Induzindo a periodontite apical em camundongos

Resumo

Aqui, nós apresentamos um protocolo para induzir localmente o periodontite apical nos ratos. Nós mostramos como perfurar um furo no dente do rato e expor sua polpa, a fim causar a inflamação local. Métodos de análise para investigar a natureza desta inflamação, tais como Micro-CT e histologia, também são demonstrados.

Resumo

Os mecanismos envolvidos na inflamação induzida local podem ser estudados usando vários modelos animais disponíveis. Uma delas é a indução da periodontite apical (AP). O periodontite apical é uma patologia comum de uma natureza inflamatório nos tecidos peridentais que cercam a raiz de dente. A fim compreender melhor a natureza e o mecanismo desta patologia é vantajoso executar o procedimento nos ratos. A indução desta inflamação odontogenic é conseguida perfurando no dente do rato até que a polpa dental esteja expor. Em seguida, a polpa dentária permanece exposta para ser contaminada pela flora oral natural ao longo do tempo, causando periodontite apical. Após este período de tempo, o animal é sacrificado, e o dente e o osso da mandíbula podem ser analisados de várias maneiras. As análises típicas incluem a imagem latente do Micro-CT (para avaliar o resorption do osso), a mancha histológica, Immunohistochemistry, e a expressão do RNA. Este protocolo é útil para a pesquisa no campo da biologia oral para compreender melhor este processo inflamatório em um ajuste in vivo experimental com circunstâncias uniformes. O procedimento exige uma manipulação cuidadosa dos ratos e da maxila isolada, e uma demonstração visual da técnica é útil. Todos os aspectos técnicos dos procedimentos que conduzem ao periodontite apical induzido e sua caracterização em um modelo do rato são demonstrados.

Introdução

O objetivo deste método é induzir o periodontite apical em um rato contaminando o vértice com a microflora natural, e para estudar então várias características deste processo patológico.

O periodontite apical (AP) é uma patologia comum de uma natureza inflamatório nos tecidos peridentais que cercam a raiz de dente. Esta doença dental pode causar a dor severa e deve ser tratada por um dentista. As opções do tratamento incluem o tratamento do canal de raiz (preliminar ou secundário), a cirurgia Endodontic, a extração do dente, ou a continuação dependendo dos resultados clínicos e radiográficos, e da opinião do clínico. O mecanismo desse processo inflamatório, embora estudado por várias décadas^{1,2,3, ainda}não é compreendido de forma compreensiva. Considerando a gravidade desta patologia, há, portanto, uma clara necessidade de pesquisa abordando sua natureza fundamental. Assim, os sistemas onde o estudo da AP é possível são de grande interesse científico.

Uma vez que o AP é um processo patológico complexo envolvendo os tecidos locais e o sistema imunológico, estudos in vitro são insuficientes para uma compreensão completa dos processos. O estudo de amostras clínicas desta doença também é problemático devido a limitações éticas e variabilidade significativa entre diferentes pessoas e diferentes estágios clínicos^4,5, e daí a necessidade de modelos in vivo. Esses modelos baseiam-se no conceito de expor a polpa dentária à contaminação e observar a reação inflamatória do corpo a esse estímulo nos tecidos periapicais^6,7. Os modelos comuns in vivo incluem roedores ou animais maiores, como cães. Apesar do desafio clínico no tratamento de camundongos, que são animais muito pequenos com dentes em miniatura, as vantagens do modelo do mouse são significativas: praticamente, trabalhar com camundongos é tecnicamente simples em termos de instalações e é mais rentável, e cientificamente, o camundongo é um modelo animal bem estudado, com ferramentas genéticas e moleculares prontamente disponíveis e um genoma bem estudado. De fato, estudos prévios utilizaram um modelo de camundongo para o estudo de sinais de reabsorção inflamatória e óssea e células envolvidas na periodontite apical^8,9,10,11. Conseqüentemente, um protocolo desobstruído em como usar um modelo do rato para o estudo do AP é necessário. Aqui, nós descrevemos tal protocolo.

