que no particularmente fotosensible, almacenar a en el oscuro cuando no esté en uso. Esta solución es estable a temperatura ambiente durante ~ meses; almacenamiento a largo plazo puede lograr congelar alícuotas (DMSO se congela en una nevera estándar). No olvide totalmente derretir y resuspender una solución congelada antes de su uso.
      Nota: El gel puede también ser manchado con a después de la electroforesis (ver paso 2.6). Si bien tiene un perfil de seguridad mejorado sobre el bromuro de etidio, seguridad en el laboratorio biología molecular estándar deben mantenerse las precauciones.
3. Microondas la mezcla de agarosa, buffer y tiazol naranja para disolver la agarosa (aproximadamente 60 s). Este paso se conoce comúnmente como "fusión". Remolino (5 s) para facilitar la disolución si es necesario.
   Nota: Para también se puede añadir después de microondas si se prefiere.
4. Deje que la solución de agarosa enfriar brevemente antes de verter en gel aparato de fundición que contiene un peine adecuado.
5. Deje que la solución de agarosa solidifique en un gel.

2. carga y ejecuta el gel

1. Coloque el gel en el aparato de electroforesis si no está ya presente.
2. Añadir el buffer corriente (TAE o TBE como arriba) para cubrir la superficie del gel.
3. Carga de muestras de ADN (comúnmente de 10 μL) usando un colorante de carga. Incluir una escala de tamaño de DNA para referencia.
4. Coloque la tapa y electrodos (se debe ejecutar el gel hacia el ánodo rojo (positivo)).
5. Aplique tensión (típicamente ~ 100V para un mini-gel, aunque el tamaño del gel puede requerir una tensión modificada para no dañar el gel) hasta que carga el tinte ha viajado una distancia apropiada (aproximadamente 4-7 cm para un mini-gel, aunque la distancia puede variar dependiendo aplicación precisa).
   Nota: Como muchos otros tintes de DNA-que atan y bromuro de etidio, naranja de tiazol se carga positivamente. En consecuencia, estos tintes se migran en la dirección opuesta de electrophoresing ADN. Para las muestras que se bajan mucho el gel de separación mayor, finalmente el tinte se separará de los pequeños fragmentos de DNA, dando por resultado la coloración débil. En estos casos, el gel debe ser teñido como en el paso 2.6. Esta situación no es exclusiva de a, cualquier carga positiva tinte que interactúa reversiblemente con la DNA exhibe este comportamiento (incluyendo a bromuro de etidio y otros).
6. Si a no fue agregado antes de gel casting (paso 1.2), sumergiendo el gel en el búfer que contiene naranja de tiazol de la mancha.
   1. Preparar suficiente buffer (TAE o TBE) que contiene 1,3 tiazol μg/mL naranja cubre el gel y remojar el gel con agitación suave hasta que las bandas son totalmente detectado (aproximadamente 20 min).

3. visualización del gel de agarosa naranja de tiazol (transiluminador de UV)

1. Retirar el gel desde el aparato de electroforesis y el lugar en un transiluminador UV.
   PRECAUCIÓN: La luz UV es dañina para la piel y los ojos. Asegúrese de usar la adecuada protección de ojos (gafas) y cara (careta). Las manos deben tener guantes y se debe usar manga larga.
2. Si lo desea, recorte había deseado bandas de ADN desde el gel (para la digestión posterior o ligadura, por ejemplo). Exponer el gel a luz UV para tan brevemente un período de tiempo posible durante la supresión. (Independientemente del tinte de ADN) luz UV daña DNA.
3. Extraer el ADN de la rebanada de gel usando un kit o protocolo disponible¹⁵.

