Fizyolojik hasta, kanser kök hücrelerini hedef alan anti-neoplastik Ilaç taraması için 3B kürler türetilmiştir

Özet

Bu protokol, ilacın belirlenmesi için, hastanın türetildiği kürlerin oluşumunu, proliferasyonun ölçülmesi, sitotoksisite testi, akış sitometri, immünofluoresesans boyama ve konfoksel görüntüleme gibi aşağı akış analizini açıklar. anti-neoplastik terapötik olarak adayların potansiyeli. Bu protokol her hasta ve hastalığın aşaması için spesifik ilaçların tanımlanması ile hassas ilacı destekler.

Özet

Bu protokolde, biz 384 içinde tümör küreler nesil için prosedür anahat-iyi bir fizyolojik temsili mikroortamda anti-kanser terapileri yüksek verimlilik taraması için izin damlacıkları asılı. Biz hasta türetilmiş kanser kök hücre kürleri oluşumunu, yanı sıra, ilaç tedavisi sonrasında ayrıntılı analiz için bu kürlerin manipülasyon özetlemektedir. Özellikle, biz küroid morfoloji, proliferasyon, viability, ilaç toksisitesi, hücre fenotipi ve hücre yerelleştirme veri koleksiyonunu tarif. Bu protokol, 384-iyi asılı bırakma platformu kullanılarak kolayca uygulanan analiz tekniklerine odaklanarak yüksek verimlilik sağlayan ilaç taraması için idealdir. Biz yumurtalık kanser çalışmaları ve kanser kök hücre araştırma bu modelin önemini vurgulamak iken, 384-Well platformu diğer kanser türleri ve hastalık modelleri araştırma için, birçok alana platformun yarar uzanan imkan sağlar. Kişisel ilaç taramasının hızını ve kolayca uygulanan fizyolojik temsili 3D kültürlerle tarama sonuçlarının kalitesini geliştirerek, bu platform yeni terapötik ve hasta spesifik gelişimine yardımcı olmak için tahmin edilmektedir tedavi stratejileri ve böylece geniş kapsamlı klinik etkiye sahiptir.

Giriş

Dünya çapındaki kanserle ilgili mortalite, 2018¹' de 9.800.000 ölümlere ulaştı ve gelişmiş terapinin gelişmesine ihtiyacı vurgulandı. Ne yazık ki, kanser ilaçların geliştirilmesi maliyeti artmaktadır, tek bir ilacın gelişimi ile yaklaşık 650.000.000 USD² yeni anti-kanser ilaçları geliştirmek için gelişmiş stratejiler ihtiyacını gösteren. Kanser kök hücreleri (CSCs), artan kemoresistans ile karakterize edilir³, kendini yenilemek için kapasite, ve yeni tümörler tohum yeteneği⁴ tümör nüks sorumlu olduğu düşünülmektedir⁴, metasür⁵, ve kemoterapi^4,6, tüm tümör malign kapasitesine katkıda ve böylece yüksek ölüm ücreti. Yumurtalı kanserde, bu hücreler periton boşlukta malign asit sıvısında zenginleştirilmiş olarak bulunur, kötü klinik sonuçlar ile ilişkili bir durumdur¹. CSCs 'nin malign yetenekleri sonucunda, geleneksel kemoterapiler ile birlikte kullanılmak üzere yeni CSC hedefleme ilaçları geliştirmek için bir itme olmuştur. CSC hedefleyen ilaçların gelişimine eşlik eden çeşitli zorluklar vardır: 1) CSCs in vitro genişletilmesi ve bakımını yapma zorluk; 2) hasta örneklerinin kıtlık; 3) kültür platformunun fizyolojik alaka; ve 4) hastalar arasında ilaç hassasiyetinde heterojenlik. Bu protokol, bu zorlukların her birinin üstesinden gelebilmek için yüksek verimlilik sağlayan 3D kültür platformunun uygulanmasını özetliyor. Özellikle, bu sistem hasta türeyen ovaryalı CSCs az sayıda kullanarak hızlı ilaç taraması için izin verir, ve son derece aşağı akış analizi teknikleri için imkan sağlar. Yumurtalı kanserleri ve CSCs 'leri incelemek için ideal olan platformumuz, karmaşık 3D ortamlarda diğer kanserleri ve farklılaşmış hücre tiplerini incelemek için de değerlidir.

Kompleks 3 boyutlu (3D) modeller, kanser hücrelerinden oluşan bir 3D niş olan tümör mikroortamının (TME), kanser olmayan destek hücrelerinden ve hücre dışı matriks (ECM) proteinleri⁴' ün incelenmesi açısından önemlidir. Bu 3D ortam, benzersiz hücre morfolojisi, hücre hücresi ve hücre matris etkileşimleri, hücre farklılaşma, hücre göçü, hücre yoğunluğu ve difüzyon degradelerinin geleneksel 2D hücre kültürüne göre in vitro⁴' e kıyasla sonuçlanır. Tüm bu faktörlerin 3D kültürler içinde diferansiyel ilaç tepkisi sonuçlanan, artan ilaç direnci ve fizyolojik alaka sergiler^7,8. 3D TME 'nin CSC farklılaşma ve kemoresistleşme rolü nedeniyle, fizyolojik mikroortamlarda CSC hedefleyen ilaçlar için ekran için hayati önem taşımaktadır. CSC ilaç tarama platformlarının fizyolojik alaka iyileştirilmesi hastanın spesifik ilaç taraması, ilaç gelişimi, tedavi stratejileri formülasyonu ve sonuçta klinik sonuçlar geliştirmek için potansiyele sahiptir. İlaç taraması için kullanılan platformun yüksek verim ve maliyet, zaman ve umut verici ilaçların klinik çeviri süresini en aza indirmek için aşağı akış analizi yöntemleri ile uyumlu olması aynı derecede önemlidir⁹.

