JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол тиазол оранжевый для обнаружения ДНК в экспериментах электрофореза геля. Использование тиазол оранжевый позволяет ликвидации бромид ethidium, и флуоресценции обнаружения может быть достигнуто с УФ или синий свет.

Аннотация

Электрофорез геля дна агарозы с помощью является общим инструментом в лаборатории молекулярной биологии, позволяя разделения фрагментов ДНК по размеру. После разделения ДНК является визуализированы пятнать. Эта статья демонстрирует использование тиазол оранжевые пятна ДНК. Тиазол оранжевый выгодно общих пятная методов, в том, что чувствительные, недорогой, возбудимых с УФ или синий свет (во избежание повреждения образца) и безопаснее, чем бромид ethidium. Лаборатории, уже оснащены для запуска ДНК электрофорез эксперименты с использованием бромид ethidium обычно можно переключиться существующих протоколов, с помощью ультрафиолетовый свет для обнаружения красителей без дополнительных изменений. Синий свет обнаружения повреждения образца дополнительно может быть достигнуто с фильтром источника и выбросов синий свет. Лаборатории, уже оборудованные для обнаружения синий свет можно просто переключиться красителей без дополнительных изменений к существующим протоколам.

Введение

Этот метод предназначен для выявления ДНК в гелях агарозы, используя тиазол оранжевый (для) для флуоресценции обнаружения. Из-за его низкой стоимости и благоприятные безопасности профиля тиазола оранжевый может увидеть особую пользу в Бакалавриат учебных лабораторий и исследовательских лабораторий, выполняющих молекулярной биологии, особенно перешнуровок и клонирования.

Бромид ethidium остается наиболее распространенных краситель для обнаружения ДНК в гелях агарозы. Это главным образом потому, что она может быть получена весьма недорого и только требует возбуждения с ультрафиолетовый свет для обнаружения. Обе ethidium бромид и тиазол оранжевый недорогой, с низкой обнаружения пределов (1-2 нг/пер)1. Есть два главных недостатка бромид ethidium, однако, которые тиазол оранжевый улучшает.

Во-первых, бромид ethidium является мутагенным2 с специальной обработки, доставки и удаления требования, тогда как тиазол оранжевый менее мутагенные (3 – 4 x менее мутагенному Эймс теста)3,4 и может быть вообще утилизировать вместе с общие химические отходы.

Во-вторых бромид ethidium требует ультрафиолетовый свет для обнаружения. Тиазол оранжевый при желании также можно использовать УФ-излучения, но также могут быть обнаружены с синим светом. Ультрафиолетовый свет, в то время как широко используется, имеет несколько характерных недостатков. Во-первых это ущерб человеческой кожи и глаз. В то время как ультрафиолета может безопасно использоваться обученными профессионалами, кожи или глаз случайных (функционально похож на солнечных ожогов) от Лаборатория УФ света не являются редкостью особенно с неопытными учеными. Во-вторых ультрафиолета чрезвычайно повреждения ДНК образцов5, что снижает успех течению экспериментов (например, перевязки и трансформации)1,6,7. В позволяет обнаруживать с голубой свет (λex, Макс = 510 Нм (488 нм и 470 Нм также показывают сильного возбуждения)), которая не вызывает повреждения кожи или ДНК повреждения (хотя любой интенсивный свет все еще могут быть вредны для глаз), значительно снижается риск как ученый и образец.

Является не только Люминесцентную краску альтернативой бромид ethidium; его преимуществом является стоимость. ЧТОБЫ был обнаружен в 1980-х как пятно ретикулоцитов8и утилита в ряде на основе ДНК флуоресценции эксперименты9,10,11,12,13. В настоящее время он продается с несколькими поставщиками. Это родительский комплекса дополнительных, более дорогие, синий свет – необнаруживаемых коммерческих красители и ведет себя аналогично во время электрофореза, используя УФ или синий свет для обнаружения1. Кроме того в то время как другие красители более чувствительны к очень низкой концентрации ДНК чем бромистый этидий или к, для универсального электрофорез эксперименты, такие красители являются дорогими во многих контекстах.

