Ethidium 평범한 사람 또는 대체 염료 대신 Thiazole 오렌지를 사용 하 여 DNA 전기 이동 법

요약

여기, 선물이 젤 전기 이동 법 실험에서 DNA의 검출을 위한 thiazole 오렌지를 사용 하는 프로토콜. Thiazole 오렌지의 사용 ethidium 평범한 사람의 제거를 허용 하 고 형광 탐지 UV 또는 푸른 빛으로 달성 될 수 있다.

초록

DNA 젤 전기 이동 법은 agarose를 사용 하 여 크기에 의해 DNA 파편의 분리를 수 분자 생물학 실험실에서 일반적인 도구입니다. 분리 후 DNA 얼룩에 의해 시각 이다. 이 문서에서는 thiazole 주황색 얼룩을 DNA를 사용 하는 방법을 보여 줍니다. Thiazole 오렌지 비교 호의 일반적인 착 방법, 그것은, 저렴 한, UV 또는 파란 빛 (손상을 방지 하기 위해 샘플), 고르기 민감하고 ethidium 평범한 사람 보다 안전 합니다. 이미 DNA 전기 영동 실험 ethidium 평범한 사람을 사용 하 여 실행을 갖추고 실험실 일반적으로 자외선을 사용 하 여 검색에 대 한 기존 프로토콜을 추가 변경 없이 염료를 전환할 수 있습니다. 블루 빛 감지 샘플의 손상을 방지 하려면 블루 빛 소스와 배출 필터 또한 얻을 수 있습니다. 이미 블루 빛 감지 장비 실험실 단순히 기존 프로토콜 추가 변경 없이 염료를 전환할 수 있습니다.

서문

이 방법의 목적은 agarose 젤 형광 탐지 thiazole 오렌지 (을)를 사용 하 여 DNA를 식별 하는 것입니다. 그것의 저가 및 유리한 안전 프로필로 인해 thiazole 오렌지 학부 교육 연구소 및 분자 생물학, 특히 ligations 및 복제를 수행 하는 연구 실험실에서 특정 혜택을 볼 수 있습니다.

Ethidium 평범한 사람 agarose 젤에서 DNA의 검출에 대 한 가장 일반적인 염료 남아 있습니다. 이 매우 저렴 하 게 얻을 수 있습니다 때문에 주로 하며만 자외선과 여기 검색. 두 ethidium 평범한 사람 및 thiazole 오렌지 낮은 검출 한계 (1-2 ng/레인)¹비싼 되지 않습니다. 그러나 Thiazole 오렌지 시 향상 ethidium 평범한 사람,,에 두 가지 주요 단점이 있다.

첫째, ethidium 평범한 사람은 특수 처리, 운송, 및 처리 요구 사항, 돌연² thiazole 오렌지는 덜 돌연변이 (3-4 x 덜 Ames 시험에서 변이 원 성)^3,4 와 일반적으로 삭제 될 수 있습니다 일반적인 화학 폐기물입니다.

둘째, ethidium 평범한 사람 검색 UV를 빛을 필요합니다. Thiazole 오렌지 바란다면, UV 빛 마찬가지로 사용할 수 있습니다 하지만 또한 푸른 빛으로 검출 될 수 있습니다. UV 빛, 일반적으로 사용 되는 몇 가지 두드러진 단점이 있습니다. 첫째, 그것은 인간의 피부와 눈에 손상 이다. UV 빛은 숙련 된 전문가 의해 안전 하 게 사용할 수 있습니다, 하는 동안 사고 피부 또는 눈 손상 (기능적으로 비슷합니다 sunburns) 실험실 UV 빛에서 미숙한 과학자와 특히 흔히 되지 않습니다. 둘째, 자외선은 DNA 샘플⁵, (결 찰 및 변환) 등 다운스트림 실험^1,,67의 성공을 감소 시키는 매우 파괴적 이다. TO 있습니다 푸른 빛으로 감지 (λ_{전, 최대} 510 = nm (488 nm 및 470 nm도 강한 흥분을 표시))는 피부 손상의 원인이 되지 않습니다, 또는 DNA 손상 (하지만 어떤 강렬한 빛은 여전히 눈에 해로울 수 있습니다), 두 과학자를 위험을 크게 감소 그리고 샘플입니다.

아니다 ethidium 평범한 사람;에 형광 염료 대안 그것의 이점은 비용입니다. Reticulocyte 얼룩⁸, 1980 년대에서 발견 되었다 및 다양 한 형광 DNA 기반 실험^{9,10,11,,1213}에 유틸리티를 발견 했다. 그것은 현재 여러 공급 업체에 의해 판매 됩니다. 추가 하 고, 더 비싼의 부모 화합물, 파랑-빛-감지 상업 염료 이며 탐지¹UV 또는 푸른 빛을 사용 하 여 전기 이동 법 동안 유사 하 게 동작. 또한, 다른 염료 보다 더 민감한 DNA 농도 매우 낮은 EtBr 또는, 일반 전기 실험에 대 한 동안, 같은 염료는 많은 상황에서 엄청나게 비싸다.

프로토콜

1. 젤을 준비

: 일반 젤 전기 이동 법 프로토콜에 대 한 참고 또한 P.Y.이, 외 알. ¹⁴.

1. Agarose를 혼합 (~ 1 %w / v, 비율 특정 크기 분판 변화 될 수 있다) 버퍼 (미니 젤 (8 x 7 cm) 약 70 mL). 버퍼는 일반적으로 태 (40 mM Tris, 20mm 아세테이트, 트리 스-아세테이트-EDTA, 1 m m EDTA, pH 약 8.6) 또는 TBE (90mm 트리 스, 90mm borate, 트리 스-borate-EDTA, 2 m m EDTA, pH 약 8.3))입니다.
2. 1.3 μ g/mL의 최종 농도에 thiazole 오렌지를 추가 합니다.
   1. Thiazole 10000 x 재고 솔루션 (13 mg/mL) DMSO에 오렌지를 분해. 특히 빛에 민감한, 동안에 사용 중인 어두운 때에 저장 합니다. 이 솔루션에 대 한 실내 온도에 안정 되어 ~ 개월; 장기 저장 aliquots (DMSO 표준 냉장고에서 얼어) 동결에 의해 달성 될 수 있습니다. 완전히 녹기 하 고 사용 하기 전에 냉동된 솔루션 resuspend 해야 합니다.
      참고: 젤 또한 얼룩이 질 수 있다를 가진 전기 이동 법 후 (단계 2.6 참조). 향상 된 안전성 프로필 ethidium 평범한 사람, 표준 분자 생물학 실험실 안전 조치를 유지 한다 있다 하는 동안.
3. 전자 레인지 agarose, 버퍼, 그리고 해산 오렌지 thiazole agarose의 혼합물 (약 60 s). 이 단계는 일반적으로 "녹는"로 참조. 소용돌이 (5 s) 필요한 경우 해산을 원조 하기 위하여.
   : 참고 선호 하는 경우 microwaving 후 추가할 수 있습니다.
4. 짧게 젤 캐스팅 장치 포함 하는 적절 한 빗으로 하 고 있는걸 전에 냉각 agarose 솔루션을 수 있습니다.
5. 젤으로 공고히 agarose 솔루션을 수 있습니다.

2. 로드 및 실행 하는 젤

1. 젤 전기 이동 법 기구에 배치 하지 않는 경우 이미 존재.
2. 젤의 표면을 커버를 실행 버퍼 (태 또는 이상으로 TBE)를 추가 합니다.
3. DNA 샘플 (일반적으로 10 μ) 로드 염료를 사용 하 여 로드 합니다. 참조에 대 한 DNA 크기 사다리를 포함 합니다.
4. 커버와 전극 (젤 빨간 양극 (긍정적인)으로 실행 해야 합니다) 첨부 합니다.
5. 전압을 적용 (일반적으로 ~ 100V 미니 젤 젤의 크기는 비록 젤 손상을 방지 하기 위해 수정 된 전압 필요할 수 있습니다) 적절 한 거리를 여행 했다 염료 로드 될 때까지 (미니 젤에 대 한 대략 4-7 cm 거리에 따라 다를 수 있지만 정확한 응용 프로그램)입니다.
   참고: ethidium 평범한 사람 그리고 많은 다른 DNA 바인딩 염료, 같은 thiazole 오렌지 긍정적으로 위탁 된다. 따라서, 이러한 염료 electrophoresing DNA의 반대 방향으로 마이그레이션됩니다. 향상 된 분리 젤 아래까지 실행 되는 샘플에 대 한 결국 염료 약한 얼룩이 발생 하는 작은 DNA 조각에서 분리 됩니다. 이러한 경우에는 젤 단계 2.6에서 얼룩이 질 한다. 이 상황 하에 고유 하지 않습니다, 그리고 어떤 긍정적으로 위탁 역 DNA와 상호 작용 하는 염료 (ethidium 평범한 사람를 포함 하 여, 등)이이 동작을 전시할 예정 이다.
6. 만약에 이전 주조 (1.2 단계) 젤, 젤 thiazole 오렌지를 포함 하는 버퍼에 immersing 하 여 얼룩에 추가 되지 않았습니다.
   1. 충분 한 버퍼 (TAE 또는 TBE) 준비 (약 20 분)를 감지 1.3 μ g/mL thiazole 젤 커버 하 고 밴드는 완전히 때까지 부드러운 동요와 젤을 담가 완전히 오렌지를 포함 하.

3. thiazole 오렌지 agarose 젤 (UV transilluminator)의 시각화

1. 젤 전기 이동 법 기구 및 UV transilluminator에 제거 합니다.
   주의: 자외선은 피부와 눈에 손상 이다. 얼굴 (얼굴 방패) 보호 및 적절 한 눈 (고글)을 착용 해야 합니다. 손 장갑 하 고 긴 소매를 착용 한다.
2. 원하는 경우, 잘라 원하는 (대 한 더 소화 또는 결 찰, 예를 들면) 젤에서 DNA 밴드. 절단 동안 UV 빛에 대 한 짧은에 젤 가능한 시간의 길이 표시 합니다. UV 빛 (DNA 염료)에 DNA를 손상 한다.
3. 쉽게 사용할 수 있는 키트 또는 프로토콜¹⁵를 사용 하 여 젤 조각에서 DNA를 추출 합니다.

4. thiazole 오렌지 agarose 젤 (블루 빛 transilluminator 또는 손전등)의 시각화

1. 젤 전기 이동 법 기구 및 블루 빛 transilluminator (~ 470 nm 최대 방출 파장)에 장소에서 제거 합니다. 또는, 파란색 LED (~ 470 nm) 손전등 젤 (중에서 위 또는 아래)에서 지시 될 수 있다.
   참고: 감도 블루 빛 transilluminator ethidium 평범한 사람을 사용 하 여 낮은, ethidium 평범한 사람으로 물 DNA 감지할 수 있습니다이 블루 빛 프로토콜을 사용 하 여.
2. 푸른 빛, 형광의 시각화를 사용 하면 필터링 황색 방출 필터 (~ 560 nm longpass, 사각형 또는 고글)를 사용 하 여 DNA: thiazole 오렌지 복합물에서.
   참고: 주황색 방출 필터 없이 그것 매우 어렵습니다 블루 빛 여기 소스의 강도 때문에 DNA 밴드를 검출 하기 위하여.
   주의: 푸른 빛 심하게 손상 조직 (UV 대조), 장기 능력 부족 하지만 강렬한 푸른 빛에 노출 눈 손상 될 수 있습니다 그리고 주황색 방출 고글 또는 필터를 사용 해야 합니다.
3. 원하는 경우 추가 응용 프로그램에 대 한 젤에서 원하는 DNA 밴드를 잘라.
   참고: 이후 블루 라이트 팬 들은 DNA의 정보를 손상 하지 않습니다, 그것은 급속 하 게 밴드를 잘라 하는 데 필요한 (때와 같은 단계 3.2에서에서 UV 여기를 사용 하 여).
4. 쉽게 사용할 수 있는 키트 또는 프로토콜¹⁵를 사용 하 여 젤 조각에서 DNA를 추출 합니다.

5. 이미지 캡처

1. 젤-이미징 장치에 적절 한 여기 및 방출 설정을 선택 합니다. 여기 및 thiazole 오렌지의 방출 (λ_{전, 최대} 510 = nm (488 nm와 470 nm 자외선 파장에서 강한 여기 뿐만 아니라 강한 여기 표시); λ_em = 527 nm) 일반적인 블루 빛-감지 상업 사용 하는 염료 변경, 그래서 악기 필터 설정을 사용할 수 있는 미리 있습니다.
   참고: 블루-빛-감지 상업 염료에 대 한 일부 필터 설정을 실제로 유해한 UV 빛을 사용 하 여 여기, 그래서 밴드 절단 전에 이미징 하는 경우 주의 사용. DNA 밴드 영상 후 excised 됩니다 때 블루 빛 여기 소스를 가능 하면 사용 합니다.
2. 적절 한 필터와 이미징 시스템의 부재에서 카메라와 젤/블루 라이트 여기 소스 사이 황색 필터를 놓습니다.

결과

Thiazole 오렌지 ethidium 평범한 사람을 사용 하지 않고 고 DNA 손상 자외선을 사용 하지 않고 DNA의 검색을 수 있습니다. Ethidium 평범한 사람은 변이 원 성, 되 고 그래서 실험실에서 그것을 제거 하는 유리한 수 있습니다. UV 빛 DNA를 손상 하 고 파란 빛은 DNA를 손상 하지 않습니다 반면 크게, 변환 효율을 낮춘 다. 검출 한계는 ethidium 평범한 사람, thiazole 오렌지, 일반적인, 파랑-빛-감지 상업 DNA 염색 유사 ...

토론

Ethidium 평범한 사람은 오랫동안 알려진된 독성에도 불구 하 고 분자 생물학 실험실에서 표준 도구. 그것은 또한 요구로 감지 되 고 DNA를 손상 자외선에서 겪고 있다. Thiazole 오렌지 ethidium 평범한 사람 뿐만 아니라 유용 하지만 비싼 상업용 염료는 저렴 한 대안을 제공합니다.

Thiazole 오렌지의 혜택은 따라서 두 배. 첫째, thiazole 오렌지 ethidium 평범한 사람을 교체로 간단 하 게 사?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-log DNA ladder	New England Biolabs	N0469S
Agarose (Genetic Analysis Grade)	Fisher	BP1356-100
Blue-light flashlight	WAYLLSHINE (Amazon)	WAYLLSHINE Scalable Blue LED
ChemiDoc MP	Biorad	1708280
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
ethidium bromide	Fisher	BP1302-10	For comparison, not necessary for protocol
Gel apparatus (Owl Easy Cast)	Thermo Scientific	B1A
Qiagen Qiaquick Gel extraction kit	Qiagen	28704
Safe Imager Viewing Glasses	Invitrogen	S37103	Necessary for using blue light flashlight.*
SafeImager 2.0 (Blue light transilluminator)	Invitrogen	G6600	Blue light flashlight may be used as alternative
SYBR Safe	Invitrogen	S33102	For comparison, not necessary for protocol
TAE (Tris-Acetate-EDTA)	Corning	46-010-CM
Thiazole orange	Sigma-Aldrich	390062
			*Glasses are also included with Invitrogen G6600