O protocolo descrito aqui é tem a grande vantagem de ser apropriado para estudar knock-out (KO) camundongos e aprender como a falta de um gene específico afeta a inflamação dental^7,12. Outras aplicações úteis deste protocolo incluem o estudo dos efeitos dos medicamentos e as condições sistêmicas sobre o desenvolvimento da periodontite apical¹³, o efeito da periodontite apical no desenvolvimento de osteonecrose das mandíbulas^{14 , 15} e terapia com células-tronco para regeneração óssea¹⁶.

Este protocolo também pode ser generalizado como um modelo para estudar a inflamação local. Para estudar o processo inflamatório, vários modelos de mouse foram desenvolvidos, que incluem, por exemplo, colite induzida ou artrite^17,18. Estes modelos têm efeitos sistêmicos e não têm controle embutido no mesmo animal. Modelos para periodontite apical induzida, que incluem um controle contralateral sem inflamação, têm a vantagem de superar essas limitações^14,19.

O protocolo descrito abaixo é, portanto, útil para pesquisadores que estão interessados em processos inflamatórios locais. A natureza controlada desta inflamação, seu confinamento a um local específico, e o dente de controle contralateral, todos tornam este protocolo valioso para o estudo dos mecanismos envolvidos nesse processo. Além disso, o protocolo é útil para pesquisadores interessados nos aspectos clínicos da inflamação periapical. O modelo do camundongo é ideal para estudar diferentes variáveis da doença, além da vantagem de ser capaz de realizar facilmente manipulações genéticas no modelo do camundongo, para investigar a atividade de genes específicos na inflamação periapical.

Tecnicamente, o procedimento clínico é desafiador para realizar devido às pequenas dimensões dos dentes dos camundongos. Será benéfico para visualizar este procedimento, a fim de aprender sobre o posicionamento, equipamentos necessários, e desempenho.

Protocolo

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais (IACUC) da Universidade Hebraica (ética não. MD-17-15093-5).

1. anestesia animal e posicionamento

1. Prepare soluções estéreis conforme descrito abaixo.
   1. Prepare 5 mL de 7 mg/mL de cetamina e 0, 9 mg/mL de medetomidina diluído em solução tampão fosfato (PBS)/Saline.
   2. Prepare uma solução estéril de Atipamezol (0,4 mg/mL) diluída em PBS/soro fisiológico (recomendado para preparar uma quantidade de 5 mL).
   3. Prepare uma solução estéril de mepivacaína (7,5 mg/mL) diluída em PBS/soro fisiológico para anestesia local (um frasco fornecido de mepivacaína é suficiente para um estoque de 7,2 mL).
2. Use 6-8 semanas de idade fêmeas C57BL/6 camundongos para o experimento. Mantenha os animais em uma unidade animal livre de patógenos (SPF) específica, com água e alimentos padrão fornecidos pela instalação e o ad libitum de alimentação animal.
3. Pesar camundongos e injetar via intraperitoneal (IP) um volume de 10 μL para cada grama do peso. Por exemplo, para um rato que pesa 20 gramas,
   injectar 200 μL de solução de cetamina/medetomidina. Isto dará uma concentração final de (70 mg/kg) de cetamina e (0,9 mg/kg) medetomidina
   para cada animal.
4. A fim de prevenir a ulceração ocular devido à secura durante o procedimento, aplique pomada ocular contendo cloranfenicol (5%) nos olhos dos animais enquanto eles estão anestesia. Mantenha os animais quentes com uma lâmpada enquanto eles são anestesiados. Verifique a profundidade da anestesia verificando o reflexo do pedal (realizando uma pitada firme do dedo do pé).
5. Depois que o mouse é anestesiado, posicione o mouse deitado em seu lado direito (para um pesquisador destro) em uma superfície de espuma de poliestireno extrudido de célula fechada e anexar os pés à superfície usando fita.
6. Abra a boca usando pequenas bandas de borracha em torno dos incisivos (1 para os incisivos superiores, e 1 para os incisivos inferiores) mantidos no lugar por agulhas longas fixadas na superfície de espuma de poliestireno extrudido de célula fechada.
7. Retrair a bochecha direita usando fórceps gravado na superfície. Use fórceps que são fechados no estado estacionário.
8. Coloc a superfície com o rato em uma posição de funcionamento confortável permitindo o acesso aos molares mandibulares, usando a ampliação apropriada (um microscópio binocular ou um microscópio clínico) e a luz.
9. Retrair a língua usando fórceps ou espátula dentária e injetar anestesia local com uma agulha calibre 27 na prega mucovestibular adjacente ao primeiro molar mandibular. 25-50 μL é suficiente. O inchaço do tecido ao redor do local de injeção deve ser visualizado.