Şu anda kompleks TME, fizin syngeneic tümör modelleri, hücre hattı tarafından türetilen xenograflar ve hasta tarafından türetilen xenograft (PDX) modelleri¹²gibi in vivo modellerde ilaç tarama uygulamaları için en iyi şekilde korunur, fizyolojik Koşul -ları. Ancak, bu modellerin düşük verim doğası, yanı sıra, maliyet, zaman, ve teknik beceri setleri hızlı, yüksek verimlilik ilaç tarama uygulamaları¹³onların yardımcı sınırları gerektirir. Bu in vivo modellerde alternatifler olarak, Hidrojeller⁸kullanan birçok in vitro 3D modelleri, mikroakışkan cihazlar içinde kültür veya ' organ-on-a-Chip ' cihazlar^10,14ve olmayan-yapışmaz kültürler^3,8 Ayrıca, maliyet, zaman ve gerekli skillset açısından giriş için düşük bariyer nedeniyle, geliştirilmiştir.

Hidrojel kültür platformları, matris bileşimi, mekanik özellikler ve matris yapısı¹⁵' te sağlanan ince kontrolde avantajlıdır; Ancak, yüksek yoğunluklu hücre kültürü inhibe edebilir¹⁴. Ayrıca, hidrojellerin gelen hasat hücreleri aşağı analiz karmaşıklığa neden olabilir, hasat yöntemlerinin potansiyel zararlı etkileri nedeniyle¹⁵. Mikrofluidik cihazlar, diğer taraftan, aynı cihaz içinde ve hücre kültürü için en az reaktif tüketimi ile fizyolojik olarak ilgili ölçeklerde çıkış algılaması için izin mikroölçekli cihazlar, azalma reaksiyon süresi, minimize atık ve hızlı difüzyon¹⁴. Bu özellikleri onları uyuşturucu toksisitesi, etkinliği ve farmakokinetiği araştırmak için umut verici platformlar olun. Ancak, verimli, ölçülebilir, reproducible ve Kullanıcı Dostu 3D hücre kültürünün zorlukları, hem de, hantal ve pahalı pompalama sistemleri yüksek verimlilik araştırma¹⁰mikrofluidik uygulamalar kısıtlı vardır. Verimli algılama kurulumları ve alanlarda potansiyel olarak zor uygulama da mikrofluidik sistemlerin yaygın benimsenmesini engelledi¹⁰.

Aksine, dönen mikserler (nutators), ultra-düşük ataşman plakaları ve asılı damlacıklar içinde olmayan-yapışmaz koşullarda oluşturulan küreler Kullanıcı tanımlı matris bileşenleri içermez. Bu metodolojiler özellikle yumurtalı kanserleri incelemek için ilgilidir, çünkü non-yapışkanlık koşullar, kürlerin periton kavite içinde büyümesini sağlayan koşulların temsilcisidir⁵. Bu olmayan-yapışmaz kültür yöntemleri içinde, nutator ve asılı damla küreler yüksek sıkıştırma sergiler gösterilmiştir, remodeling, ve kemoterapi Ultra düşük ataşman plakaları oluşturulan küreler karşılaştırıldığında, artan fizyolojik düşündürmektedir alaka^16,17,18,19. Daha küçük iyi boyutlarda ve minimum gerekli hücre numaralarından yüksek verim taraması için artan kapasite nedeniyle, asılı damla plaklarda küroid üretimi ilaç taraması için ideal bir platformdur. Burada, 384 içinde ayarlanabilir bir 3D fizyolojik platform sunuyoruz-iyi asılı damla plakaları, bu uygulama kolay ve yüksek akış analizi için yüksek verim, yumurtalı kanser ve yumurtalı CSCs üst verimlilik ilaç taraması için ideal hale.

3D fizyolojik platformumuz, fizyolojik hücre-hücre kontakları, difüzyon degradeleri, hücre yoğunlukları ve doğal olarak üretilen ECM proteinleri dahil olmak üzere 3D kültürünün tüm avantajlarını sağlar ve bu da gerçekçi ilaç yanıtlarını¹⁶' ya katkıda bulunabilir^{, 17,18,19}. Buna ek olarak, hasta türevi CSCs ile bu küreler oluşturarak, hasta tümör içinde bulunan heterojenlik üstesinden gelmek için, aynı anda birçok teknik çoğaltır ile ilaçlar¹ hasta özel tepkiler belirlemek edebiliyoruz örnekleri²⁰. Ayrıca, 3D kültür CSC nüfusu^3,16 bakımını artırmak için gösterilmiştir ve böylece asit⁷zenginleştirilmiş CSC nüfus temsilcisi. Bu kolay akış analizi ile birlikte, canlılığı ve CSC oranlarında akış sitometri analizi de dahil olmak üzere CSC en iyi değerlendirme için ilaç etkinliğini hedefleme sağlar. Son olarak, bu fizyolojik platform, deney sırasında birden çok zaman noktasında görüntüleme, hücre ölümü ve proliferasyon, hücre organizasyonu ve immünhistokimya ile morfolojinin değerlendirilmesi, ELıSA ile çözünür sinyalizasyon ile uyumludur Orta, akış sitometri ile hücre fenotipleri, ve gen ifadesi aşağıdaki PCR.

Protokol

Tüm hasta örnekleri, tümör debulking ve asit koleksiyonundan sonra numuneler de tanımlanmakta olan, onaylayan hastalarından onaylanmış bir ıRB Protokolü altında toplanır.