протокол

1. Подготовка геля

Примечание: Для общего гель Протоколы электрофореза, смотрите также П.Ю. ли, и др. 14.

  1. Смешайте агарозы (~ 1% w/v, процент может варьироваться для определенного размера Цветоделение) в буфере (примерно 70 мл для мини-гель (8 x 7 см)). Буферы, обычно TAE (tris ацетат ЭДТА, 40 мм трис, ацетат 20 мм, 1 мм ЭДТА, рН около 8,6) или КЭ (tris Борат ЭДТА, 90 мм трис, Борат 90 мм, 2 мм ЭДТА, рН около 8,3)).
  2. Добавьте тиазол оранжевый в конечной концентрации 1,3 мкг/мл.
    1. Растворите тиазол оранжевый в ДМСО сделать Стоковый раствор 10000 x (13 мг/мл). Пока не особенно светочувствительных Храните в темной, когда не в пользе. Это решение является стабильным при комнатной температуре для ~ месяцев; долгосрочного хранения может быть достигнуто путем замораживания аликвоты (ДМСО будет заморозить в стандартный холодильник). Не забудьте полностью расплава и Ресуспензируйте замороженный раствор перед использованием.
      Примечание: Гель может также быть запятнано с TO после электрофореза (см. шаг 2.6). Время имеет улучшенную безопасность профиль над бромид ethidium, стандартные молекулярной биологии лаборатории безопасности меры предосторожности, которые следует сохранить.
  3. Микроволновая печь смесь агарозы, буфера и тиазол оранжевый распустить агарозы (примерно 60 s). Этот шаг обычно именуется как «плавления». Водоворот (5 s) для оказания помощи роспуск, при необходимости.
    Примечание: Чтобы также могут быть добавлены после микроволновой печи, если предпочтительнее.
  4. Дайте раствору агарозы для охлаждения кратко перед заливкой в аппарат литья гель, содержащий соответствующие гребень.
  5. Позвольте затвердеть в гель агарозы решение.

2. Загрузка и запуск гель

  1. Место в аппарате электрофорез геля, если не уже присутствует.
  2. Добавление идущий буфер (ТЭ или КЭ как выше) для покрытия поверхности геля.
  3. Загрузите образцы ДНК (обычно 10 мкл) с помощью загрузки красителя. Включать калибровки лестница ДНК для справки.
  4. Присоедините крышку и электроды (гель следует запустить к красной анода (положительные)).
  5. Применить напряжения (обычно ~ 100В для мини-гель, хотя размер геля может потребоваться изменение напряжения для предотвращения повреждения гель) до тех пор, пока загрузка краситель объездил соответствующее расстояние (около 4-7 см для мини-гель, хотя расстояние может варьироваться в зависимости от точного применения).
    Примечание: Как и бромид ethidium и многие другие ДНК связывающих красители, положительно заряженных тиазол оранжевый. Следовательно эти красители будут мигрировать в противоположном направлении, electrophoresing ДНК. Для образцов, которые выполняются далеко вниз гель для укрепления отделения в конечном итоге краситель отделится от небольших фрагментов ДНК, что приводит к слабой пятнать. В этих случаях гель следует быть окрашены как шаг 2.6. Эта ситуация характерна не только для обеспечения, любой положительно заряженные краситель, который обратимо взаимодействует с ДНК будет демонстрируют такое поведение (включая бромид ethidium, чтобы и другие).
  6. Если для не был добавлен перед гель литья (шаг 1.2), пятна, погружая гель в буфере, содержащий тиазол оранжевый.
    1. Подготовить достаточно буфера (ТЭ или КЭ) содержащие 1,3 мкг/мл тиазол оранжевый полностью покрыть гелем и замочить гель с мягким перемешиванием до полосы являются полностью обнаружено (примерно 20 мин).