2. exposição da polpa

1. Use uma rebarba dental redonda 1/4, ou uma rebarba do diamante do mesmo tamanho (uma pata longa é recomendada) em uma velocidade de 800 rodadas por o minuto (rpm), unida a todo o motor dental apropriado (por exemplo um motor automático da redução do torque (ATR)).
2. Perfure a parte oclusal do primeiro molar mandibular direito até que os chifres da polpa sejam visíveis através da dentina. usar rajadas curtas do motor para evitar a área de aquecimento.
3. Use um arquivo K ou H-File #8 ou #10 para perfurar a polpa e inserir o arquivo nos chifres de polpa (mesial e distal), quebrando a dentina cobrindo-os. Os arquivos são esterilizados por autoclave.
4. Continue trabalhando com os arquivos dentro da polpa o mais profundo possível, enquanto alargando as aberturas com os arquivos. Normalmente, haverá sangramento visível da polpa.
5. Certifique-se de arredondar bordas afiadas do dente com a rebarba e remover o dente da oclusão, a fim de reduzir a dor durante o experimento. Limpe os detritos durante o procedimento com um micropincel.
6. Deixe o dente contralateral (Primeiro molar mandibular esquerdo) como um controle.

3. fim do procedimento clínico

1. Solte o mouse do estado de fixação e injete o IP de Atipamezole (10 μL para cada grama de peso corporal. Isto dará uma dose final de (4 mg/kg) de Atipamezol.
2. Injetar buprenorfina diluído em PBS/soro fisiológico (0, 5 mg/kg) IP (recomendado para preparar uma quantidade de 3 mL no dia do procedimento). Veja a discussão para a explanação porque o relevo de dor é necessário.
3. Certifique-se de que os animais se recuperem da anestesia antes de deixá-los. Dê-lhes o alimento macio porque podem ser incapazes de comer o alimento duro devido à dor de dente.

4. acompanhamento pós-procedimento (42 dias)

1. Durante os primeiros 3 dias após o procedimento, pesar os animais e injetar buprenorfina (0,1 mg/kg) IP uma vez por dia (recomendado para preparar uma quantidade de 6mL).
2. Durante o tempo do experimento (42 dias quando a inflamação se acumula) monitorar os animais por peso e avaliação comportamental geral 2-3 vezes por semana.
3. Entregar alimentos moles para os animais durante o período de acompanhamento. Molhe o alimento com água e põr o em um petri-prato no assoalho da gaiola.

