Улучшенное наблюдение за бешенством с помощью прямого быстрого иммуногистохимического теста

Резюме

Прямой экспресс-иммуногистохимический тест (DRIT) предлагает Всемирную организацию по охране здоровья животных и Всемирную организацию здравоохранения (OIE/WHO) признанной альтернативой прямому флуоресцентным антителам (DFA) для диагностики бешенства. Этот тест позволяет для полевых приложений, которые могут быть выполнены примерно в 1 ч на мозг впечатления с помощью световой микроскопии.

Аннотация

Лабораторное наблюдение является неотъемлемой частью усилий по профилактике бешенства, борьбе с ним и борьбе с ним. Хотя DFA является золотым стандартом для диагностики бешенства, существует необходимость в проверке дополнительных диагностических методов для улучшения эпиднадзора за бешенством, особенно в развивающихся странах. Здесь мы представляем стандартный протокол для DRIT в качестве альтернативного, лабораторного или полевого тестирования вариант, который использует световую микроскопию по сравнению с DFA. Сенсорные впечатления от мозговой ткани, собранные у подозрительных животных, фиксируются в 10% буферизированном формалине. DRIT использует вирус бешенства конкретных моноклональных или поликлональных антител (конъюгированных биотин), стрептавидин-пероксидаза фермента, и хромоген репортер (например, ацетил 3-амино-9-этилкарбазол) для обнаружения вирусных включений в инфицированных тканях. Примерно в 1 ч образец ткани мозга может быть проверен и интерпретирован DRIT. Оценка мозга подозреваемых животных, протестированных у различных видов в Северной Америке, Азии, Африке и Европе, проиллюстрировала высокую чувствительность и специфичность DRIT, приближающегося к 100% с результатами по сравнению с DFA. С 2005 года, Министерство сельского хозяйства США службы дикой природы (USDA WS) программа провела крупномасштабные расширенные усилия по эпиднадзору за бешенством с использованием DRIT для тестирования . DRIT обеспечивает мощный, экономичный инструмент для диагностики бешенства, который может быть использован лабораториями и полевыми биологами для улучшения текущих программ эпиднадзора за бешенством, профилактики и борьбы с ним во всем мире.

Введение

В то время как DFA является наиболее широко используемым тестом для рутинной диагностики бешенства¹, стоимость покупки и поддержания флуоресцентного микроскопа может быть ограничена развивающихся стран^2,3,4 и для широкого, крупномасштабных расширенных программ эпиднадзора за бешенством^3,4. Кроме того, DFA требует способности хранить образцы во время фиксации и инкубировать образцы выше температуры окружающей среды во время антител-антигенных реакций, которые могут быть значительным препятствием в странах, не имеющих подходящей инфраструктуры. Отчасти из-за ограничений, связанных с современным тестированием DFA, глобальное воздействие бешенства уже давно недооценено⁵.

В этой связи необходимо утвердить дополнительные диагностические методы для улучшения эпиднадзора за бешенством во всем мире, особенно в развивающихся странах. Представленный здесь протокол DRIT предлагает лабораторную или полевую альтернативу тестированию DFA, которая использует световуюмикроскопию и не требует охлаждения или лабораторной инкубации во время испытания 6. DRIT и DFA похожи в том, что оба метода используют сенсорные впечатления образцов мозга, собранных у потенциально бешеных животных. Тем не менее, первый шаг DRIT использует формалин в качестве исторического фиксатора для образцов, который инактивирует вирус бешенства. Это обеспечивает существенное улучшение биобезопасности по сравнению с ацетоном, используемым для фиксации образцов в протоколе DFA³, что важно не только в лаборатории, но, возможно, даже в большей степени в полевых или децентрализованных лабораторных средах. На сегодняшний день DRIT показывает чувствительность и специфичность, равную DFA^2,7,8,9.