3. Визуализация тиазол оранжевый агарозном геле (УФ transilluminator)

  1. Удалите из аппарат для электрофореза и место на transilluminator УФ гель.
    Предупреждение: УФ света повреждения кожи и глаз. Не забудьте надеть соответствующую глаз (очки) и защиты лица (щит). Руки должны иметь Перчатки и должны носить с длинными рукавами.
  2. При желании, вырежьте желаемой диапазоны дна от геля (для дальнейших пищеварение или перевязки, например). Разоблачить гель УФ света для как короткий отрезок времени можно во время обрезания. УФ-излучения (независимо от ДНК краситель) повреждает ДНК.
  3. Извлечь ДНК от геля фрагмента с помощью легко доступных комплект или протокол15.

4. Визуализация тиазол оранжевый агарозном геле (синий свет transilluminator или фонарик)

  1. Удалите гель от аппарат для электрофореза и место на синий свет transilluminator (~ 470 Нм длины волны максимальная выбросов). Кроме того, синий светодиод (~ 470 Нм) фонарик могут быть направлены на гель (либо из выше или ниже).
    Примечание: Хотя чувствительность ниже, используя синий свет transilluminator бромидом ethidium, ДНК, окрашенных бромидом ethidium могут быть обнаружены с помощью этого протокола синий свет.
  2. Используйте фильтр янтаря выбросов (~ 560 Нм longpass, очки или площади) для фильтрации синий свет, позволяя визуализации флуоресценции от комплексов ДНК: тиазол оранжевый.
    Примечание: Без фильтра янтаря выбросов, это очень трудно обнаружить полосы ДНК из-за интенсивности источник возбуждения синий свет.
    Предостережение: Хотя синий свет не хватает способности остро повреждение тканей (контрастные УФ), длительное воздействие интенсивного синего света может повредить глаза и очки янтарных выбросов или фильтр следует использовать.
  3. При желании, вырежьте желаемой ДНК полос от геля для дальнейшего применения.
    Примечание: Так как синий свет не повреждать ДНК, это не необходимо быстро вырезать полосы (например, когда с помощью УФ возбуждения в шаге 3.2).
  4. Извлечь ДНК от геля фрагмента с помощью легко доступных комплект или протокол15.

5. изображения захвата

  1. Выберите соответствующие параметры возбуждения и выбросов в аппарат гель изображений. Возбуждение и выбросов тиазол оранжевый (λex, Макс = 510 Нм (488 нм и 470 Нм также показать сильное возбуждение, помимо сильного возбуждения в ультрафиолетовых длинах волн); λет = 527 Нм) почти идентичны общей синий свет – необнаруживаемых коммерческих красители, поэтому инструменты могут предустановленные настройки фильтра, которые могут быть использованы.
    Примечание: Некоторые настройки фильтра для голубой свет – необнаруживаемых коммерческих красители фактически использовать повреждения УФ-излучения для возбуждения, поэтому следует проявлять осторожность при визуализации до вырезания полос. По возможности используйте источник возбуждения голубой свет, когда ДНК полос будет вырезан после визуализации.
  2. В отсутствие изображений системы с соответствующими фильтрами место желтый фильтр между камерой и источник возбуждения гель/синий свет.

Результаты

Тиазол оранжевый позволяет обнаружение ДНК, без использования бромид ethidium и без использования ДНК повреждения УФ-излучения. Бромид ethidium известный быть мутагенными свойствами, поэтому его ликвидации из лаборатории может быть выгодным. Свет УФ повреждений ДНК и снижает эффективность п?...