1.384 yılında küçük hücre numaralarından küreler üretimi-iyi asılı damla plakaları

1. Asılı damla plakasını steril deiyonize (dı) suyla dolu bir sonicator içine yerleştirin ve 20 dakika boyunca sonikat yapın.
2. Eldivenli bir el ile, plakayı sonicator 'dan çıkarın ve dı suyu çalıştıran ile yıkayın.
3. Plaka bir banyoda oturmak izin 0,1% Pluronik asit için 24 h için protein adsorpsiyon ve kuyular küroid uyumu önlemek için.
4. Plakalı bir el ile plakaları çıkarın ve DI suyu iyice çalıştırması ile plakanın her iki tarafını durulayın.
5. Steril bir ortamda kuyulardan su çıkarmak için bir biyoemniyet kabininin içindeki plakayı şiddetle dokunun veya sallayın.
6. Plakaları sterilize etmek ve kontaminasyonunu en aza indirmek için her tarafta 30 – 60 dakika boyunca UV ışığı altında plaka yerleştirin.
   Not: Plaka Ayrıca sterilizasyon için bir odada etilen oksit gazına maruz kalabilirler.
7. 4-5 ml steril Otoklavlanmış dı su ve sandviç kapak ve 6-well plaka alt arasında asılı damla plaka ile her iyi bir 6-kuyu plaka doldurun. Buharlaşma için kayıp hacmi en aza indirmek için nemli, istikrarlı ve steril bir ortam sağlamak üzere asılı damla plakasının kenarına 800 – 1000 μL steril dı suyu ekleyin (Şekil 1 a-C).
8. 2D yetiştirilen hücreler için, büyümeye günlük aşamasında orta kaplama hücreleri Aspire ve 1x fosfat tamponlu tuz ile yıkayın (PBS) büyüme ortamında fetal sığır serumu (FBS) izlerini kaldırmak için, bu tripsin eylem engeller gibi.
9. PBS aspirate ve 100 mm doku kültürü çanak% 0,25 Trypsin-EDTA 1,5-2 mL ekleyin. 37 °C ' ye ayarlanmış bir kuluçte 5 dakika hücrelerine inküye yapın.
   Not: Hücreler farklı oranlarda ayırabilir, bu yüzden plakaları 5 dakika sonra hücre dekolmanı sağlamak için bir tezgah ışık mikroskop kontrol edilmelidir. bir hücre çizgisi kullanırken satıcı talimatlarını başına dekolmanı protokolünü ayarlayın.
10. 6 – 8 mL hücresel orta içeren FBS veya herhangi bir serum, tripsin nötralize etmek için, 10 mL serolojik pipet ile hücreleri toplamak ve 15 mL konik tüp onları mevduat.
11. Bir hemokytometre her tarafında 10 μL hücre süspansiyonu yükleyerek hücreleri saymak ve ilişkili sayım protokolünü izleyin.
12. Primer veya metastatik katı tümörlerden veya 2D kültürlü olmayan asitlerden toplanan hasta türevi hücreler için, daha önce³tarif edilen serum serbest Orta (SFM) tek hücreli süspansiyonları hazırlayın.
13. Daha önce açıklanan ve uygun donma orta^21,22daha sonra kullanmak için tek hücreli süspansiyonlar depolamak olarak işlem tümör dokular.
    1. Solid tümör dokusu için, bir tıraş bıçağı ile mekanik olarak kıyma ve istenilen hücreleri yoğunluk gradyanından yalıtmadan önce 40 μm filtreli bir filtre ile çözüm elde edilir^21,22.
    2. Asit örnekleri için, santrifüjleme ile konsantre hücreler, amonyum klorür-potasyum (ACK) tampon içinde Lyse kırmızı kan hücreleri, 1x PBS yıkayın ve sonra bir 40 μm filtre ve 28 G iğne 4 kez²²geçer.
14. Yumurtalı CSCs 'lerin yalıtımında, Akış sitometrisi içeren hücreleri ayrıntılı olarak aşağıda açıklandığı şekilde sıralayabilirsiniz.
15. Taze izole tek hücreler depolama için dondurulmuş ve deney için gerektiğinde çözülmüş.
16. Kaplama için hücre süspansiyonu hazırlamak için, kaplama için gerekli hücre çözeltisi istenen hacmi hesaplamak: damla başına 20 μL X toplam damlacıklar sayısı = toplam çözüm hacmi gereklidir.
17. Hücre konsantrasyonunu 20 μL başına istenilen hücre konsantrasyonuna seyreltin (örn. 20 μL damlası içinde 100 hücre).
18. Hücrelerin homojen dağılımı sağlamak ve damlacıklar arasında tekdüzelik geliştirmek için kaplama önce hafifçe pipet kullanarak hücre süspansiyon karıştırın.
    Not: Hücre süspansiyon aşırı karıştırma hücre ölüm ve enkaz asılı damla kürler neden olabilir.
19. Her asılı damlası içine yaklaşık 45 ° ve pipet 20 μL hücre çözeltisi bir açıyla kuyu içinde pipetin ucunu yerleştirin.
    Not: Kaplama desenleri, gerekli olan küre sayısına bağlı olarak ayarlanabilir. Her kuyunda kaplama küreler, bir denemede büyük miktarlarda küre gerekmediği zaman daha güvenlidir, çünkü damlacıkları yanlışlıkla birleştirmeyi önler (Şekil 1D, E). Bir deney için büyük miktarlarda küre gerekiyorsa, her tarafta bir satır sınır kuyuları her tarafa bırakarak plaka (Şekil 1F).
20. 6-kuyu plakasının kapağını asılı damla plakasının üstüne yerleştirin ve nem kaybına karşı duyarsız, kenarları mühürlemek ve damlacıklar ek buharlaşmasını önlemek için bir esnek termoplastik şerit kullanın. Standart CO₂ nemlendirici kuluçta (% 5 Co₂, 37 °c) inkübe.
21. Her 2 – 3 günde bir kez, her bir alanda iyi içeren 2 – 3 μL ekleyerek, gerekli besin maddeleri için hücre kültürü ortamını doldurmak
    Not: Görüntülemenin ardından, görüntüleme sırasında hava pozlama buharlaşma yol açar gibi, her zaman asılı damla beslemek için tavsiye edilir.

2. hücre kültürü orta asılı damla küre plakaları ekleme

1. Bir biyoemniyet kabinindeki termoplastik şeridi ve kapağı çıkarın ve her bir asılı damlası içeren her bir kuyu için uygun kültür ortamının 2 – 3 μL değerini ekleyin.
   Not: Eklenen hacim damla boyutuna ve besleme arasındaki zaman miktarına bağlı olacaktır.
2. Beslendikten sonra, plakayı üst kapağa Kapla ve tabağını kuluçlağa koymadan önce dış kenarlara taze termoplastik şerit uygulayın.

3. faz kontrast görüntüleme Küroid morfoloji

1. Bir Biyogüvenlik kabininde plakanın kenarlarının etrafındaki termoplastik şeridi çıkarın.
2. Dikkatli bir şekilde kapak ile biyoemniyet kabininden 384-iyi asılı damla kürler plaka kaldırmak ve bir epifloresan mikroskop bir mikroskop tepsisine yerleştirin.
3. Asılı damla kürleri gözlemlemek ve istenilen görüntüleri almak için 4X, 10X veya 20X görüntüleme yazılımı canlı görüntüleme seçeneği kullanın.
4. Görüntüleri kaydettikten sonra, plaka geri Biyogüvenlik kabine ve besleme hücreleri yukarıda açıklandığı gibi alın.
5. Yeni bir termoplastik şerit ile yeniden mühürleyin ve mühürlü plaka geri kuluçla yerleştirin.

4. kürlerin içinde proliferasyon ve canlılık ölçümü

1. Her zaman noktası için > 10 Teknik çoğaltır elde etmek için yeterli sayıda kuyularda plaka küreler (yani, gün 1 ve gün 7) bu incelenecek.
   Not: Bu tahlil için kullanılan Wells genellikle resazurin boya potansiyel kirleticiler nedeniyle tekrar kullanılmaz.
2. Bu Kuyuları beslerken ve önceden belirlenmiş bir kuluçz dönemi için inküreme gibi proliferasyon analizi için belirlenmiş kuyulara 2 μL süzülmüş resazurin tabanlı çözüm ekleyin.
   Not: Bu inkübasyon süresi hücre tipine ve kürodaki hücrelerin sayısına göre değişebilir. 1 saatlik İnkübasyon sonrasında ölçümlere başlayarak proliferasyon deneylerinden önce gerekli olan inkübasyon süresini belirlemek ve kontrol kuyuları platosunda sinyal okununcaya kadar her 30 dakikada bir yeniden ölçme tavsiye edilir. Tahlil ölçümleri istenilen şekilde birçok kez alınabilir. Kuluçk genellikle 100 kanser hücreleri ile başlatılan kürler için 4 saat.
3. Mikroplaka okuyucuyu ilk kez ilk okuduktan en az 15 dakika önce ilgili plaka okuyucu yazılımını izleyerek, makinenin sıcaklık ölçümlerini etkileyebileceği için 22 °C ' de iç sıcaklığını ısıtmasına ve güvenceye alınmasına izin vermek için açın.
4. 530/25 Nm uyarma ve 590/35 nm Emisyon dalga boyları ile 384-kuyu plaka Protokolü seti açın, kazanç ayarlamak için, 35, hız normalolarak ayarlanan okuma hızı ve fluorcence ayarlamak türü okuma .
5. Kuluçç döneminden sonra, bir biyoemniyet kabininde asılı damla sandviç açın ve plaka okuyucu yerine kapak ile 384-Well plaka getirmek.
6. 384-kuyu plakasını, makine ısıtılan bir kez uzatılacak plaka okuyucu tepsisinde hala yerde kapıyla yerleştirin ve plakayı okumak için Tamam 'ı tıklayın.
7. İyi plakayı 6-well tabanına geri dönün ve onu kuluçağa yerleştirin. Gün boyunca tüm zaman noktaları okunsa, plakayı yeniden kuluçvanın içine yerleştirmeden önce tekrar mühürleyin.
8. Deneme açılır pencerede kaydedin ve sonra tıklayın Evet sorulduğunda, plaka 1 için powerexports , plaka okuyucu yazılımından kuruluş için bir elektronik tabloya çıkış verileri yürütmek istiyorsunuz.
9. Her koşul için Ortalama floresan değerleri ve çeşitli deneysel koşullarda proliferasyon kat değişikliği bildirmek için kontrol koşulu ortalamasına göre normalleştirmek.
10. 1. gün 7 ile karşılaştırıldığında, zamanla proliferasyon kat değişikliği elde etmek için gün 1 ortalama floresans bölünerek normalleştirmek.
11. Ortalama standart hata kullanarak hata çubuklarını hesaplayın ve öğrencilerin iki kuyruklu T testi gibi uygun bir istatistiksel test ile deneysel gruplar arasında istatistiksel önemini belirleyin.

5. kürlerde Ilaç toksisitesi değerlendirilmesi

1. Uyuşturucu İdaresi
   1. Her zaman küroid oluşumunun ardından, 2 μL dozun istenen son ilaç konsantrasyonu 10X içeren gibi istenilen konsantrasyona seyreltilmiş ilaç teslim.
      Not: Bu damlacık 2 μL bir buharlaşma varsayarak, böylece bitiş hacmi sonrası ilaç tedavisi 20 μL. Örneğin, 50 μm doz sisplatin, 500 μm hazırlanmış bir çözüme sahip olacaktır. Damlacıklar 20 μL 'den fazla içeriyorsa, ilaç konsantrasyonu ve/veya eklenen hacim buna göre ayarlanması gerekir.
   2. Kontrol örneklerini 2 μL hücre kültürü ortamı ile tedavi edin.
      Not: Cisplatin suda çözünsünler. Bu nedenle, 2 μL hücre kültürü orta denetimleridir; Ancak, ilaç aracı farklı bir solvent (örn., DMSO) ise, kontrol etmek, ilaç tedavisinde kullanılan DMSO eşit konsantrasyon ile hücre kültürü ortamı olmalıdır.
   3. İlaç toksisitesi yanı sıra resazurin boya ile hücre viability izlemek için yukarıda açıklandığı gibi etkisi görsel bir kayıt var faz mikroskopisi ile ilaç kuluçta döneminde tedavi ilaç ve kontrol kürüler izlemek için devam edin.
      Not: Genellikle, ilaçlar sonra eklenir 5 – 7 gün asılı damla ve toksisite sonra ölçülen 48 –-72 hs ama bu deney bağlı olarak değişebilir. İlaçlar en kısa sürede istikrarlı kürler, genellikle 1 – 4 gün arasında oluşmuş olarak eklenebilir.
2. Hücre sayımı ile ilaç toksisitesi ölçümü
   1. İlaç tedavisinin son zaman noktasında, 1.000 μL pipet kullanarak her bir kontrol ve ilaç tedavi kuyularından 10 kürü toplayın ve her bir set küoyu kendi mikrosantrifüj tüpüne yatırın.
   2. Tekrarlanan pipetleme ile kürleri tek hücrelere kırın.
      Not: Tekrarlanan pipetleme nedeniyle potansiyel hücre hasarını azaltmak için, pipetleme işleminden önce tek hücreli çözeltileri oluşturmayı kolaylaştırmak üzere tripsin gibi bir enzim ile enzimatik sindirim yapılabilir²³. Pipetleme nedeniyle hücre ölümü minimization hücre türüne bağlı olacaktır ve buna göre optimize edilmelidir. Eğer disaggregation nedeniyle ölüm hakkında endişe, resazurin boya ile analiz ve küroid disaggregation gerektirmeyen alternatif yöntemler için sitotoksisite tahlil bakın.
   3. Mikrosantrifüjlerin altındaki hücreleri toplamak ve supernatant Aspire için 400 x g 'de 5 dakika boyunca tüpleri santrifüjler.
   4. Her tüp için 20 μL taze medya veya 1x PBS ekleyin ve iyi karıştırın.
   5. Tripan mavisi, 2 μL tripan mavi leke oranına 20 μL hücreli süspansiyona kadar ekleyin.
   6. Hemokytometer her odasına 10 μL hücre ve tripan mavi süspansiyon yükleyin ve canlı hücreleri temsil eden ölü hücreleri ve lekelenmiş hücreleri temsil eden mavi lekeli hücrelerle, hafif bir mikroskop altındaki hücreleri saymak.
      1. Canlı hücre% = (canlı hücrelerin sayısı ÷ toplam hücre sayısı) x 100.

6. histolojik tekniklerle küroid karakterizasyonu

Not: İki kalıp seçenekleri 3D tarafından yapılan küroid dizi kalıpları çoğaltmak için biyouyumlu bir polimer basılmış olan Ivanov ve al.²⁴: 1) 20 iyi kalıp, 9 μL başına iyi ve 2) 63 iyi kalıp (şekil 2D), Iyi (rakam 2B) tutabilir.

1. % 70 etanol ile onları silerek Histoloji kalıp ve sınırını sterilize ve kalıp etrafında sıkıca kenarlık takın ve kalıp dik yatıyordu. Her iki kalıp yaklaşık uygun 3 mL sıvı (3,203 için mL 20 küroid dizisi ve 3,196 mL 63 küroid dizisi için).
2. Hafifçe kat küroid dizi 10.000 ile cSt si yağ bir sivri pamuk çubuk kullanarak numune işleme jel döküm sonraki adımlarla kaldırılması kolaylaştırmak için.
3. Numune işleme jeli, 10 – 20 s için mikrodalga ile sıvılaştırılana kadar ısıtın ve kap gevşetilir.
4. 2,6 arasında ekleyin ve 2,8 mL erimiş işleme jel kenarlık üst ile yaklaşık seviyeye kadar kalıp içine.
5. Birkaç dakika içinde, bir kez katılaştırılmış, kalıpla kenarlığı ayıran ve sonra dizi kalıp ters işleme jel döküm çıkarın.
6. Onları dikkatle ayırmak için kalıp ve sınır arasında cımbız ucu ekleyin ve sonra hemen ayrılmaz Eğer kalıp döküm çıkarmak yardımcı olmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.
7. Bir 100 veya 150 mm hücreli Petri çanak bir 1.000 μL pipet ile tek bir kuyu içeriğini pipetleme tarafından asılı damla plakasının kürleri hasat ve görsel olarak küre izole.
8. Pipet 5 μL iyi içindekiler de dahil olmak üzere, dizi kuyuların içine belirlenen küroid, dizi dolduruluncaya kadar.
9. Kürleri rahatsız etmek için dikkatli olmak her kuyuların içine yavaşça erimiş işleme jeli pipetleme önce dizinin altına yerleşmiş olduğundan emin olmak için 3 dakika bekleyin.
10. Dizi üst kapalı seviyeye ek işleme jel ekleyin ve bir kez soğutulmuş, işleme için etiketli bir kaset içine katılaştırılmış küroid dizi yerleştirin.
11. 4 °C ' de kürleri düzeltmek ve ardından 4 °C ' de% 70 etanol içinde depolama için hazır olana kadar% 4 formalin içinde altbirleştirme etiketli kaset.
12. Standart 1 h parafin programı ile işlem ve daha sonra işlenmiş diziler blok yüzüne en yakın kuyuların alt ile dik karşı karşıya olduğu gibi küroid diziler katıştırmak.
13. Diziler mümkün olduğunca düz olarak gömülü olduğundan emin olun, alt yüz bloğu ve buz üzerinde yer blokları alt ile Flush.
14. Bloğun mikrotome üzerine yükleyin ve blok Blade yüklenen blok yüz ile paralel olduğu şekilde ayarlayın.
15. Kesme dizisi (numune derinliği = 15 μm), dizi kuyularının altına ulaşıncaya kadar dairesel kuyuların kesme örneklerinde görünür olduğundan emin olun.
16. 5 μm numune derinliğine geçin ve şeritleri dilimlemek ve toplamak için devam edin. Eğer küroid derinliği ulaşıldı belirlemek için her birkaç dilim mikroskop altında kontrol edin. Bir kez küritler artık görünür olana kadar her sonraki slayt toplamak ulaşılır.
17. Her slaytı standart H & E protokolüyle lekeleyin.

7. canlı ölü sitotoksisite assay

1. Her asılı damla için, canlı hücre boya ekleyin, calcein-AM son konsantrasyon 2 μM, ve ölü hücre boya, etidium homodimer-1 son konsantrasyonu 4 μM, göz önünde bulundurarak damla hacmi 20 μL.
   Not: Hacimleri minimuma eklemek ve genellikle 2 μL boyaların birleştirilmesini korumak için deneyin.
2. Bir kapak ile 6-kuyu plakasına sıkışmış ve 37 °C ' de 45 dk için küreleri kuluçlağa geri yerleştirin.
   Not: Kürlerin boyutuna bağlı olarak, bu kuluçma süresi önemli ölçüde değişir. Örneğin, 400 μm altında bulunan küritler genellikle sadece 30 – 45 dk inkübasyon süresi gerektirir, ancak 800 μm ' ye yakın daha büyük küroidler 90 dk. inkübasyon süresi gerektirirler. İnkübasyon süreleri bir bireyin deneyi için optimize edilmelidir.
3. Sonraki görüntüleme için, bir Biyogüvenlik kabininde 1.000 μL pipet ile hasat kürleri ve her bir küre önceden temizlenmiş cam mikroskop slaytlar üzerine yatırın.
4. Cam üzerinden görüntü kürleri, ters bir Konfokal mikroskop üzerinde.
   Not: Küroların hasat edildiği laboratuvara konfokka mikroskop yakınlığı bağlı olarak, kürler ya slayt üzerine yerleştirilen orta orijinal damlacık veya% 2 agaroz içinde görüntülenmiş olabilir daha fazla istikrar küroid taşıma için gerekli ise.
5. Mikroskop yazılım çok boyutlu edinme modu kullanarak, 10X büyütme olarak DIC aydınlatma kullanarak küroid bulun ve sonra da küre kapsayan yükseklikleri belirlemek için z-düzlem tarayın.
6. Z serisi tıklayın ve z-tarama üst ve alt sınırı biraz küroid üst daha yüksek ve biraz daha düşük kürosı alt ayarlayın.
7. Calcein-AM (canlı hücreler; yeşil) için 488 nm ve etidium homodimer-1 (ölü hücreler; kırmızı) için 561 Nm, yazılım, maksimal kazanç ve her renk için minimal pozlama tarafından önerilen adım boyutu ile kürler Excite.
8. Tıklatın edinme bileşik z-yığını görüntü canlı ve ölü hücrelerin içinde küroid içinde elde etmek için.
9. Bileşik gelen ölü hücrelere karşılık gelen kanal piksel yoğunluğu yüzdesi karşı canlı hücrelere karşılık gelen kanal piksel yoğunluğu yüzdesini ölçmek için görüntü işleme yazılımı kullanarak canlı/ölü oranlarını ölçmek z-projeksiyon görüntüleri.
   Not: 2D projeksiyon ile bir 3B yapının ölçülmesine ilişkin sınırlamalar nedeniyle, asılı damla plakaları içinde canlı ve ölü floresans ölçmek için alternatif bir yöntem, calcein-AM ve etidium dahil protokolün ardından bir plaka okuyucu kullanmaktır homodimer-1 kiti.

8. immunofluorescence

1. Düşük erime ısı% 2 agaroz çözeltisi, bu nedenle çözüm viskoz ve sadece bir mikroskop slayt üzerinde erime noktası ve yer üzerinde agaroz yumuşak bir yatak oluşturmak için
2. % 2 agarose yumuşak yatağa üzerine damla 20 μL PBS iterek hasat küreler.
   Not: Bu hızlı bir şekilde yapılmalıdır, böylece agaroz kürolar gömülmeden önce katılaşma yapmaz.
3. Agaroz soğukları ve jelleri (5 dk. altında) içinde sıkışmış hasat edilen kürlü ile, küreleri düzeltmek için% 4 nötr tamponlu formalin ekleyin. Alternatif olarak, buz soğuk metanol ekleyin ve agarose gömülü kürleri-20 °C ' de 30 dakika düzeltin.
4. Her yıkamadan sonra PBS 'i atarak, 1x PBS ile her biri için 3x 5 dakika yıkayın.
5. 1x PBS 'de% 10 serum (örn. at serumu) ve% 0,15 sabun çözeltisi (Triton X-100) ile RT 'de 1 h engelleyin.
6. Her yıkamadan sonra PBS 'i atarak, 1x PBS ile her biri için 3x 5 dakika yıkayın.
7. Önerilen veya önceden belirlenmiş antikor seyreltme (yani, floresan etiketli phalloidin bir 1:100 seyreltme), istenilen floresan antikor ile leke kürleri, oda sıcaklığında en az 90 dk için inkükleştirici, ışık kaplı.
   Not: Protokoller antikor ve hedefe bağlı olarak farklılık gösterecektir ve antikor seyreltme denemeye bağlı olarak optimize edilmesi gerekebilir.
8. Görüntüleme kürleri için önceki bölümde özetlenen yöntemleri kullanarak ters Konfokal mikroskop ile floresan lekeli kürler görselleştirin.
9. Bileşik z-yığını görüntüler 3D morfoloji kürlerde gösterecektir.

9. Akış sitometrisi ile kanser kök hücre nüfusunun toplanması ve Analizi

1. Akış sitometri analizi için küroidlerin hazırlanması
   1. Bir 1.000 μL pipet kullanarak asılı damla plakaları her iyi küreler toplayın ve tekrarlanan pipetleme ile yükünün için 15 ml santrifüj tüp içine yatırın.
   2. Yukarıda özetlenen gibi hücre numarasını ve konsantrasyonu belirlemek için tripan mavi kullanarak bir hemasitometre üzerinde uygun hücreleri saymak.
   3. Aliquot hücre süspansiyonu, her biri en az 50.000 hücre içeren beş mikrosantrifüjli tüplere girer.
   4. Tüm tüpleri 400 x g 'de 5 dakika boyunca bir mikrosantrifüjde santrifüjün.
   5. 100 μL tampon içinde her tüp ve pelletini pelletten süpernatant aspirate.
   6. Etiket tüpleri "lekelenmiş", "DAPı", "APC-ISO", "DEAB" ve "ALDH/CD133", sırasıyla.
   7. APC-ISO tüpüne 0,5 μL APC-isotype antikor ve seri seyreltme ve üreticileri tavsiyesi ile belirlenen CD133 antikor 1 μL, ALDH/CD133 tüpüne ekleyin.
   8. 5 μL DEAB reagent ve 0,5 μL ALDH DEAB tüp ve 1 μL ALDH ALDH/CD133 tüp ekleyin.
   9. Yaklaşık 2 s için tüm tüpleri Vortex ve 37 °C ' de 45 dakika boyunca inkük.
   10. Tüm tüpleri tekrar Vortex ve 400 x g 'de bir mikrosantrifüjte 5 dakika santrifüjün.
   11. Etiket FACS tüpler "lekelenmiş", "DAPı", "APC-ISO", "DEAB" ve "ALDH/CD133" ve bir kenara koymak için yalıtılmış bir köpük kap doldurun.
   12. 400 μL FACS tampon (1x PBS ile 2% FBS) ve diğer tüm tüpler 400 μL FACS dapi tampon (300 μM 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole ile FACS tampon) aspirate süpernatant ve pelletini "lekelenmiş" kontrol.
   13. Bir akış cytometer üzerinde analiz kadar buz ile konteyner içine borular yerleştirin.
       Not: Yumurtalık kanseri kök hücreleri için sıralamak için, sitometrenin aldh + ve CD133 + kapıları ile 0,5% olmayan spesifik APC sinyali ve 0,15% non-spesifik aldh + sinyal dahil ayarlamak için önlemler tüm hücreleri toplamak. En az 10.000 hücrelerin güvenilir sonuçlar için analiz edilmesi gerekir. Ek Detaylar son yayınlar^3,17bulunabilir.
2. FlowJo 'da ALDH +/CD133 + nüfusunun Analizi
   1. Programı açmak için flowjo simgesine çift tıklayın ve akış cytometri yazılımından elde edilen. FCS dosyalarını çalışma alanına sürükleyin.
   2. Lekelenmiş dosyayı çift tıklatın ve y ekseni için yan dağılım yüksekliği (SSC-h) ve x ekseni (FSC-h) dağılım yüksekliği iletmek için ayarlayın.
   3. Farklı hücre popülasyonları arasındaki ayrımı maksimize etmek için ölçek ve dönüşümü ayarlamak üzere her eksen yanındaki T düğmesini tıklatın.
   4. Çokgen gating düğmesini tıklatın ve hücre popülasyonu etrafında bir çokgen kapısı çizin ve nüfus ' hücreler ' etiket.
   5. ' Hücreler ' popülasyonunun yalnızca hücrelerini görüntülemek için çalışma alanındaki hücreler popülasyonunu çift tıklatın ve ardından FSC ekseni üzerinde FSC genişliğine tıklayın ve ardından SSC eksenini tıklatın ve eksen kanalını FSC-H olarak değiştirin.
   6. Dikdörtgen kapısı aracını seçin ve sol en yoğun popülasyonun tamamını yatay olarak kaydırma yapmak için y ekseninin tümünü kapsayan bir dikdörtgen çizin ve bu kapının ' tek hücreler ' etiketini etiketleyin.
   7. Sağ tıklatın ve hücreleri ve Iç Içe tek hücreler kapısı kopyalayın ve çalışma alanında her örnek altında yapıştırın.
   8. Çift tıklatın tek hücreler kapısı DAPI örnek altında iç içe örnek tüp tek hücre popülasyon görüntülemek ve FSC eksenini tıklatın ve eksen kanalı DAPI-alan kanalına değiştirmek için çalışma alanında.
   9. SSC eksenini tıklatın ve eksen kanalını histogramolarak değiştirin.
      Not: canlı hücreler DAPı dışlarken sol doğru olacak, ölü hücreler DAPı alır ve grafiğin sağında görünür iken.
   10. Dapi ekseninin yanındaki T düğmesine tıklayın ve DAPI pozitif ve dapi negatif zirveleri arasındaki ayrımı maksimize etmek Için ölçeği ayarlamak için ekseni Özelleştir 'e tıklayın.
       Not: Ölçekleme seçenekleriyle bir pencere açılacaktır. Sıklıkla, Ölçek alanını biex 'e ayarlayarak ve ekstra negatif on yıl ve genişlik temelini ayarlarken en büyük ayrılık gelir.
   11. Ölçeklendirme değişikliklerini uygulamak için açılır pencerede Uygula 'yı tıklatın, Aralık kapısı düğmesini seçin ve canlı hücre POPÜLASYONUNA karşılık gelen DAPI negatif zirvesine yayın.
   12. Etiket Bu kapı ' canlı hücreler ' ve sağ tıklayın ' tek hücreler ' kapısı altında ' APC-ISO, ' DEAB ' altında yapıştırmak için ' canlı hücreler ' kapısı kopyalamak için, ve ' ALDH/CD133 ' tüpler her örnek tüp canlı hücrelerin aynı kısmını seçmek için.
   13. Sonra APC-ISO örnek dosyasının altında yuvalanmış canlı hücreler popülasyonunu çift tıklatın ve x EKSENINI aldh — alan kanalına ve y EKSENI için APC — alan kanalına geçin.
   14. Yine, T düğmesini tıklatarak ve her eksen ekseni özelleştirmek böylece olayların Plot sol alt bölgede lokalize ve Quad Gate seçeneğini seçin ve bir çeyrek kapısı kurmak için çizim penceresini tıklatın Eksen ölçeği ayarlayın .
   15. Popülasyonun yaklaşık% 0,5 ' ü Arsa penceresinin sol üst veya ' APC pozitif ' çeyreği gibi kapının kesişimini ayarlayın.
       Not: Bu% 0,5, APC isotype 'ın spesifik olmayan renkleme özelliğini temsil eder.
   16. Her çeyrek etiketi çalışma alanında tek başına sağ tıklatın ve bunları uygun şekilde yeniden adlandırın. Denetim veya komut çalışma alanında her çeyrek kapı etiketini tıklatın ve kopyalayın.
       Not: ' Q1 ' CD133 + hücreleri temsil eder; ' Q2 ' CD133 + ve ALDH + ' hücrelerini temsil eder; ' Q3 ' ALDH + hücrelerini temsil eder; ve ' S4 ' CD133-ve ALDH-hücreleri temsil eder.
   17. Çeyrek kapıları ' DEAB ' dosyası altında yuvalanmış canlı hücreler nüfusu üzerine yapıştırın. Hücre popülasyonunun yaklaşık% 0,15 ' i ' ALDH + ' çeyreği içinde yer alan yatay çizgiyi taşımama özen gösteren dikey çizgiyi ayarlayın.
       Not: Bu% 0,15 özel ALDH sinyalini temsil eder.
       1. Yatay çizginin konumu değiştirdiğinden emin olmak için, Deab dosyasının altına yuvalanmış yeni çeyrek kapıları KOPYALAYıN ve APC ISO dosyasının altındaki canlı hücrelere yapıştırın. Mevcut çeyrek kapısı yerine sorulduğunda Evet 'i seçin.
       2. Çalışma alanında doğrulayın ' CD133 + ' yüzde hala yaklaşık 0,5 ' APC-ISO ' dosyası altında.
   18. Kopyala ve ' ALDH/CD133 ' dosyasının ' Live Cells ' nüfusu için çeyrek kapıları yapıştırın.
       Not: Sağ üst çeyreğinde bulunan uygun hücre popülasyonunun yüzdesi, örnek içinde ALDH + ve CD133 + çift pozitif CSCs 'nin yüzdesi olacaktır.