С 2005 года программа USDA WS проводит крупномасштабные расширенные усилия по эпиднадзору за бешенством в Северной Америке с использованием DRIT в рамках комплексной программы по борьбе с бешенством в дикой природе^10. Усиленный эпиднадзор за бешенством используется в качестве дополнения к наблюдению за общественным здравоохранением на основе воздействия и тесты в первую очередь дикой природы мезо-плотоядных видов, в том числе енотов (Procyon lotor), полосатые скунсы (Мефит мефит), серые лисы ( Urocyon cinereoargenteus), красные лисы (Vulpes vulpes), и койоты (Canis latrans), которые не были вовлечены в воздействие на человека или домашних животных. Туши животных, используемые в тестировании, были представлены USDA WS путем усиления усилий по эпиднадзору за бешенством и включали в себя виды переносчиков бешенства, которые являются: больными или странными действиями; найден мертвым, дорожно-убит, или неприятность; и не связаны с воздействием животных на человека или в домашних животных. DRIT обеспечивает диагностику бешенства, которые могут быть использованы квалифицированных полевых биологов с небольшим или вообще без лабораторного опыта для улучшения эпиднадзора за бешенством и снижения финансовой нагрузки и рабочей нагрузки общественного здравоохранения диагностических лабораторий¹⁰. Базовая подготовка DRIT для сотрудников USDA WS, как правило, занимает от 1,5 до 2 дней, что включает в себя примерно 4 ч классной инструкции, охватывающей основные принципы биобезопасности, методы сбора образцов и процессы DRIT, а также лабораторное время проведения теста. Возможности обучения были доступны USDA WS и кооператоров программы через Центры по контролю и профилактике заболеваний (CDC), LYSSA LLC, и Wistar институт.

В стратегических областях управления, USDA WS протестировалболеее более 94000 образцов дикой природы с использованием DRIT и обнаружил более 1850 бешеных образцов, которые, вероятно, остались незамеченными, полагаясь только на воздействие на основе общественного тестирования здоровья подозрительных животных. Расширенные данные эпиднадзора за бешенством, представленные результатами DRIT, имеют решающее значение для обеспечения более полного временного и пространственного представления бешенства на ландшафте в поддержку пероральных программ вакцинации против бешенства для диких животных на протяжении США^{10, 11}. Аналогичным образом, провинциальные агентства дикой природы в Канаде включили DRIT в крупномасштабных усилий по эпиднадзору за бешенством в тандеме со своими программами общественного здравоохранения с успехом⁸. Оба USDA WS и канадских программ наблюдения DRIT использовали национальные справочные лаборатории для подтверждения бешенства DFA и для выполнения вирусного варианта ввода по мере необходимости⁸. Кроме того, биологи USDA WS на местах отправляют 10% отрицательных образцов для подтверждения DFA в референтные лаборатории и с 2008 года, участвовали в двухгодичном тестировании на знание DRIT, предоставляемом Лабораторией гигиены штата Висконсин, как часть стандартного меры по обеспечению качества.

Цель этого метода заключается в том, чтобы предложить альтернативный подход к диагностическому тестированию на бешенство, который может быть проведен в децентрализованных лабораториях, на местах или в районах, не имеющих регулярного доступа к электронной микроскопии.

протокол

Каждый человек, проводящий диагностическое тестирование на бешенство, должен получить стандартную серию предэкспозиционной вакцинации против бешенства и пройти регулярную оценку серологических антител с принеобходимости. Неиммунизированные лица не должны поступать в лаборатории или районы, где ведется такая работа. Все манипуляции с тканями и горками должны проводиться для того, чтобы не аэрозолизировать жидкости и не производить частицы воздушно-капельным путем. Fume вытяжки не требуется, но когда это возможно, они могут обеспечить дополнительную защиту от запахов, эктопаразитов и фрагментов костей. Минимальное индивидуальное защитное оборудование, включая перчатки и защиту глаз, следует носить в любое время во время сбора и тестирования образцов.