5. término e análise do experimento

1. Quando 42 dias¹¹ de seguimento foram concluídos, anestesiam os animais IP com cetamina/xilazina numa concentração de 106,25 mg/kg de cetamina, e 75 mg/kg de xilazina (uma solução de stock de 42,5 mg/ml de cetamina e 1,5 mg/ml de xilazina num volume total de 2 ml é recomendado) e luxação cervical pré-forma.
   Nota: existem diferentes opções para possíveis análises a fim de avaliar a inflamação^20,21. Aqui a análise do tecido pelo micro-CT e pela mancha histológica será descrita.
2. Após a eutanásia, use tesouras cirúrgicas e fórceps para cortar parte da mandíbula, incluindo os 3 molares (separadamente para cada controle lado-Tratado e não tratado). Usando o fórceps descasque fora tanto quanto o tecido macio como possível, deixando na maior parte o osso e os dentes na amostra.
3. Enxague brevemente o tecido em PBS e, em seguida, coloque-o em paraformaldeído (PFA) 4% (diluído em PBS) por 24-48 horas para fixação.
   Cuidado: Use PFA em uma capa química, e de acordo com suas diretrizes de ficha de dados de segurança de material (MSDS).
4. Após 24-48 horas, enxágüe com PBS 3x a fim lavar para fora o PFA.
5. Micro-TC
   1. Para a análise do Micro-CT, tome os tecidos colhidos (parte do mandíbula que inclui 3 molares, nas dimensões de aproximadamente 4 milímetros x 5 MMX 1 milímetro) a um varredor do Micro-CT, coloc os em um tubo do diâmetro de 12 milímetros enchido com os 1,5 ml do PBS orientados de modo que as superfícies orais ou lingüais do dente e da raiz estão colocando paralela à parte inferior do tubo. Separe entre as amostras com esponja, e cubra a parte superior do tubo com filme flexível.
   2. Abra o painel de digitalização e escolha o número da medição. Escolha o arquivo de controle com os seguintes parâmetros: energia de 70 kV, intensidade de 114 μA, e resolução de 6 μm³ tamanho VOXEL.
   3. Clique na visualização do Scoute, quando a imagem for exibida, clique em linha de referência e marque a área das amostras para digitalização. Após cada amostra, clique em Adicionar digitalização. Quando terminar de marcar os exemplos, vá para a lista de tarefas e escolha iniciar tarefas de interação.
      Nota: as mesmas amostras podem subseqüentemente ser usadas para a histologia. É importante que eles não secam durante a TC-Scan.
6. Use um programa de computador apropriado para o alinhamento e a análise do Micro-CT.
   1. Abra a amostra no plano XY na avaliação de microtc. Escolha três pontos em cada amostra para o alinhamento:
      A constrição apical mesial-define a origem do sistema de coordenadas.
      A parte coronal do canal mesial-define um ponto no eixo Z.
      A constrição apical distal-define um ponto no plano XZ.
   2. Use a ferramenta de medição no painel esquerdo e desenhe uma linha atingindo cada ponto. Defina cada um dos três pontos por um X, Y & valor Z, como ele aparece no painel direito.
   3. Defina a área de interesse na amostra escolhendo tarefa em avaliação do μcte clique em avaliação 3D. Um retângulo e uma janela com as dimensões por eixo aparecerá na tela. Combine as dimensões do retângulo para caber a área de interesse no eixo XY, clicando nos cantos com o botão do meio do mouse. Escolha as dimensões no eixo Z inserindo o primeiro número de fatia de interesse no quadrado Z em Iniciar voie o número de fatias do primeiro até o último número de fatia de interesse no quadrado z em Dim.
   4. Clique em aplicativos em Gerenciador de sessãoe escolha decterm. Aguarde alguns segundos para uma janela para abrir e, em seguida, digite as cinco etapas do script inclinado descrito abaixo de acordo com as seguintes instruções (entre as linhas clique em Enter):
      Ipl
      isq_to_aim
      aim1
   5. Copie o nome do ISQ (arquivo de interesse): escolha exibições em Gerenciador de sessões e clique em microctdata. Localize o arquivo que está sendo trabalhando e clique no botão do meio no arquivo. Em seguida, clique no meio de volta na janela do DECterm.
   6. Incorpore os valores de X, de Y & Z (com um espaço entre eles) que foram determinados voi ao escolher a região do interesse.
   7. Insira os valores X, Y & Z (com um espaço entre eles) que foram determinados Dim ao escolher a região de interesse.
   8. Aguarde até receber uma mensagem: ISQ para mirar concluído.
      (passo II-alinhamento):
      alinhar z
      aim1
      aim2
   9. Insira os valores X, Y & Z (com um espaço entre eles) que foram determinados para a origem do sistema de coordenadas.
   10. Insira os valores X, Y & Z (com um espaço entre eles) que foram determinados para o ponto no eixo Z.
   11. Insira os valores X, Y & Z (com um espaço entre eles) que foram determinados para o ponto no plano XZ.
   12. Aguarde até receber uma mensagem: "align_Z concluída"