4. visualización del gel de agarosa naranja de tiazol (luz azul transiluminador o linterna)

1. Retirar el gel desde el aparato de electroforesis y el lugar en un transiluminador de luz azul (~ 470 nm emisión máxima longitud de onda). Alternativamente, un LED azul (~ 470 nm) linterna puede orientarse en gel (ya sea desde arriba o abajo).
   Nota: Mientras que la sensibilidad es menor utilizando un transiluminador de luz azul con bromuro de etidio, ADN teñida con bromuro de etidio puede ser detectada mediante este protocolo de luz azul.
2. Utilice un filtro de emisión ámbar (~ 560 nm longpass, gafas o cuadrado) para filtrar la luz azul, lo que permite la visualización de la fluorescencia de complejos de ADN: tiazol naranja.
   Nota: Sin el filtro de emisión ámbar, es muy difícil detectar bandas de ADN debido a la intensidad de la fuente de excitación de luz azul.
   PRECAUCIÓN: Aunque luz azul carece de la capacidad de agudo dañar los tejidos (contrastado UV), prolongados exposición a la luz azul intensa puede dañar los ojos y se debe usar gafas ámbar emisión o filtro.
3. Si lo desea, recorte deseadas bandas de ADN desde el gel para más aplicaciones.
   Nota: Puesto que la luz azul no daña el ADN, no es necesario cortar rápidamente las bandas (como por ejemplo al usar excitación UV en el paso 3.2).
4. Extraer el ADN de la rebanada de gel usando un kit o protocolo disponible¹⁵.

5. captura de la imagen

1. Seleccione ajustes apropiados de excitación y emisión en aparato de proyección de imagen de gel. La excitación y emisión de la naranja de tiazol (λ_{ex, max} = 510 nm (488 nm y 470 nm también muestran fuerte excitación, además de fuerte excitación en longitudes de onda de UV); λ_em = 527 nm) son casi idénticos a los comun comercial azul-luz-perceptible colorantes, por lo que instrumentos pueden tener programadas configuración del filtro que puede ser utilizado.
   Nota: Algunas configuraciones de filtro azul luz – detectables colorantes comerciales realmente usar luz perjudicial UV para la excitación, así que tenga cuidado si la proyección de imagen antes del corte de bandas. Usar una fuente de excitación de luz azul si es posible, cuando bandas de ADN serán suprimidos después de la proyección de imagen.
2. En la ausencia de un sistema de imágenes con filtros adecuados, colocar un filtro ámbar entre la cámara y la fuente de excitación de luz azul/gel.

Resultados

Naranja de tiazol permite la detección de ADN, sin utilizar bromuro de etidio y sin necesidad de utilizar luz UV dañan el ADN. Bromuro de etidio es bien sabido ser mutagénico, para eliminar del laboratorio puede ser ventajoso. La luz UV daña el ADN y disminuye la eficiencia de transformación, mientras que la luz azul no daña el ADN. Límites de detección son similares entre el bromuro de etidio, naranja de tiazol y un tinte de ADN comercial común, azul-luz – detectable (figura 1, v...

Discusión

Bromuro de etidio durante mucho tiempo ha sido una herramienta estándar en el laboratorio de biología molecular, a pesar de toxicidad conocido. Padece también requieren luz ultravioleta, que daña el ADN que se está detectando. Thiazole orange ofrece una alternativa económica a bromuro de etidio, así como tintes comerciales útiles pero costosos.

Los beneficios de la naranja de tiazol son así dos veces. En primer lugar, naranja de tiazol simplemente puede utilizarse como sustitución de...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-log DNA ladder	New England Biolabs	N0469S
Agarose (Genetic Analysis Grade)	Fisher	BP1356-100
Blue-light flashlight	WAYLLSHINE (Amazon)	WAYLLSHINE Scalable Blue LED
ChemiDoc MP	Biorad	1708280
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
ethidium bromide	Fisher	BP1302-10	For comparison, not necessary for protocol
Gel apparatus (Owl Easy Cast)	Thermo Scientific	B1A
Qiagen Qiaquick Gel extraction kit	Qiagen	28704
Safe Imager Viewing Glasses	Invitrogen	S37103	Necessary for using blue light flashlight.*
SafeImager 2.0 (Blue light transilluminator)	Invitrogen	G6600	Blue light flashlight may be used as alternative
SYBR Safe	Invitrogen	S33102	For comparison, not necessary for protocol
TAE (Tris-Acetate-EDTA)	Corning	46-010-CM
Thiazole orange	Sigma-Aldrich	390062
			*Glasses are also included with Invitrogen G6600