1. Коллекция Brainstem

1. Соберите образцы ствола мозга либо сразу после сбора туши, либо убедитесь, что туши помещаются в морозильные системы для хранения до последующего тестирования. Если туши животных заморожены, оттаивают при температуре окружающей среды до сбора мозгового ствола для удобства сбора. При некоторых обстоятельствах образцы собираются непосредственно у замерзшего животного.
2. Для животных, которые недавно собраны или были разморожены до температуры окружающей среды, положение животного на спине на плоской поверхности с шейным позвоночником слегка вращается к экзаменатору. Палпате для определения атланто-затылочным суставом на боковом аспекте шейного отдела позвоночника.
   1. Для туш, которые все еще полностью заморожены, положение животного supine, как описано выше, если практично. Используйте пилы, ножи, костные ножницы или аналогичное оборудование, чтобы полностью отделить голову от тела.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все используемое оборудование, которое не используется одноразовым, должно быть тщательно очищено между образцами.
3. Используя скальпельное лезвие, сделайте разрез на уровне атланто-затылком сустава в брюшной полости, прорезая все слои мышечной и мягкой ткани, включая трахею и пищевод. Продолжайте до приближения переднего аспекта шейного отдела позвоночника. Для замороженных тканей, используйте скальпель лезвие, чтобы удалить все оставшиеся слои мышц и мягких тканей, чтобы разоблачить foramen magnum.
4. Переместите голову животного в расширение конечного диапазона до тех пор, пока ствол мозга не будет виден. Используйте скальпель лезвие, чтобы удалить все видимые ствола мозга / центральной нервной системы (ЦНС) ткани для отбора проб. Для замороженных образцов, используйте скальпель лезвие, чтобы удалить как можно больше замороженных ствола мозга / ЦНС ткани, как это возможно изнутри черепа.
5. Поместите образцы ствола мозга в нерушимый контейнер (т.е. металлическую осину мази, крио-флакон и т.д.) и этикетку соответственно.
6. Убедитесь, что образцы ствола мозга тестируются сразу после сбора через тест DRIT, охлаждаются (4 кВ) до 24 ч до тестирования, или заморожены (-20 градусов по Цельсию) до момента тестирования, если тестирование будет проходить более 24 ч после сбора образцов.

2. Подготовка материалов для DRIT

1. Настройка 10 слайд окрашивания блюд (рисунок 1)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивающие блюда достаточно глубокие, чтобы обеспечить полное погружение слайда (диаметр 96 мм, высота 72 мм, глубина 42 мм, объем 250 мл). ⁶
   1. Заполните блюдо 1 с 10% фосфат буферизированных формалин. Замените формалин после 2 тестовых запусков или еженедельно.
   2. Заполните блюда 2, 4 и 5 фосфатами буферного солья с 1% tween-80 (TPBS). Замените свежим TPBS перед каждым тестом.
   3. Заполните блюдо 3 с перекисью водорода 3%. Замените перекись водорода перед каждым испытанием.
   4. Заполните блюда 6, 8, 9 и 10 дистиллированной или деионизированной водой. Замените воду перед каждым тестом.
   5. Заполните блюдо 7 с рецептуры гематоксилин Gills #2 разбавленным в соотношении 1:1 в дистиллированной воде⁶. Замените гематоксилин после 2 тестовых забегов или еженедельно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Согласно первоначальному протоколу DRIT, разработанному CDC^12,соотношение 1:2 гематоксилин Джиллс к воде может быть использовано, если контрпотирование слишком темно.
2. Приготовление амино-этилкарбазола (AEC) акционерного раствора
   1. Используя стеклянную пипетку, поместите 5 мл N,N-диметилформамид в стеклянную емкость.
   2. Добавить одну 20 мг таблетки 3-амино-9-этилкарбаззола и встряхнуть до полного растворения. Пометить банку с "AEC акции" и дата акции было сделано.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пастовый раствор AEC может храниться в холодильнике (4 кВ) и использоваться в течение 1-2 месяцев.
3. Подготовка рабочего разбавления АЭК
   1. Добавьте 7 мл буфера ацетата в центрифугу 15 мл.
   2. Используя стеклянную пипетку, добавьте 0,5 мл бульонного раствора AEC в центрифужную трубку.
   3. Добавьте в трубку 0,075 мл перекиси 3% водорода.
   4. Отфильтруйте раствор шприцем 10 мл с помощью фильтра шприца 0,45 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: AEC рабочего разбавления должны быть созданы непосредственно перед каждым тестом DRIT, как это только стабильной для 2-3 ч.