Обсуждение

Бромид ethidium уже давно стандартным инструментом в лаборатории молекулярной биологии, несмотря на известные токсичности. Он также страдает от требующих УФ света, который повреждает ДНК, как он определяется. Тиазол orange предлагает недорогой альтернативой бромид ethidium, а также полезные, но ?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана запуска средства для пог от Университет Кристофера Ньюпорта.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2-log DNA ladderNew England BiolabsN0469S
Agarose (Genetic Analysis Grade)FisherBP1356-100
Blue-light flashlightWAYLLSHINE (Amazon)WAYLLSHINE Scalable Blue LED
ChemiDoc MPBiorad1708280
DMSOSigma-AldrichD8418
ethidium bromideFisherBP1302-10For comparison, not necessary for protocol
Gel apparatus (Owl Easy Cast)Thermo ScientificB1A
Qiagen Qiaquick Gel extraction kitQiagen28704
Safe Imager Viewing GlassesInvitrogenS37103Necessary for using blue light flashlight.*
SafeImager 2.0 (Blue light transilluminator)InvitrogenG6600Blue light flashlight may be used as alternative
SYBR SafeInvitrogenS33102For comparison, not necessary for protocol
TAE (Tris-Acetate-EDTA)Corning46-010-CM
Thiazole orangeSigma-Aldrich390062
*Glasses are also included with Invitrogen G6600

Ссылки

  1. O'Neil, C. S., Beach, J. L., Gruber, T. D. Thiazole orange as an everyday replacement for ethidium bromide and costly DNA dyes for electrophoresis. Electrophoresis. 39 (12), 1474-1477 (2018).
  2. McCann, J., Choi, E., Yamasaki, E., Ames, B. N. Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 5135-5139 (1975).
  3. Evenson, W. E., Boden, L. M., Muzikar, K. A., O’Leary, D. J. 1H and 13C NMR Assignments for the Cyanine Dyes SYBR Safe and Thiazole Orange. The Journal of Organic Chemistry. 77 (23), 10967-10971 (2012).
  4. Beaudet, M., Cox, G., Yue, S. . Molecular Probes, Inc. , (2005).
  5. Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutation Research. 571 (1-2), 19-31 (2005).
  6. Cariello, N. F., Keohavong, P., Sanderson, B. J., Thilly, W. G. DNA damage produced by ethidium bromide staining and exposure to ultraviolet light. Nucleic Acids Research. 16 (9), 4157 (1988).
  7. Hartman, P. S. Transillumination can profoundly reduce transformation frequencies. BioTechniques. 11 (6), 747-748 (1991).
  8. Lee, L. G., Chen, C. H., Chiu, L. A. Thiazole orange: a new dye for reticulocyte analysis. Cytometry. 7 (6), 508-517 (1986).
  9. Nygren, J., Svanvik, N., Kubista, M. The Interactions Between the Fluorescent Dye Thiazole Orange and DNA. Biopolymers. , 1-13 (1998).
  10. Svanvik, N., Westman, G., Wang, D., Kubista, M. Light-Up Probes: Thiazole Orange-Conjugated Peptide Nucleic Acid for Detection of Target Nucleic Acid in Homogeneous Solution. Analytical Biochemistry. 281 (1), 26-35 (2000).
  11. Yang, P., De Cian, A., Teulade-Fichou, M. P., Mergny, J. L., Monchaud, D. Engineering Bisquinolinium/Thiazole Orange Conjugates for Fluorescent Sensing of G-Quadruplex DNA. Angewandte Chemie International Edition. 48 (12), 2188-2191 (2009).
  12. Fang, G. M., Chamiolo, J., Kankowski, S., Hovelmann, F., Friedrich, D., Lower, A., Meier, J. C., Seitz, O. A bright FIT-PNA hybridization probe for the hybridization state specific analysis of a C → U RNA edit via FRET in a binary system. Chemical Science. 9 (21), 4794-4800 (2018).
  13. Pei, R., Rothman, J., Xie, Y., Stojanovic, M. N. Light-up properties of complexes between thiazole orange-small molecule conjugates and aptamers. Nucleic Acids Research. 37 (8), e59-e59 (2009).
  14. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), 1-5 (2012).
  15. Vogelstein, B., Gillespie, D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

145ethidium

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены