Eletroforese de DNA usando tiazol laranja em vez de brometo de etídio ou corantes alternativos

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para usar tiazol laranja para a detecção de DNA em experimentos de electroforese do gel. O uso de laranja tiazol permite a eliminação do brometo de etídio, e detecção de fluorescência pode ser obtida com UV ou luz azul.

Resumo

Eletroforese em gel de DNA usando agarose é uma ferramenta comum em laboratórios de biologia molecular, que permite a separação de fragmentos de DNA de tamanho. Após a separação, o DNA é visualizado pela coloração. Este artigo demonstra como usar o DNA de tiazol laranja para manchar. Laranja de tiazol compara-se favoravelmente a métodos comuns de coloração, em que é sensível, barata, excitáveis com UV ou luz azul (para não danificar a amostra) e mais seguro do que o brometo de etídio. Laboratórios já equipados para executar experiências de electroforese de DNA utilizando o brometo de etídio geralmente podem alternar corantes sem alterações adicionais aos protocolos existentes, usando luz UV para a deteção. Deteção de luz azul para evitar dano da amostra além disso pode ser alcançada com um filtro de fonte e de emissão de luz azul. Laboratórios já equipados para a deteção de luz azul podem simplesmente alternar corantes sem alterações adicionais aos protocolos existentes.

Introdução

A finalidade desse método é identificar o DNA em gel de agarose usando tiazol laranja (a) para a deteção de fluorescência. Devido a seu perfil de segurança de baixo custo e favorável, laranja tiazol pode ver benefício particular em laboratórios de ensino de graduação e laboratórios de pesquisa, realizando a biologia molecular, especialmente a ligadura e a clonagem.

Brometo de etídio permanece o corante mais comum para detecção de DNA em gel de agarose. Isto é principalmente porque pode ser obtido muito barata e requer apenas excitação com luz UV para a deteção. Ambas as ethidium brometo e tiazol laranja são baratos, com deteção de baixos limites (1-2 ng/pista)¹. Existem duas desvantagens principais de brometo de etídio, no entanto, que laranja tiazol melhora.

Primeiro, brometo de etídio é um agente mutagénico² com tratamento especial, transporte e eliminação requisitos, Considerando que laranja tiazol é menos mutagênico (3 – 4 x menos mutagênico no teste de Ames)^3,4 e pode ser descartado em geral com resíduos químicos comuns.

Em segundo lugar, o brometo de ethidium requer luz UV para a deteção. Laranja de tiazol similarmente pode usar luz UV, se desejado, mas também pode ser detectada com luz azul. Luz UV, embora comumente utilizadas, tem algumas desvantagens importantes. Em primeiro lugar, é prejudicial para os olhos e a pele humana. Enquanto a luz UV pode ser usada com segurança por profissionais treinados, a pele ou os olhos danos acidentais (funcionalmente semelhante a queimaduras) da luz UV de laboratório não são incomuns particularmente com cientistas inexperientes. Em segundo lugar, a luz UV é extremamente prejudicial para DNA amostras⁵, que reduz o sucesso de experiências a jusante (tais como ligadura e transformação)^1,6,7. TO permite a detecção com luz azul (λ_{ex, máximo} = 510 nm (488 nm e 470 nm também mostrar forte excitação)), que não causa danos à pele ou danificar o DNA (embora qualquer luz intensa ainda pode ser prejudicial para os olhos), diminuindo significativamente os riscos para ambos o cientista e a amostra.

Não é a alternativa de tintura fluorescente só de brometo de etídio; sua vantagem é o custo. QUE foi descoberto na década de 1980 como uma mancha de Reticulócito⁸e encontrou o utilitário em um número de fluorescência baseado em DNA experiências^{9,10,11,12,13}. Atualmente é vendida por vários fornecedores. QUE é o composto de adicional, mais caro, azul-luz – detectável corantes comerciais e se comporta da mesma forma durante a electroforese, UV ou luz azul para a deteção de¹. Além disso, enquanto outros corantes são mais sensíveis a concentrações muito baixas de DNA que EtBr ou TO, para experimentos de electroforese genéricos, tais corantes são proibitivamente caros, em muitos contextos.

Protocolo

1. preparar o gel

Nota: Para protocolos de eletroforese de gel geral, ver também P.Y. Lee, et al. ¹⁴.

1. Misture a agarose (~ 1% p/v, percentagem pode ser variada para separações de determinado tamanho) em buffer (aproximadamente 70 mL para um mini gel (8 x 7 cm)). Buffers são comumente TAE (pH tris-Acetato-EDTA, 40 mM Tris, acetato de 20 mM, 1 mM EDTA, aproximadamente 8,6) ou TBE (pH tris-borato-EDTA, 90 mM Tris, borato de 90 mM, EDTA 2 mM, aproximadamente 8.3)).
2. Adicione tiazol laranja para uma concentração final de 1,3 μg/mL.
   1. Dissolva tiazol laranja em DMSO, tornar-se uma solução 10.000 x (13 mg/mL). Enquanto não particularmente luz sensível, armazene TO no escuro quando não estiver em uso. Esta solução é estável à temperatura ambiente para ~ meses; armazenamento a longo prazo pode ser alcançado por congelamento alíquotas (DMSO irá congelar em um refrigerador padrão). Certifique-se inteiramente derreter e ressuspender uma solução congelada antes do uso.
      Nota: O gel pode também ser manchado com TO após eletroforese (ver passo 2.6). Enquanto que tem um perfil de segurança melhorada sobre o brometo de ethidium, segurança de laboratório padrão biologia molecular precauções devem ser mantidas.
3. A mistura de agarose e buffer de agarose tiazol laranja para dissolver no microondas (cerca de 60 s). Esta etapa é comumente referida como "fusão". Redemoinho (5 s) para auxiliar a dissolução, se necessário.
   : Nota também pode ser adicionado após o microondas se preferir.
4. Permitir que a solução de agarose arrefecer brevemente antes de derramar em aparelhos de fundição de gel que contém um pente apropriado.
5. Permitir que a solução de agarose solidificar em um gel.

2. carregar e executar o gel

1. Coloque o gel no aparelho de eletroforese se não estiver presente.
2. Adicione execução buffer (TAE ou TBE como acima) para cobrir a superfície do gel.
3. Carrega amostras de DNA (geralmente de 10 μL) usando uma tintura do carregamento. Incluem uma escada de dimensionamento de DNA para referência.
4. Coloque a tampa e eletrodos (o gel deve ser executado para o ânodo vermelho (positivo)).
5. Aplicar tensão (normalmente ~ 100V para um mini gel, embora o tamanho do gel podem exigir uma tensão modificada para não danificar o gel) até carregar o corante tem viajado a uma distância adequada (aproximadamente 4-7 cm para um mini gel, embora a distância pode variar dependendo do aplicação precisa).
   Nota: Como o brometo de etídio e muitos outros corantes de ligação a DNA, laranja tiazol é carregada positivamente. Consequentemente, estes corantes migrará na direção oposta de electrophoresing DNA. Para amostras que são longe atropelar o gel de separação reforçada, eventualmente o corante irá separar os pequenos fragmentos de DNA, resultando em coloração fraca. Nestes casos, o gel deve ser manchado como na etapa 2.6. Esta situação não é exclusiva para, qualquer um carregado positivamente tintura que interage reversivelmente com DNA irá expor este comportamento (incluindo o brometo de ethidium e outros).
6. Se que não foi adicionado antes de fundição (etapa 1.2) do gel, mancha imergindo o gel no buffer contendo tiazol laranja.
   1. Preparar o suficiente buffer (TAE ou TBE) contendo 1,3 tiazol μg/mL laranja completamente cobrir o gel e embeba o gel com agitação suave até as bandas são totalmente detectado (aproximadamente 20 min).

3. visualização do gel de agarose laranja tiazol (transiluminador UV)

1. Retire o gel do aparelho de eletroforese e lugar em um transiluminador UV.
   Atenção: A luz UV é prejudicial à pele e olhos. Certifique-se de usar o apropriado (óculos) proteção olhos e rosto (protetor de cara). As mãos devem ter luvas e mangas compridas devem ser usadas.
2. Se desejado, corte fora desejado bandas de DNA do gel (para digestão mais ou ligadura, por exemplo). Expor o gel à luz UV para como short um comprimento de tempo possível durante a excisão. Luz (independentemente de corante de ADN) UV danifica o DNA.
3. Extrai o DNA da fatia gel usando um prontamente disponível kit ou protocolo¹⁵.

4. visualização de gel de agarose laranja tiazol (transiluminador de luz azul ou lanterna)

1. Retire o gel do aparelho de eletroforese e lugar em um transiluminador de luz azul (~ 470 nm de emissão máxima de comprimento de onda). Alternativamente, um LED azul (~ 470 nm) lanterna pode ser direccionada em gel (ou de cima ou abaixo).
   Nota: Enquanto a sensibilidade é menor usando um transiluminador de luz azul com brometo de etídio, DNA, corado com brometo de etídio pode ser detectada usando esse protocolo de luz azul.
2. Use um filtro de emissão âmbar (~ 560 nm longpass, óculos de proteção ou praça) para filtrar a luz azul, permitindo a visualização da fluorescência de complexos de DNA: tiazol laranja.
   Nota: Sem o filtro âmbar de emissões, é muito difícil de detectar bandas de DNA devido à intensidade da fonte de luz azul da excitação.
   Atenção: Embora a luz azul não possui a habilidade de agudamente danificar tecidos (contrastando UV), prolongados exposição à luz azul intenso pode danificar os olhos e óculos de âmbar de emissão ou de filtro deve ser usado.
3. Se desejado, corta-se bandas de DNA desejadas do gel para novas aplicações.
   Nota: Desde que a luz azul não danifica o DNA, não é necessário cortar rapidamente para fora de bandas (como quando usando excitação UV em passo 3.2).
4. Extrai o DNA da fatia gel usando um prontamente disponível kit ou protocolo¹⁵.

5. captura de imagem

1. Selecione configurações apropriadas de excitação e emissão em aparelhos de gel de imagem. A excitação e emissão de laranja tiazol (λ_{ex, máximo} = 510 nm (488 nm e 470 nm também mostrar excitação forte, além de forte excitação em comprimentos de onda UV); λ_em = 527 nm) são quase idênticos aos comerciais azul-luz – detectável comum corantes, para que instrumentos podem ter predefinir configurações de filtro que podem ser usadas.
   Nota: Algumas configurações de filtro de azul-luz – detectável corantes comerciais realmente usar luz de UV prejudicial para a excitação, então tome cuidado, se imagem latente antes da corte de bandas. Use uma fonte de luz azul da excitação se possível quando bandas de DNA vão ser extirpadas após a imagem.
2. Na ausência de um sistema de imagem com filtros adequados, coloca um filtro âmbar entre a câmara e a fonte de luz azul/gel de excitação.

Resultados

Laranja de tiazol permite a detecção de DNA, sem o uso de brometo de etídio e sem usar luz UV nocivas para o DNA. Brometo de etídio é conhecido para ser mutagénico, para que eliminá-la do laboratório pode ser vantajoso. Luz UV danifica o DNA e reduz a eficiência de transformação significativamente, Considerando que a luz azul não danifica o DNA. Limites de detecção são semelhantes entre o brometo de ethidium, tiazol laranja e um corante comercial comum, azul-luz – detectável do DNA (

Discussão

Brometo de etídio tem sido uma ferramenta padrão no laboratório de biologia molecular, apesar de toxicidade conhecida. Ele também sofre de exigir que a luz UV, que danifica o ADN, como ele está sendo detectado. Laranja de tiazol oferece uma alternativa barata para brometo de etídio, bem como corantes comerciais úteis mas caros.

Os benefícios da laranja tiazol são, portanto, duas vezes. Primeiro, laranja tiazol simplesmente pode ser usada como um substituto para o brometo de etídio. G...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-log DNA ladder	New England Biolabs	N0469S
Agarose (Genetic Analysis Grade)	Fisher	BP1356-100
Blue-light flashlight	WAYLLSHINE (Amazon)	WAYLLSHINE Scalable Blue LED
ChemiDoc MP	Biorad	1708280
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
ethidium bromide	Fisher	BP1302-10	For comparison, not necessary for protocol
Gel apparatus (Owl Easy Cast)	Thermo Scientific	B1A
Qiagen Qiaquick Gel extraction kit	Qiagen	28704
Safe Imager Viewing Glasses	Invitrogen	S37103	Necessary for using blue light flashlight.*
SafeImager 2.0 (Blue light transilluminator)	Invitrogen	G6600	Blue light flashlight may be used as alternative
SYBR Safe	Invitrogen	S33102	For comparison, not necessary for protocol
TAE (Tris-Acetate-EDTA)	Corning	46-010-CM
Thiazole orange	Sigma-Aldrich	390062
*Glasses are also included with Invitrogen G6600