3. Прямой экспресс-тест иммуногистохимии

1. Стеклянный микроскоп этикетки скользит с уникальным номером для каждого образца с помощью мазка-доказательство, водонепроницаемый, постоянный маркер чернил.
   1. С помощью скальпеля лезвие, удалить ствол мозга из контейнера и место на бумажное полотенце. Аккуратно пятно от любого избытка жидкости, крови или меха со вторым бумажным полотенцем, чтобы выявить только ткани ствола^{мозга 13}. При необходимости, раздел ткани ствола мозга, чтобы выявить поперечное сечение.
   2. Очень нежно коснитесь микроскопа слайд к поперечному сечению ткани ствола мозга. Коснитесь слайда к стволу мозга в нескольких точках без бокового движения, чтобы несколько областей ствола мозга, которые будут переданы слайд¹³. Убедитесь, что только 1 или 2 слоя клеток передаются из ткани мозга на слайд с нежным прикосновением. Нет монтажного агента не требуется, чтобы прикрепить ткани ствола мозга к слайдам. Включите как положительный, так и отрицательный контроль в каждом запуске DRIT.
2. Пусть слайды воздуха сухой в течение примерно 5 минут при комнатной температуре.
3. Погрузите слайды в 10% буферизированный формалин в течение 10 минут (блюдо 1).
4. Удалите слайды из формалина и опускайте-промыть в растворе TPBS (блюдо 2).
5. Погрузите слайды в перекись водорода 3% в течение 10 мин (блюдо 3).
6. Удалите слайды с перекиси водорода и промыть в свежем TPBS (блюдо 4). После удаления избыточного перекиси водорода, поместите слайды в свежие TPBS (блюдо 5) и работать с одним слайдом в то время как другие слайды остаются погруженными в TPBS.
7. Возьмите слайды из TPBS (блюдо 5) по одному, стряхните и пятно избыток буфера, и место на увлажненное бумажное полотенце на лабораторной скамейке, в качестве основы "влажности камеры". Используя пипетку, падение достаточно первичного антитела вируса против бешенства на каждом слайде, чтобы покрыть ткани ЦНС. Инкубировать горки в течение 10 минут в камере влажности (т.е., покрывая горки с хорошо пластин или другой простой крышкой, пока они лежат на увлажненных бумажных полотенец) при комнатной температуре (Рисунок 2).
8. Удалите слайды из камеры влажности, встряхните и смотите избыток конъюгированного, и опускайте-промыть слайды в TPBS (повторное использование того же TPBS в блюде 5).
9. Работая с одним слайдом в то время как другие остаются погруженным в TPBS - использовать пипетку, чтобы падение достаточно стрептавидин-пероксидаза комплекса для покрытия ткани ЦНС. Инкубировать в камере влажности в течение 10 мин при комнатной температуре.
10. Удалите слайды из камеры влажности, встряхните и смотите избыточный комплекс и промоучивите слайды в TPBS (блюдо 5).
11. Работая с одним слайдом в то время, стряхнуть и пятно избыток буфера, в то время как другие остаются погруженным в TPBS - использовать пипетку, чтобы падение достаточно AEC (подготовка объясняется выше и должно быть сделано непосредственно перед использованием) для покрытия ткани ЦНС. Инкубировать в камере влажности в течение 10 мин при комнатной температуре.
12. Dip-промыть горки в дистиллированной воде (блюдо 6).
13. Поместите горки в контрпятно Gills Hematoxylin (разбавленный 1:1 с дистиллированной водой) в течение 2 мин (блюдо 7).
14. Немедленно опустить-промыть все горки в дистиллированной воде (блюдо 8). Повторите два раза с пресной водой каждый раз (блюда 9 и 10).
15. Работа явившись на одну горку за раз, в то время как другие остаются погруженными в дистиллированную воду (блюдо 10) - встряхнуть и сфолить избыток воды и использовать водорастворимый монтаж среды, чтобы прикрепить крышку скольжения.
16. Используйте легкий микроскоп с целью 20x для просмотра слайдов и 40x цель, если требуется более тщательный осмотр.

Результаты

Положительные результаты DRIT показывают красные интрацитоплазмические вирусные включения, которые могут варьироваться в форме и размере(Рисунок 3) в цитоплазме голубоватых клеточных тел. Включения выглядят гладкими с очень яркими полями и менее интенсивно окрашенными центральной областью. Интенсивность и распределение антигенов регистрируются при обнаружении включений. Интенсивность оценивается от 4 до 1 евро. Положительный контроль слайд должен иметь интенсивный, вопиющий пурпурный блеск, который называется интенсивностью No 4. Небольшая потеря цвета может произойти особенно, когда обработка образцов не была оптимальной (т.е. образец ткани разложилась немного), и они должны быть оценены как No 3. Заметно скучнопятно оценивается как от 2 до 1, не считается диагностическим для заражения вирусом бешенства и помеченкак неопределенным.

Кроме того, распределение антигенов оценивается от 4 до 1 евро с 4, представляющими распределение антигена, состоящее из обилия больших и малых включений, различающихся по размеру и форме, и присутствует в каждой области (или почти в каждом поле) зрения в ткани ЦНС сенсорный впечатление. Положительный контроль, как правило, имеет распределение антигена No4. Распределение антигена No3 будет назначено при наличии включений в различных размерах в большинстве, но не во всех полях зрения. Если включения обнаружены в 10%-50% полей микроскопа, назначается распределение антигена No2. При обнаружении включений в полях микроскопа No1 назначается распределение антигена No1.

Большинство тканей ЦНС с вирусом бешенства настоящее время экспонат типичных вирусных включений оценивается как интенсивность No 3 или No 4 и антиген распределения. Если результаты указывают на интенсивность 2 или 1 евро или распределение антигена No2 или No1, выборка объявляется «неопределенным» и требуется повторное тестирование. Если один и тот же образец имеет повторный неопределенный результат теста, образец должен быть отправлен в референтную лабораторию для DFA или связанного с ним подтверждаемого тестирования.

Тестовый образец с использованием DRIT считается отрицательным для антигенов вируса бешенства после слайда, содержащего ткани ЦНС был отсканирован при увеличении 200X или больше, и никаких типичных включений вируса не обнаружено (Рисунок 4). Отрицательные образцы экспонат голубоватые тела клеток с небольшим или без неспецифических окрашивания.

Рисунок 1: Установка 10 слайд окрашивания блюд с реагентами для тестирования. Блюда помечены с реагентом имя в порядке, необходимом для выполнения протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Простая камера влажности, созданная с мокрым бумажным полотенцем и пластинами культуры клеток.  Простая камера влажности с использованием мокрого бумажного полотенца и пластин ыточной культуры позволяет использовать полевое применение.  Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Представитель слайды бешенства положительных вирусных включений с интенсивностью No 4 и No 4 антигенраспределения. (A и B) показывают положительные включения бешенства вирусных при 200x увеличение. (C и D) показывают положительные включения бешенства вирусных при 400x увеличение. Шкала баров 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4: Представитель слайды отрицательных образцов без бешенства вирусных включений. (A и B) показывают образцы отрицательные для бешенства вирусных включений в 200x увеличение. (C и D) показывают образцы отрицательные для бешенства вирусных включений в 400x увеличение. Шкала баров 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 5: Репрезентативные фотографии испытательных объектов DRIT, используемых Министерством сельского хозяйства США WS. (A) Мобильный испытательный центр в закрытом прицепе для транспорта. (B) Рекреационный автомобиль, модернизированный для тестирования DRIT. (C) ИСПЫТАТЕЛЬНЫй центр DRIT совместно с университетской лабораторией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Обсуждение

DRIT является гибким методом, пригодным для эпиднадзора на местах для выявления наличия вируса бешенства, который может быть использован в децентрализованных лабораторных районах. Хотя можно провести весь тест в полевых условиях, таких как на задней двери грузовика, идеально будет иметь небольшое, крытое пространство, предназначенное для DRIT из-за химических веществ, оборудования и вопросов хранения. Кроме того, необходимо учитывать соблюдение всех применимых федеральных, государственных и местных законов и правил использования и утилизации химических веществ. В настоящее время USDA WS располагает 15 объектами DRIT для тестирования образцов из 17 штатов. Объекты USDA WS DRIT создаются совместно с университетскими и государственными лабораториями общественного здравоохранения, в специально отведенных помещениях в больших помещениях и в закрытых прицепах, которые были модернизированы и переоборудованы в качестве мобильных испытательных установок в случае чрезвычайной вспышки ответ, где расширение тестирования на наблюдение за бешенством с непосредственным временем оборота имеет решающее значение(рисунок 5).