       (passo III-cabeçalho):
       Cabeçalho
       aim2
       0 0 0
       0 0 0
   13. Clique em Enter.
       (passo IV-convertendo o arquivo de volta do objetivo para ISQ):
       o toisq
       aim2
   14. Copie o nome do ISQ (arquivo de interesse): escolha exibições em Gerenciador de sessões e clique em dados do microct. Localize o arquivo em que você está trabalhando e clique no botão do meio no arquivo. Em seguida, clique no meio de volta na janela do DECterm. Erase (usando "Backspace") o ". ISQ "no final do arquivo e escreva:" _ New. ISQ "para reconhecer o arquivo alinhado.
   15. Clique em Enter | Enter (entrar).
   16. Aguarde até receber uma mensagem: "toisq_from_aim Completed"
       (passo V-Flip):
       Cei
       Um
   17. Copie o novo nome ISQ (arquivo de interesse): escolha exibições em Gerenciador de sessões e clique em dados de microct. Localize o arquivo que está sendo trabalhando e clique no botão do meio no arquivo. Em seguida, clique no meio de volta na janela do DECterm.
   18. Clique em Enter | Enter (entrar). Aguarde para receber uma mensagem: "isq_to_aim Completed"
       Flip
       Um
       Aa
       Zx
       Aguarde para receber uma mensagem: "flip_aim Completed"
       De
       Aa
   19. Copie o novo nome ISQ: escolha exibições em Gerenciador de sessão e clique em dados de microct. Localize o arquivo que está sendo trabalhando e clique no botão do meio no arquivo. Em seguida, clique no meio de volta na janela do DECterm. Erase (usando "Backspace") o ". ISQ "no final do arquivo e escrever:" _ flip. ISQ "para reconhecer o arquivo alinhado.
   20. Aguarde até receber uma mensagem: "from_aim_to_isq Completed"
7. Contorno
   1. Escolha a fatia que representa aproximadamente o meio do dente, em que a polpa coronal, a polpa radicular de ambos os canais, e ambos os forâmens apicais são apresentados.
   2. Marcar manualmente o contorno de interesse na fatia média clicando no painel de contorno superior esquerdo-a partir do ponto distal do ápice da raiz distal marca a borda apical coronalmente à área apical radiopaca, através da borda mesial do ápice da raiz mesial após a borda distal da raiz mesial e a borda mesial da raiz distal através da região de furcação (ver Figura 3 II, IV).
   3. Copie esse contorno (Ctrl + C, Ctrl + V) e ajuste-o de acordo com 5 fatias posicionadas em ambos os lados da fatia intermediária.
   4. Para calcular o volume de tecido do contorno marcado para cada amostra, escolha Task a avaliação do μcte clique em avaliação 3D. Na janela de avaliação 3D, clique em selecionar próxima tarefa e escolha um filtro para calcular o volume do tecido (TV).
8. Histologia
   1. Após a remoção dos tecidos do scanner micro-TC, descalcifique os tecidos colocando cada amostra em um tubo de microcentrífuga com 1 mL de ácido etilenodiaminotraacético (EDTA) 0,5 M pH 8,0 por 10 dias. Mude a solução de EDTA a cada 3 dias.
   2. Desidratação: colocar amostras em gavetas histológicas, e em aumentar as concentrações de etanol, uma hora cada, como segue: 70% etanol (neste ponto o processo pode ser interrompido por várias semanas, contanto que as amostras são mantidas em etanol), 90% etanol 2x, 100% etanol 2x, xileno 2x (cuidado: use xileno em uma capa química, e de acordo com suas diretrizes MSDS).
      1. Transfira as gavetas para a parafina líquida (60 ° c) e deixe na capa química durante a noite para que o xileno evate.
   3. Bloqueio: Use uma máquina de obstrução histológica para incorporar as amostras em parafina. Tenha cuidado para incorporá-los em uma posição correta (ou seja, a coroa e as raízes devem ser orientadas paralelamente à parte inferior do molde, de uma forma que o dente é "deitado"), a fim de obter seções sagital. As amostras estão agora prontas para serem cortadas com um micrótomo.
   4. Cortar as secções: começar por cortar fatias grossas de ~ 20 μm até atingir a parte relevante do tecido. Uma vez reconhecendo qualquer parte do dente (coroa ou raízes) mudar para seções de 6 μm, e mudar o ângulo de corte de acordo com a seção anterior.
      1. Por exemplo, se a seção anterior incluía a coroa, mas não as raízes, mude o ângulo do bloco no micrótomo para que as raízes se aproximem da faca, e a coroa volte (as partes do dente podem ser reconhecidas com um olho nu no próprio bloco).
      2. Continue a ajustar o ângulo até obter secções sagital, incluindo polpa coronal e radicular, e o forame apical. Corte nesta orientação o maior número possível de fatias, até que o tecido relevante seja cortado.
   5. Para os protocolos de coloração (por exemplo, hemotoxilina e coloração de eosina (H & e), coloração marrom & brenn, coloração fosfatase ácida resistente ao tartarato (armadilha), imunoistoquímica), ver^20,21.