Sonuçlar

Hücre hatları veya hasta türevi CSCs ile oluşturulan küreler, asılı damlacıklar içinde bir dizi küçük hücre numarası ile oluşturulabilir (Şekil 2a). Küreler, nadir görülen hasta örneklerinin korunması için izin veren en az 10 hücre ile güvenilir bir şekilde oluşturur. Bu kürlerin içindeki hücreler, fizyolojik hücre hücresi kontakları ve difüzyon oranlarına izin vererek 3 boyutta diğer hücrelerle çevrilidir. Kürlerin içindeki tümör hücreleri, kürleri...

Tartışmalar

3D küroid oluşumu için 384-iyi asılı damla plaka platformu herhangi bir hücre biyoloji veya kanser biyoloji Labs için kolayca uygulanan bir araçtır. Bu fizyolojik platform, fiziksel olarak ilgili 3D kültürler içinde hücre hatları, yanı sıra, primer hasta örnekleri çalışma sağlar yüksek verim ilaç taraması için izin verirken. Platform ayrıca kültür koşullarının son derece ayarlanabilir olmasını sağlar, kaplama yoğunlukları üzerinde sıkı kontrol sağlayan, hücre Co-kültür oranları...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	ILT25200056
10 mL serological pipet	Fisher Scientific	13-678-11E
10,000 cSt Si oil	Millipore Sigma	63148-62-9	Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold.
100 mm tissue culture dish	Thermo Scientific	130182
15 ml conical tube	Celltreat	FL4021
1X DMEM for Serum Free Medium	Gibco	11965-092
1X F12 for Serum Free Medium	Gibco	11765-054
1X phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	ILT10010023
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher	D1306
40 µm filter	Fisher Scientific	22363547
6-well plate	Fisher Scientific	353046
Accutase	Innovative Cell Technologies Inc.	1449	A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes.
ACK Lysing Buffer	Thermo Scientific	A1049201
alamarBlue	Invitrogen	DAL1025	Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent.
ALDEFLUOR assay kit	Stem Cell Tech	1700	Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer.
ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB)	Stem Cell Tech	1705	Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining.
Andor iXon x3 CCD Camera	Oxford Instruments	-
Antibiotics and Antimycotics	Gibco	15240-062
APC-isotype IgG2b	Miltenyi biotec	130-092-217	Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies.
B27 Supplement	Gibco	17504044
basic Fibroblast Growth Factor	Stem Cell Technologies	78003.1
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes	Fisher Scientific	14-826-79
BioTek Synergy HT Microplate Reader	BioTek	7091000
CD133-APC	Miltenyi biotec	130-113-184	Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker.
cellSens Dimension Software	Olympus
Cisplatin	Sigma-Aldrich	P4394	Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA.
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen	D1306
Epidermal Growth Factor	Gibco	PHG0311
EVOS XL Core Cell Imaging System	Life Technologies	AME3300
Fetal Bovine Serum - premium (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F4375
Hemacytometer	Hausser Scientific	1490
Histogel	Thermo Scientific	HG-4000-012	Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining.
Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells	Lonza	PT-5006
Human Microvascular Endothelial Cells	Lonza	CC2543
Insulin-Transferrin-Selenium Supplement	Gibco	51500-056
Live/Dead viability kit	Invitrogen	L3224	Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1).
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140-050
MetaMorph 7.8 Software	Molecular Devices	-
Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope	Olympus	-
Olympus IX83 Research Inverted Microscope	Olympus
Parafilm M	Thomas Scientific	7315D35	Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange.
Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates	3D Biomatrix	HDP1384-8	Available through Sigma-Aldrich
phalloidin AlexaFluor488	Invitrogen	A12379	Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells.
ProJet 3500 HD Max	3D Systems	-	3D printer
Sterile DI water	Fisher Scientific	353046
Trypan Blue	Gibco	15250061	Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells.
VisiJet M3 Crystal	3D Systems	-	A biocompatible polymer material for 3D printing.
Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit	Yokogawa	-