В то время как тест был успешным с использованием ствола мозга материал переменного качества, свежие ткани ствола мозга без разложения тканей является оптимальным. По мере разложения, высыхания или сжижения качество образца снижается, и тест может обнаружить более неспецифические окрашивания, которые могут запутать результаты. Это наблюдение аналогично между DFA и DRIT². Brainstem /CNS должны быть собраны как можно скорее, а затем хранитьзамороженные (-20 градусов по Цельсию) до тестирования.

Как правило, большинство объектов USDA WS обрабатываются от 12 до 24 слайдов одновременно во время сеанса DRIT, включая один положительный контроль и один отрицательный контроль, который был подтвержден через DFA. Положительные и отрицательные элементы управления обеспечивают точку отсчета для каждого запуска DRIT для обеспечения успешного проведения теста и подтверждения того, возникают ли на тестовых слайдах вопросы с толкованием. Если образец не установлен, чтобы иметь явный положительный или отрицательный результат, он помечен как неопределенный и проверен ы во второй раз DRIT. Если этот образец не является явным положительным или отрицательным после двух drIT-тестов, он отправляется в референтную лабораторию для DFA или связанных с ним испытаний.

Как и в любом диагностическом тесте, «проблема съемки» полезна при неожиданных находках. Например, если drIT-запуск не удался (т.е. положительный контроль не проявляет интенсивности окрашивания и распределения антигенов в размере 3 или 4 евро), убедитесь, что срок действия всех химических веществ и реагентов не истек. Мы обнаружили, используя недавно открытую бутылку перекиси водорода, как минимум один раз в неделю полезно, чтобы помочь предотвратить неспецифические окрашивания через окисление ткани мозга. Кроме того, мы рекомендуем заменять буфер ацетата не реже одного раза в год, как минимум, независимо от срока годности.

Есть ряд преимуществ DRIT над DFA, включая более низкие затраты, способность выполнять тест за пределами централизованной лаборатории, необходимость только световой микроскопии вместо флуоресцентного микроскопа, и относительно простой процесс обучения для люди, управляющие ичитающие тест 2,^3,4. Эти преимущества, в сочетании с чувствительностью и специфичность DRIT, которые сопоставимы с DFA^2,7,8,9 уже доказали, что тест служит важным инструментом в широком масштабе расширенные программы эпиднадзора за бешенством^8,10 в Северной Америке. Кроме того, ДРИТ обладает потенциалом для расширения эпиднадзора и более оперативного тестирования в развивающихся странах или других районах с ограниченными ресурсами, особенно после недавнего руководства МЭЕ/ВОЗ в качестве рекомендуемого теста.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Amino-9-Ethylcarbazole (AEC tablets; 50 count)	Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)	A6926
Acetate Buffer, 0.1M, 5.2 pH, 32oz	Poly Scientific R&D Corp. (https://www.polyrnd.com/)	s140
Ag Tek MiniScalpel, PN110, Non-sterile #10, 40 per package	Patterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/)	PN110	Supplemental equipment for sample touch impressions; Also available through Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/)
BD Luer-Lok Disposable Syringe without needle, 10cc	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	14-823-2A	BD Manufacturer Number 309604
Binocular Light Microscope with Seidentopf Head or equivalent	Multiple Vendors
Blue Rectangular UN-rated Disposal Container, 5G	Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)	1147T01BLU	Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Gill hematoxylin and AEC solution)
Corning Square and Rectangular Cover Glass, 24x60	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	12-553-465	Corning Manufacturer Number 2975246
Corning Universal Fit Pipet Tips: Racked, Nonsterile (1-200ul)	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	07-200-300	Corning Manufacturer Number 4863
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes, polypropylene	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	14-959-70C	Corning Manufacturer Number 352097
Falcon 96-Well Assay Plates (Tissue culture plate lids)	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	08-772-5	Corning Manufacturer Number 353910
Fisher Brand 25mm Syringe Filter, Nylon, 0.45um, Sterile	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	09-719D
Fisher Chemical Gill Method Hematoxylin Stain (Gill-2), 4L	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	CS401-1D
Fisherbrand Sharps-A-Gator Point-of-Use Sharps Containers, 5qt	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	14-827-122	Supplemental equipment for proper BSL-2 Laboratory Set-Up
Fluoro-Gel with Tris Buffer (Gel/Mount Media), 20mL	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	102092-122	Fluoro-Gel Substitute for BioMeda™ Gel-Mount, Electron Microscopy Sciences
Formalin, Buffered, 10%, 4L	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	SF100-4	Available each or in case of 4
Gilson Pipetman P200 Pipet, 50-200uL	Daigger Scientific (https://www.daigger.com)	EF9930E
Hy-Clone Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, 1L (PBS)	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	SH30256LS	Alternative dry powder product can be used
Hydrogen Peroxide, 3%	Multiple Vendors		Any commercially available source, such as pharmacy or store brands, etc.
Lens Microscope Objective 20X and 40X	Multiple Vendors
Lysol IC Quarternary Disinfecting Cleaner, 1G	Daigger Scientific (https://www.daigger.com)	EF8481	Supplemental materials for proper BSL-2 Laboratory disinfection
Miltex brand Disposable Scalpel Size 22 (alternative size to MiniScalpel)	AMD Next (www.amdnext.com)	999112314	Supplemental equipment for sample touch impressions; Alternative size to Ag Tek MiniScalpel
N,N-Dimethylformamide, Amber Glass Packaging, 500mL	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	D119-500
Peroxidase Labeled Streptavidin, 50mL	SeraCare (https://www.seracare.com/)	5550-0001	KPL Immunoassay and Kits Reference Number 71-00-38
Phosphate Buffered Saline Powder (alternative to Fisher liquid PBS)	Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)	P3813	Must be prepared in 1L distilled water; Available in quantities of 1, 10 and 50 packs
Primary antibody: Polyclonal anti-nucleoprotein or cocktail of anti-lyssavirus biotinylated antibodies			Store at 4 degrees C
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 1.0mL	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	7078D-1	VWR Manufacturer Number 89091-220
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 10.0mL	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	7078D-10	VWR Manufacturer Number 89091-106
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 5.0mL	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	7078D-5	VWR Manufacturer Number 89091-484
Richard-Allan Scientific Gills Hematoxylin Stain No. 2, 1PT (alternative to above)	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	22-050-201	Thermo Scientific Manufacturer Number 72504
Slide Holders, 24-place	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	25608-868	Sakura®Finetek Supplier Number 4465; Available through multiple vendors
Specimen Tin Boxes, 1/2oz	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	101412-452	Supplemental equipment for storage of brain tissue samples
Taylor 2-Event Digital Timer/Clock	Multiple Vendors		Supplemental equipment
Tissue-Tek Slide Staining Kit	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	25608-902	Sakura®Finetek Supplier Number 4551; Available through multiple vendors
TWEEN 80, Polyethylene glycol, 500mL	Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)	P1754	Also available in 25mL, 1L and 1G volumes
VWR FLIP Pipette Filler (0.05-100mL)	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	53497-055
VWR Soft Nitrile Examination Gloves, L (100 per box)	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	89038-272	Supplemental equipment for proper PPE
Water, Deionized (20L)	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	10806-022
Wheaton Clear Glass Sample Vials, 8mL	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	06-408C	DWK Life Sciences Manufacturer Number 224884
White Coated, Double Well Pattern Microscope Slides, 14mm	Tekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html)	2-140
White Rectangular UN-rate Disposal Container, 5G	Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)	1147T01WHT	Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Formalin)