Resultados

Um fluxograma das etapas experimentais é apresentado na Figura 1. Como mencionado no protocolo, os camundongos são anestesiados, e seu primeiro molar mandibular de um lado é perfurado até a exposição da polpa, enquanto o dente contralateral é deixado como um controle. Em seguida, os dentes são deixados para ser contaminado pela flora oral por 42 dias, durante o qual eles são monitorados e recebem medicação para a dor. Após 42 dias, os camundongos ...

Discussão

Um método é introduzido aqui para a indução do periodontite apical nos ratos. O objetivo do método é explorar a condição de periodontite apical para estudar mecanismos e conseqüências desse processo inflamatório. O periodontite apical foi induzido em 6-8 ratos velhos da semana, uma idade em que as raizes são desenvolvidas inteiramente²⁴. A fim causar o periodontite apical neste modelo, a polpa de dente de molares mandibulares do rato é expor usando uma rebarba dental. Bac...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atipamezole hydrochloride	Eurovet Animal Health	CAS 104075-48-1
ATR	dentsply	tecnika
blocking machine	Leica	EG1150H
buprenorphine	vetmarket	163451
clinical microscope/binocular	Olympus	Sz61
dental bur	Komet dental	ZR8801L 315 008
dental spatula	Premier	1003737
EDTA	J.T Baker	8993
entelan	mercury	1.07961
Eosin Y solution, alcoholic	SIGMA	HT110116
hematoxylin solution, Mayer's	SIGMA	MHS 16
Ketamine hydrochloride	Vetoquinol	CAS 1867-669
Medetomidine hydrochloride (cepetor)	CP-pharma GmbH	CAS 86347-15-1
Mepivacaine HCl 3%	Teva	CAS 96-88-8
microbrushes- adjustable precision applicators	PARKELL	S379
micro-ct scanner	scanco	uCT 40
parafin	Leica	39602004
PBS	SIGMA	D8537
PFA	EMS	15710
Chloramphenicol eye ointment (5%)	Rekah pharmaceutical	CAS 56-75-7
tweezers	WAM	Ref-CT
xylazine	Eurovet Animal Health	CAS 7361-61-7
xylene	Gadot	CAS 1330-20-7